Abstract
Proteiner av IQGAP familien skjermen komplisert og ofte motstridende aktiviteter i tumorigenesis. IQGAP1 har godt dokumentert onkogene potensial og IQGAP2 har antatte tumor-undertrykkende funksjon. IQGAP3 er det nyeste tilskuddet til denne familien og dens rolle i kreftutvikling gjenstår å bli definert. Her viser vi IQGAP3 uttrykk økes markert hos lungekreft vev både mRNA og proteinnivåer. Overekspresjon av IQGAP3 fremmet tumorcellevekst og migrasjon og invasjon, mens knockdown av IQGAP3 utstilt motsatte effekter. Videre undertrykkelse av IQGAP3 i en lungecancer cellelinje forårsaket en reduksjon i tumordannelse av disse cellene i lungevevet etter intravenøs injeksjon. Videre viste vi at IQGAP3 er i stand til å samhandle med ERK1 og styrke sin fosforylering etter behandling med EGF. Disse dataene antyder at IQGAP3 kan bidra til patogenesen av lungekreft ved å modulere EGFR-ERK signal
Citation. Yang Y, Zhao W, Xu QW, Wang XS, Zhang Y, Zhang J (2014) IQGAP3 Fremmer EGFR-ERK signalnettverk og vekst og metastasering av lungekreft celler. PLoS ONE 9 (5): e97578. doi: 10,1371 /journal.pone.0097578
Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children Hospital Medical Center, USA
mottatt: 20 februar 2014; Godkjent: 21 april 2014; Publisert: 21. mai 2014
Copyright: © 2014 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet fikk støtte fra National Basic Research Program of China (2011CB946103), National Foundation naturvitenskap of China (31330025 og 30830091), Beijing Municipal Natural Science Foundation (7.122.104) og 111 Prosjekt of China (B07001). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft rangerer først i kreftrelatert dødelighet både i Kina og resten av verden [1], [2]. I Kina er det ca 300 000 nye lungekreft tilfeller og mer enn 250.000 dødsfall fra denne sykdommen hvert år [3]. Histologisk så mange som 85% av lungekrefttilfellene er ikke-småcellet typen lungekreft (NSCLC), og de fleste av disse er enten adenokarsinom eller plateepitelkarsinom [4] – [7]. Som lungekreft kan være okkult, de fleste pasienter er ubrukelige og har metastaser til regionale lymfeknuter eller til fjerne steder på tidspunktet for diagnosen. NSCLC pasienter med fjernmetastaser overleve for en kort tid (fra 9 til 12 måneder) [5], [8]. Det er derfor et stort behov for å avdekke molekylære mekanismer som fører til invasjon og metastasering i lungekreft [9], [10]. Slik informasjon vil lette utviklingen av nye behandlingsformer slik forbedring av resultatet i lungekreftpasienter [11], [12].
terapeutiske tilnærminger mot EGF eller EGFR representerer en lovende retning for lungekreft behandling [13], [14]. EGFR er uttrykt i normale celler i epidermal, mesenchymale og nevrogen opprinnelse, og dens aktivering er strengt kontrollert i normalt vev [15], [16]. Imidlertid binding av EGFR ved dets ligand fører til reseptor-homo- eller heterodimerisering og aktivering av sin iboende tyrosinkinase-aktivitet [17]. Den nedstrøms signalkaskade er således initiert, til syvende og sist fører til endringer i slike celle atferd som proliferasjon, migrering og differensiering [15], [16]. Viktigere er konstitutiv aktivering av EGFR eller forsterket EGF signalering som ofte finnes i forskjellige typer kreft, spesielt kreft i lunge, hvor det er forbundet med kreft initiering, tumorvekst /progresjon, metastase og dårlig prognose [17] -. [20]
