Abstract
Bakgrunn
Normal vev homeostase blir vedlikeholdt av dynamiske samspillet mellom epitelceller og deres mikromiljøet. Forstyrre dette homeostase kan indusere avvikende celleproliferasjon, adhesjon, funksjon og migrasjon som kan fremme ondartet atferd. Faktisk avvik stromal-epitelial interaksjoner bidra til bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom (PDAC) spredning og metastasering, og dette øker muligheten for at nye stroma-målrettet terapi representerer flere tilnærminger for å bekjempe denne ondartede sykdommen. Målet med denne studien var å fastslå effekten av menneskelige stromale celler avledet fra fettvev (ADSC) på bukspyttkjertelen tumor celleproliferasjon.
hovedfunnene
Co-dyrking bukspyttkjertelen kreftceller med ADSC og ADSC kondisjonerte medium samplet fra forskjellige givere hemmet kreft celle levedyktighet og spredning. ADSC-mediert inhiberende effekt ble ytterligere utvidet til andre epiteliale kreftcellelinjer utvunnet (lever, tykktarm, prostata). ADSC kondisjonert medium induced kreftcelle nekrose etter G1-fasen arrest, uten tegn på apoptose.
In vivo
, en enkelt intratumor injeksjon av ADSC i en modell av bukspyttkjertelen adenokarsinom indusert en sterk og langvarig hemming av tumorvekst.
Konklusjon
Disse data indikerer at ADSC sterkt hemme PDAC spredning, både
in vitro Hotell og
in vivo Hotell og indusere tumor celledød ved å endre cellesyklusprogresjon. Derfor kan ADSC utgjøre en potensiell cellebasert terapeutisk alternativ for behandling av PDAC som ingen effektiv kur er tilgjengelig
relasjon:. Cousin B, E Ravet, Poglio S, De Toni F, Bertuzzi M, Lulka H, et al. (2009) Voksen stromal celler avledet fra humant fettvev Provoke Bukspyttkjertelkreft celledød både
In Vitro Hotell og
In Vivo
. PLoS ONE 4 (7): e6278. doi: 10,1371 /journal.pone.0006278
Redaktør: Irene Oi-Lin Ng, The University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 24 februar 2009; Godkjent: 31 mai 2009; Publisert: 17.07.2009
Copyright: © 2009 Cousin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet har blitt støttet med tilskudd fra regionen Midi-Pyrénées, Ligue Nationale Contre le Cancer og Cancrople Grand Sud-Ouest (EMERGEANCE). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Normal vev homeostase blir vedlikeholdt av dynamiske samspillet mellom epitelceller og deres mikromiljø. Mikromiljøet består av ekstracellulær matriks, stromaceller, trekkende immunceller og nevrale elementer støttes av et vaskulært nettverk, alle innenfor et miljø av cytokiner og vekstfaktorer. -Celler reagerer med mikromiljøet via komplekse autokrine og parakrine mekanismer. Flere bevis viser at forstyrre denne homeostase kan indusere avvikende celleproliferasjon, adhesjon, migrasjon og funksjon som kan fremme malign oppførsel [1] – [3]. Nyere studier har endret oppfatningen av stromale celler som omgir epiteliale tumorer. Disse cellene er ikke idle tilskuere, men heller aktive deltakere som former frekvens og funksjoner av svulster. I tillegg kreftceller selv kan endre sin tilknytning stroma å danne en ettergivende og støttende miljø for tumorprogresjon [1] – [3].
Kreft stamceller og stromale fibroblaster er mye demonstrert til støtte neoplastisk prosess [4 ] – [11], da benmargs avledet mesenchymale stamceller (BM-MSC) indirekte favorisere tumorvekst etter systemisk immunsuppresjon [12], eller produksjon av pro-angiogene cytokiner [13] – [15]. Men effekten av BM-MSC på tumor spredning varierer i henhold til tumortype: BM-MSC fremme bryst, melanom og tykktarmskreft avledet celler spredning [16], [17], da hemme
in vivo
vekst av Kaposis sarkom-celler [18]. Fettvev, som benmarg, inneholder stromale celler som kalles ADSCs for adipose-deriverte stromale celler. Denne populasjonen deler mange av de samme egenskapene av BM-MSC, inkludert immunmodulerende effekter [19], og multilineage differensiering potensialer [20] – [29]. Når injisert
in vivo
, ADSCs vise regenererende egenskaper, enten ved direkte deltakelse i nydannede vev og /eller via produksjon av vekstfaktorer som opprettholder denne regenerering [23], [25], [30]. Selv om det stromale celler fra benmarg og fettvev ser ut til å være nært beslektet, ble betydelige forskjeller rapportert [19], [31] – [34]. Evnen til ADSCs til å støtte normal og tumorcelle-proliferasjon er i stor grad diskutert.