IQGAP familie av proteiner er godt bevart i organismer fra gjær til pattedyr [21]. Det består av tre medlemmer, IQGAP1, IQGAP2 og IQGAP3 [22] – [24]. Blant disse, er IQGAP1 best studerte [25]. Navnet IQGAP er avledet fra de flere funksjonelle domener disse molekylene havnen, for eksempel fire IQ motiver og en RasGAP relatert domene (GRD) [26], [27]. IQGAP1 inneholder også mulige spiral-spiral homodimerization domener, en tryptofan gjenta motiv (WW) med ukjent funksjon, en calponin-homologi domene (CHD) som samhandler med F-aktin, og en RasGAP_C-terminalen (RGCt) som samhandler med en rekke proteiner inkludert E-cadherin og β-catenin [27]. IQGAP1 er blitt foreslått for å fungere i regulering av cytoskjelettet og cellevandring [28] – [30]. Det er også bevis som indikerer IQGAP1 spiller en rolle i progresjon av kreft [31], [32]. I motsetning til dette synes IQGAP2 til å fungere som en tumor suppressor [33]. IQGAP3 er det nyeste tilskuddet til denne familien [24]. Data er for tiden tilgjengelig tyder på at det er involvert i spredning av epitel-celler [34], [35], men dens rolle i tumorgenese gjenstår å bli bestemt. I denne studien, gir vi den første bevis for at IQGAP3 fremmer lungekreft vekst og metastasering ved å styrke EGFR-medierte ERK signalering. IQGAP3 kan derfor spille en rolle lik som IQGAP1 i tumorigenesis.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble godkjent av etiske komiteer av Peking University Health Science center (Beijing, Kina) og 306th Sykehuset i Folkets frigjøringshær i Kina (Beijing, Kina). For dyrestudier, ble alle anstrengelser for å redusere lidelse og da observert lidelse var for stor, ble human avlivning brukt. Skriftlig samtykke ble innhentet fra den enkelte pasient for bruk av vevsprøver.
Cellelinjer og pasientprøver
A549 og Hela-celler ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (Life Technologies , Carlsbad, CA, USA). HEK293T-celler ble dyrket i DMEM medium supplementert med 10% føtalt bovint serum. Celler ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære.
For celle signalisering analysene ble celler serum fratatt (0,5% føtalt bovint serum) i 16 timer før stimulering med 100 ng /ml EGF (Peprotech, Rockville, NJ, USA) for ulike lengder tid som er angitt.
25 paret lunge svulstvev og tilstøtende prøvene normale vev ble hentet fra 306th Hospital i Folkets frigjøringshær i Kina.
Plasmider og Transfeksjon
Myc-pCAGGS-IQGAP3 og kontroll pCAGGS vektorer ble vennlig levert av Dr. Kozo Kaibuchi. HA-merket ERK1 eller ERK2 uttrykke vektorer ble konstruert ved standard molekylære teknikker og verifisert ved sekvensering.
Celler ble transfektert med jetPRIME transfeksjon reagens (Polyplus Transfeksjon, Illkirch, Frankrike).
siRNA Transfeksjon og lentiviral Infeksjon
Små interfererende RNA oligonukleotider (oligonukleotider) mot IQGAP3 eller kontroll siRNA oligonukleotider ble hentet fra GenePharma Co., Ltd (Shanghai, Kina). De rettet mot sekvenser av disse sirnas var som følger: si IQGAP3-1:5′- GAGCCAACCAGGACACUAA-3 «; Si IQGAP3-2:5»- GGCAGAAACUAGAAGCAUA-3 «; kontroll siRNA: 5’UUCUCCGAACGUGUCACGU-3 «. siRNA oligoer (50 nM) ble transfektert inn i A549 celler med jetPRIME transfeksjon reagens.
Alternativt siRNA target-sekvens ble klonet inn i vektoren lentiviral pLL3.7. Ved sekvens verifikasjon ble shRNA plasmid og emballasje vektorer psPAX2 og PLP /VSVG transfektert inn i emballasjen cellelinje HEK293T hjelp jetPRIME. Mediet ble forandret til 8 timer etter transfeksjon. 48 timer senere ble viral supernatant høstet og inkubert med A549-cellelinje i nærvær av 8 mikrogram /ml polybrene (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). For stabilt transfektert cellelinjevalg, ble GFP fluorescens anvendt som en markør sortering. Celler med . 75% infeksjon effektivitet ble brukt for videre analyse
revers transkriptase-PCR og Real-time PCR
TRIzol (Life Technologies) ble brukt til å isolere total RNA og deretter revers transkribert til cDNA ved revers transkripsjon System (Promega, Madison, WI, USA). Kvantitativ sanntids PCR ble utført på en Bio-Rad Real-Time PCR system. Sekvensene til de realtime primere for IQGAP3 var som følger: forover, 5′-GTTCATCCATAGAGCCTGCCA-3 «; omvendt, 5»-GCGATGCTCTCACCAATAAGG-3 «. De realtime primere for GAPDH har blitt beskrevet før [36]. Genekspresjon ble kvantifisert som utbyttet av IQGAP3 forhold til den for GAPDH.
Immunutfelling og Western blot-analyse
Myc-IQGAP3 og HA-ERK1 og ERK2 HA-konstruksjoner ble transfektert inn i HEK293T celler. Celler ble høstet og lysert i lyseringsbuffer med proteinase inhibitor cocktail (Roche, Basel, Sveits) og fenylmetylsulfonylfluorid. Deretter ble cellelysatene ble inkubert med muse-anti-HA-mAb (Sigma-Aldrich), anti-Myc mAb (Sigma-Aldrich) eller et kontrollantistoff (mIgG) (Sigma-Aldrich) og protein-A Sepharose (GE Healthcare, USA) og løses ved hjelp av SDS-PAGE. For endogen immunoprecipitation ble celle lysat fremstilt av A549 celler og immunopresipitert med kanin anti-ERK1 mAb (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA).
For western blot analyse, like mengder protein fra hver prøve ble lastet og løses med SDS-PAGE og overført til blotter. Etter blokking ble blotter analysert med angitte antistoffer og evaluert med Odyssey Imaging System (licor Bioscience, Lincoln, NE, USA). Antistoffer som brukes inkluderte anti-GAPDH (BioWorld Technology, Inc., St. Louis Park, MN, USA), anti-IQGAP3 (Sigma-Aldrich), anti-ERK (Cell Signaling, Beverly, MA, USA), anti-fosfor-Erk
Thr202 /Tyr204 (Cell Signaling), anti-fosfor-p38
Thr180 /Tyr182 (Cell Signaling), anti-fosfor-Akt
Ser473 (Cell Signaling), anti-myc, og anti-HA.
tissue microarray og Immunohistochemistry
En kreft vev microarray lunge (TMA) ble kjøpt fra Chaoying Bioteknologi Co (Xi’an, Kina). Seksjoner ble inkubert med anti-IQGAP3 antistoff (1:50 fortynning) over natten ved 4 ° C. Det primære antistoff ble identifisert ved hjelp av et pepperrot peroksydase enzym-merket polymeren konjugert til geite anti-muse-sekundært antistoff (Promega). De fargede delene ble anmeldt og scoret av en patolog. Den negative kontroll var normalt humant lungevev.
celleproliferasjonsanalyse
Celler ble sådd ut i 96-brønns plater ved en densitet på 3 x 10
3 celler /brønn. Celleproliferasjon ble evaluert hver 24 timer ved hjelp av celletelling Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Laboratories, Japan). Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer.
Cell migrasjon og invasjon analysen
Migrasjon ble utført i en 24-brønns Chemotaxis kammer (8-mikrometer porestørrelse, Corning Life Sciences, Corning, NY, USA) belagt med 10 pg /ml fibronektin (Sigma-Aldrich). Celler (3~5 x 10
4 celler /brønn) i 200 ul serumfritt RPMI 1640 ble podet inn i det øvre kammer. Deretter 600 ul RPMI 1640 med 10% føtalt bovint serum eller 100 ng /ml human EGF ble tilsatt i det nedre kammeret. Celler i det øvre kammer ble fjernet ved anvendelse av en bomullspinne etter 20 timers inkubering ved 37 ° C og 5% CO
2. Celler som er festet til bunnen av membranene ble fiksert med metanol og farget med krystallfiolett. Graden av migrering ble uttrykt som det gjennomsnittlige antall celler i seks 10 x felt.
Cell invasjons analyser ble utført i det vesentlige på samme måte som overføringsmetoden, bortsett fra at det øvre kammer var dekket med 30 ul Matrigel (0,5 mg /ml; BD Biosciences). Forsøk ble utført i tre eksemplarer.
luciferaserapportørplasmid analysen
The Elk-en transkripsjonen aktivitet ble målt med Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem (Promega). IQGAP3 siRNA eller NC siRNA var co-transfektert inn i A549 celler med plasmidene PFR-Luc (reporter plasmid), pFA2-Elk-1 (transaktivatorprotein plasmid) eller PRL-TK. Tjuefire timer senere ble cellene i serum-sultet i 16 timer, deretter stimulert med eller uten 100 ng /ml EGF i 6 timer. Celler ble høstet og lysert. Alle rapportør analyser ble gjentatt minst tre ganger i tre eksemplarer. Firefly luciferase og Renilla luciferase aktivitet ble målt med en Centro LB960 luminometer (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Tyskland). Ildflue luciferase-aktivitet ble beregnet og normalisert på grunnlag av Renilla luciferase-aktivitet. Luciferase aktivitet i kontroll siRNA-transfekterte celler uten EGF stimulering ble satt som 1.
metastase Analyse
in vivo
NOD /SCID mus ble kjøpt fra Vital River Forsøksdyr Technology Co Ltd (Beijing, Kina). Mus ble oppdratt i et patogen fritt anlegg ved Peking University Health Science Center (Beijing, Kina).
A549 celler ble infisert med kontroll shRNA eller shIQGAP3 lentiviruses. Celler (1,5 x 10
6) i 0,1 ml PBS ble injisert i halevenen til 6 uker gamle NOD /SCID-mus. Seks uker etter infeksjon ble musene avlivet ved cervikal dislokasjon. Deretter lungene ble fjernet, veid, fotografert, og fiksert i 4% formalin. Vevssnitt ble også farget med hematoksylin-eosin (H E). For histologisk vurdering
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS, versjon 13.0 (SPSS, Inc.). Den t-test ble brukt for å sammenligne celleproliferasjon, migrasjon og invasjon mellom to uavhengige grupper. The Chi-kvadrat test ble utført for å bestemme forskjeller i pasientens alder, kjønn, tumorstadium og histologi blant grupper med høyere, lik eller lavere IQGAP3 uttrykk i tumor mot tilstøtende ikke-kreft vev.
P
verdier 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
IQGAP3 Expression er oppregulert i Lung Cancer Tissue
En potensiell rolle i tumorigenesis var først. foreslått for IQGAP3 av bioinformatiske analyser av IQGAP3 uttrykk i svulstvev. ECgene (https://genome.ewha.ac.kr/ECgene/) viste forhøyede nivåer av IQGAP3 i en rekke tumor vev eller celler av opprinnelse i eggstokken, lunge, tykktarm, mage, benmarg og bryst (figur 1A ). RT-PCR ble deretter utført for å bekrefte disse dataene. Mens IQGAP3 ekspresjon i normalt vev var begrenset til tykktarmen, tynntarmen og testis, ble det observert høye nivåer av IQGAP3 mRNA i en rekke tumorer, inkludert lungekreft, leverkreft, nyrekreft, magekreft, blærekreft, tykktarmskreft og leukemi ( data ikke vist). Videre har vi så produksjon av autoantistoffer mot IQGAP3 i en signifikant andel av pasienter med IQGAP3-positiv lunge-kreft [37]. Dette fikk oss til å ytterligere undersøke aktiviteten til dette molekylet i lungekreft utvikling. IQGAP3 ble oppregulert på mRNA nivå i 20 lungekreft vev i forhold til tilstøtende ikke-kreft vev i 25 parvise prøver med real-time PCR-analyse (figur 1B). Vi neste undersøkt IQGAP3 protein uttrykk i en vev array som inneholder 89 sammenkoblede lungekreft vev. Forhøyede nivåer av IQGAP3 protein ble observert i 80 kreft vev (figur 1C og tabell S1). Av notatet, statistisk analyse viste at det var ingen signifikant sammenheng mellom IQGAP3 protein oppregulering og parametere som alder, kjønn eller histologisk grad (tabell S1).
(A) EST uttrykk analyse av IQGAP3 genet i normal og cancervev basert på den ECgene databasen. (B) Kvantitativ real-time PCR for IQGAP3 uttrykk i 25 parene av lungekreft versus tilstøtende ikke-kreft vev. IQGAP3 uttrykk ble normalisert mot GAPDH. Relative nivåer ble beregnet for hver prøve, og en verdi på 1 ble tildelt for tilstøtende ikke-kreftvev av pasientens 13. Forsøk ble gjentatt i triplikat. Data fra en representative forsøk er presentert som gjennomsnitt ± SD. (C) Immunhistokjemisk analyse av IQGAP3 protein ekspresjon i lungekreft versus hosliggende ikke-cancervev. Representative bilder vises for en plateepitelkarsinom og adenokarsinom. Ca, kreft vev; Adj, tilstøtende ikke-cancervev. Forstørrelse, × 200.
Endring av IQGAP3 Expression modulerer vekst, migrasjon og invasjon av tumorceller
For å undersøke den funksjonelle konsekvensen av oppregulert IQGAP3 uttrykk i kreft, overvåket vi endringer i celle oppførsel følgende endring av dets ekspresjon nivå i kreftcellelinjer. IQGAP3 ble først overexpressed i Hela-celler, som hadde et relativt lavt nivå av endogen IQGAP3 uttrykk. Overekspresjon av IQGAP3 fremmes celleproliferasjon i disse celler (figur 2A). I tillegg, ekspresjon av tvungen IQGAP3 resulterte i forbedret cellemigrering og invasjon (figur 2B, C).
Myc-IQGAP3 eller kontroll vektorene ble transfektert inn i HeLa-celler og deretter ble cellene høstet ved 24 timer etter transfeksjon for migrering og invasjon assay. Celler for proliferasjonsanalyse ble høstet ved angitt tidspunkt. (A) IQGAP3 protein ekspresjon av transfektanter ble bekreftet ved Western blotting. Celleproliferasjon ble analysert ved hjelp av celletelling Kit-8. (B, C) cellemigrering og invasjons analyser ble utført ved bruk av kjemotaksis kamre med eller uten belegg med Matrigel. Hvert forsøk ble gjentatt minst 3 ganger. Data fra en representative forsøk er presentert som gjennomsnitt ± SD. *,
P
0,05; ***,
P
. 0,001
For å evaluere effekten av IQGAP3 på kreftcellevekst og migrasjon videre, ble IQGAP3 uttrykk slått ned i lungekreft cellelinje A549 , som hadde et relativt høyt nivå av ekspresjon av endogen IQGAP3. To shRNA konstruerer rettet mot forskjellige IQGAP3 sekvenser ble anvendt, som begge førte til effektiv nedregulering av IQGAP3 i forhold til ikke-spesifikke kontroller (figur 3A). Som forventet, knockdown av IQGAP3 trykkes spredning av A549 celler (Figur 3B). Videre reduserte IQGAP3-ekspresjon ble også ledsaget av redusert migrering og invasjon i A549-celler (figur 3C, D). Det er velkjent at EGFR-signalering er kritisk involvert i lungekreft utvikling. Vi har derfor testet videre om IQGAP3 uttrykk kan modulere celle følsomhet for EGF stimulans. Som vist i figurene 3E og F, knockdown av IQGAP3 forårsaket inhibering av cellemigrering og invasjon lik den som er indusert av EGF. Samlet utgjør disse dataene antyder IQGAP3 har onkogene potensiale.
A549 celler ble transfektert med shRNA konstruerer til knockdown endogen IQGAP3 uttrykk. (A) IQGAP3 protein nivåer etter infeksjon med kontroll (NC) eller to ulike shIQGAP3 lentiviruses (KD1 og KD2). (B) sprednings ble analysert ved hjelp av Cell Telle Kit-8 for lentivirus-infiserte A549 celler. (C, E) Migrering av lentivirus-infiserte A549 celler i kjemotakse kammeret analysen i fravær (C) eller nærvær (E) av human EGF (100 ng /ml). (D, F) invasjon av lentivirus-infiserte A549-celler på tvers av Matrigel i fravær (D) eller nærvær (F) av human EGF. Hvert forsøk ble gjentatt minst 3 ganger. Data fra en representative forsøk er presentert som gjennomsnitt ± SD. *,
P
0,05; **
P
0,01; ***,
P
. 0,001
knockdown av IQGAP3 Trykt Lung Cancer Metastase
i lys av den potente effekten av IQGAP3 uttrykk på spredning og migrering av kreftceller dyrket
in vitro
, ved siden søkte vi å finne ut om det også påvirket tumorigenesis
in vivo
å bruke en etablert modell for metastatisk lungekreft [38], [39]. A549 celler som inneholder et lentiviral vektor som uttrykker IQGAP3-spesifikk shRNA ble injisert inn i halevenen av NOD /SCID-mus. Dyrene ble avlivet på dag 42, og lungene ble fjernet og analysert. Sammenlignet med mock kontrollene, IQGAP3 knockdown celler syntes å være mindre tumorigent
in vivo
, som foreslått av sterkt redusert bulk og vekten av de berørte lungene (figur 4A, B). Immunohistokjemisk farging viste at forholdsvis normal lunge struktur ble opprettholdt i de IQGAP3 knockdown-grupper, mens det ble nesten fullstendig ødelagt ved de mange tumorknuter i mock-kontroll (figur 4C). Tar de relaterte
in vitro
data i betraktning, redusert tumorigent potensialet IQGAP3 knockdown celler
in vivo
kan skyldes enten svekket kolonisering eller spredning eller begge deler.
NOD /SCID-mus mottok en intravenøs injeksjon av 1,5 x 10
6 A549-celler stabilt transfektert med shIQGAP3 (IQGAP3-KD2) eller kontroll-vektorer (NC), og ble avlivet på dag 42 etter tumor-inokulering (n = 7 for hver gruppe). (A) Brutto utseende av lungevevet. (B) Lung vekt. De horisontale og feilSøylene viser gjennomsnittsvekten og standardavvik. (C) H 0,01
IQGAP3 samhandler med ERK1
Som spådd av Scansite (https://scansite.mit.edu/), IQGAP3 inneholder flere ERK-D-domener, som er kjent til å mediere interaksjon med ERK familiemedlemmer. For å utforske denne muligheten, transfektert vi HEK293T celler med Myc-IQGAP3 og HA-ERK1 eller HA-ERK2 konstruksjoner. Cellelysat ble fremstilt og immunopresipitert med anti-HA eller anti-myc antistoff. Det resulterende bunnfall ble gjensidige påvist med anti-myc eller anti-HA. Det var av spesiell interesse at immunoprecipitation av IQGAP3 ble observert med ERK1, men ikke med ERK2 (figur 5A). Videre forsøkte vi å bestemme hvorvidt en lignende interaksjon finner sted mellom endogent uttrykte proteiner. Cellelysat fra A549-celler ble immunopresipitert med kanin anti-ERK1 mAb og IQGAP3 ble faktisk påvist i bunnfallet med anti-IQGAP3 antistoff (figur 5B). Disse resultatene indikerer at IQGAP3 kan samhandle med ERK1, enten direkte eller indirekte gjennom et større kompleks.
(A) Myc-IQGAP3 og HA-ERK1 og ERK2 HA-konstruksjoner ble transfektert inn i HEK293T celler. Cellelysat ble utarbeidet og immunopresipitert med mus anti-HA mAb, anti-Myc mAb eller kontroll antistoffer (mIgG). Det resulterende bunnfall, sammen med den ubearbeidede lysat (Input) ble oppløst på SDS-PAGE, overført på blotter og probet med anti-myc og anti-HA. (B) Samspill IQGAP3 med ERK1 ble også undersøkt i A549 celler med endogent uttrykte proteiner. Cellelysat ble fremstilt fra A549-celler og immunopresipitert med kanin anti-ERK1 mAb. Tilstedeværelsen av IQGAP3 i utfellingen ble evaluert anti-IQGAP3 antistoffer. Alle forsøkene ble gjentas minst tre ganger og resultater fra en representant eksperimentet er vist.
IQGAP3 Fremmer EGF Induced ERK Fosforylering
Samspillet mellom IQGAP3 og ERK1 bedt om ytterligere gransking av innflytelse av IQGAP3 på ERK-aktivering og signalering. Overekspresjon av IQGAP3 i HeLa-celler hadde minimal effekt på fosforylering av ERK, i motsetning til hva som er blitt rapportert for IQGAP1 [40]. Når de ble stimulert med EGF, men de IQGAP3 transfektantene viste sterkt forbedret ERK-fosforylering i forhold til den mock-kontroll (figur 6A). AKT og p38-aktivering på den annen side ble ikke endret (data ikke vist). I samsvar med disse funnene, knockdown av IQGAP3 uttrykk i A549 celler resulterte i demping av EGF-indusert ERK fosforylering, mens AKT og p38 fosforylering ikke ble påvirket (figur 6B). Videre har doble luciferase reporter-analyser viste at knockdown av IQGAP3 inhiberer transkripsjonen aktivitet av Elk1 som er et kjennetegn på ERK-aktivering i EGF-stimulerte A549-celler (Figur 6C). For å evaluere den potensielle sammenheng mellom økt ERK signalering og akselerert proliferasjon av IQGAP3-transfekterte celler, U0126 som er et MEK1 /2-inhibitor ble satt til kulturen. Som vist i figur 6D, hemning av ERK-aktivering avskaffet spredning fremmende virkning av IQGAP3. Disse resultatene støtter ideen om at onkogene aktiviteten til IQGAP3 blir sannsynligvis formidlet ved forbedret ERK-signalisering.
(A) HeLa-celler transient transfektert med Myc-IQGAP3 eller kontroll-vektor (mock) ble fratatt serum (0,5% føtalt bovint serum ) i 24 timer før de ble stimulert med 100 ng /ml EGF. Cellene ble høstet ved ulike tidspunkt og undersøkt for ERK-fosforylering. (B) A549-celler ble infisert med lentivirus shIQGAP3 (IQGAP3-KD1 eller KD2) eller kontrollvirus (NC) og serum berøvet (0,5% føtalt bovint serum) før stimulering med 100 ng /ml EGF. Nivåer av fosforylert ERK, total ERK, fosforylert p38 og fosforylert AKT ble evaluert med western blot på ulike tidspunkter etter EGF stimulering. (C) luciferase reporter-analyser ble utført for å måle Elk1 aktivitet nedstrøms av kaskade av EGFR-signalisering i ERK A549-celler transfektert med siRNA oligoer. (D) Spredning av Hela celler som IQGAP3-uttrykker eller kontroll vektorer ble analysert ved hjelp av Cell Counting Kit-8 med tillegg av 20 mikrometer U0126 eller DMSO. Hvert forsøk ble gjentatt minst 3 ganger. Dataene fra en representative forsøk er presentert som gjennomsnitt ± SD. *,
P
0,05; **
P
0,01
Diskusjoner
Til dags dato, tre medlemmer av IQGAP familien har blitt beskrevet [22] – [24].. Det er dokumentert at IQGAP1 primært fungerer som et oncogen [27]. IQGAP2 viser anti-tumor aktivitet, til tross for dens strukturelle likheter med IQGAP1 [33]. Her viste vi at IQGAP3 er sterkt uttrykt i en stor andel av lungekreft prøver. Selv om håndheves ekspresjon av IQGAP3 forårsaker akselerert proliferasjon og migrering /invasjon av kreft celler, undertrykkelse av dets ekspresjon fører til en reduksjon i tumorigen potensial. På molekylært nivå, samvirker IQGAP3 med ERK1 og fremmer EGF-indusert aktivering av ERK, som i sin tur synes å være nært forbundet med sin tumor-fremmende aktivitet.
IQGAP3 ligger ved 1q21.3, som er et hotspot for genamplifisering i kreft [24]. DNA forsterkning på 1q21.3 har for eksempel blitt rapportert å være knyttet til gastroøsofageal karsinom og infiltrere duktalt karsinom i brystet [41], [42]. I tillegg gevinster på 1q21.3 har en signifikant sammenheng med redusert total overlevelse tid i leiomyosarcoma av livmor [43]. Bioinformatikk analyser viser at IQGAP3 er oppregulert i flere typer kreft, inkludert eggstokk, lunge, tykktarm, mage, benmarg og bryst maligniteter (Figur 1a). Den aktuelle studien spesielt adressert sin rolle i lungekreft. Blant 25 parene av lungekreft og tilstøtende ikke-cancervev, 20 kreftvev viste en økning i IQGAP3 mRNA. Oppregulering av IQGAP3 ekspresjon ble bekreftet på proteinnivået ved fremvisning av sterkere immunhistokjemisk farging i cancer enn i ikke-cancervev i 80 ut av 89 lungekreft prøver. Vi spekulerer i at IQGAP3 kan representere et viktig gen som er kritisk involvert i kreftformer preget av 1q21.3 forsterkning. Det ville være interessant å finne ut om 1q21.3 forsterkning bidrar til oppregulering av IQGAP3 som er funnet i lungekreft, og om 1q21.3 forsterkning observert i gastroøsofageal karsinom eller brystkreft er assosiert med økt IQGAP3 uttrykk. Selv om det i vår studie, viser vi at upreguation av IQGAP3 er en vanlig hendelse i lungekreft, bør vi nevne at det er noen få lungekreft prøver som viser uendret eller redusert uttrykk for IQGAP3. Dette er ikke overraskende. For eksempel, Her2, den representerer onkogenet i brystkreft, er bare oppregulert i omtrent 20% brystkreft [44], [45]. Noen gener, slik som p16, som kan bli oppregulert eller nedregulert i tumorer og virker som enten en tumor suppressor eller et onkogen avhengig av sammenhengen av kroppen [46]. Derfor, om de forskjellige uttrykk mønster av IQGAP3 antyder en mer forvirre regulering og funksjon av IQGAP3 i tumorutviklingsbehov videre studier.
Den feilregulering av uttrykk for IQGAP3 i kreftvev antyder en mulig rolle for dette molekylet i tumorigenesis. I samsvar med dette konseptet, overekspresjon av IQGAP3 forbedret tumorcellevekst, migrasjon og invasjon, mens knockdown av IQGAP3 uttrykk vises motsatte effekter. IQGAP3 er derfor funksjonelt lik IQGAP1, som er kjent for å ha onkogene potensial [31], [32]. I likhet med andre medlemmer av IQGAP familien, besitter IQGAP3 strukturelle motiver som kan binde ERK. Ved gjensidig coimmunoprecipitation, bekreftet vi samspillet mellom IQGAP3 og ERK1. Den funksjonelle relevansen av denne interaksjonen er støttet av utvidet fosforylering av ERK og økt Elk1 transkripsjonen aktivitet på EGF stimulering i IQGAP3-transfekterte celler. Enda viktigere, spredning fremmende effekten ble nesten fullstendig avskaffet ved ERK signal hemmeren U0126, noe som indikerer at IQGAP3 utøver sin funksjon hovedsakelig ved regulering av ERK signalering. Det er interessant å merke seg at til tross for deres funksjonelle likheten, IQGAP3 og IQGAP1 vise distinkt forskjellige særegenheter for binding partnere. Mens IQGAP1 binder primært til ERK2, samhandler IQGAP3 utelukkende med ERK1 [40]. Betydningen av en slik selektivitet gjenstår å fastslå, men vi spekulere at IQGAP1 og IQGAP3 kan samvirke i reguleringen av ERK signalering, for derved å utøve en synergistisk effekt på tumorprogresjon.
intravenøs inokulering av nakne mus har blitt mye brukt for å vurdere metastatisk potensial av kreftceller [38], [39]. Ved å bruke denne modellen, knockdown av IQGAP3 i lungekreftceller ble funnet å sterkt svekke dens evne til å generere metastatiske lesjoner i lungen. Dette resultatet er i tråd med vår
in vitro
data som viser endret celle migrasjon og invasjon etter manipulering av IQGAP3 uttrykk. Men de spesifikke detaljer om disse mekanismene fortsatt uklare. Konfokalmikroskopi avslørte at IQGAP3 er beriket i forkant av trekkende celler (Figur S1), noe som tyder på en mulig involvering i dannelsen av kanter. I tillegg genekspresjon profilering viste en økt nivå av E-cadherin i IQGAP3 knockdown celler (Figur S2). Det er velkjent at E-cadherin er svært viktig for celle adhesjon. Nedregulering av den sammen med sin tilhørende catenin komplekset samtidig med redusert intercellulær adhesjon og forbedret invasiv kapasitet [47], [48]. Som sådan kan IQGAP3 lette cellemigrasjon og invasjon dels gjennom undertrykkelse av E-cadherin uttrykk.
I sammendraget, våre studier avslører for første gang involvering av IQGAP3 i lungekreft utvikling og de potensielle molekylære mekanismene bak sin tumorfremmende aktivitet. Disse funnene utvide vår kunnskap om kompliserte rolle IQGAP familien i tumorigenesis. Videre gransking av potensialet i disse molekylene som mål for terapeutisk oppfinnelse er berettiget.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
IQGAP3 ble beriket i forkant av trekkende celler. A549-celler ble plassert på dekkglass belagt med 10 pg /ml fibronektin (Sigma-Aldrich).