In vitro
, utvidet ADSCs mediert hemming av allogene lymfocyttproliferasjon [35]. Motstridende resultater ble oppnådd
in vivo
, ved samtidig injeksjon av ADSCs med bryst, tykktarm, prostata, ikke-småcellet eller glioblastom kreft-avledet celler førte til innledende tumorvekst støtte [36] – [38]. For å klargjøre et slikt avvik, studerte vi effekten av ADSCs på pankreas ductal adenokarsinom-avledede celler. Blant solide tumorer, er pancreatic ductal adenokarsinom (PDAC) kjennetegnes av sin ekstremt tett desmoplastic infiltrasjon [39], [40]. PDAC er en svært aggressiv sykdom uten terapeutisk løsning, og fortsatt den femte største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i vestlige land [41]. Fordi avvik stromal-epitelial interaksjoner bidra til PDAC spredning og metastasering, hypoteser vi at målretting svulsten stroma kan representere en ytterligere tilnærming til behandling av PDAC. Her viser vi muligheten for menneskelige ADSCs (hADSCs) for å redusere PDAC-avledet kreftceller vekst,
in vitro
og
in vivo
, og for å indusere cancercelledød følgende G1-fase rest .
Resultater
menneske~~POS=TRUNC ADSCs utøve en hemmende effekt på PDAC-avledede cellelinjer
Først ble hADSC fenotype bestemt ved flowcytometri (Supplerende tekst S1) for å bekrefte at cellene som brukes vist fenotypiske egenskaper vanligvis er beskrevet for ADSCs [22], [23]. Faktisk, FACS analyser bekreftet at ADSC var CD34, CD90, CD73 og HLA ABC positiv mens CD45 og CD31 negative (Supplementary figur S1). Vi er fast bestemt på
in vitro
effekten av hADSCs på PDAC tumorcellevekst. Vi dyrket PDAC-avledet CAPAN-1-celler i nærvær av ADSCs isolert fra 25 forskjellige friske donorer ved hjelp av Transwell-membraner for å forhindre celle-til-celle-kontakt. Etter 48 timer med ko-kulturer, oppviste ADSC en potent doseavhengige inhiberende virkning på PDAC-avledede cellenummer, som vist i figur 1A. Faktisk antallet kreft i bukspyttkjertelen celler ble signifikant redusert med 36,5% ± 4,8% i nærvær av 01:01 forholdet av ADSCs, sammenlignet med kontrollen.
A. Økende forhold mellom ADSC og CAPAN-1-celler ble ko-dyrket i nærvær av transwell i 48 timer i fullstendig vekstmedium. CAPAN-1-celler proliferasjon ble deretter kvantifisert ved celletelling. Verdier er gjennomsnitt ± bred singlett. av tre separate eksperimenter med ADSCs fra forskjellige givere. B. Kreftceller fra forskjellig opprinnelse ble dyrket i nærvær av ADSC kondisjonert medium (CM) i 48 timer. Celleviabilitet ble konstatert ved MTS hjelp av CellTiter 96® vandige løsning Cell Proliferation analysen. Resultatene er uttrykt som prosent av verdier oppnådd i kontrolldyr forhold. Verdier er gjennomsnitt ± bred singlett. av tre separate eksperimenter utført med ADSC-CM fra forskjellige givere. C. CAPAN-1-celler ble dyrket i 48 timer med CAPAN-1, BM-MSC eller ADSC-CM. CAPAN-en celle nummer ble kvantifisert som i A. Verdiene er midler ± bred singlett. av tre separate eksperimenter med ADSCs og MSC fra forskjellige givere. *: P 0,05. ***; p. 0,001
Kondisjonert medium fra ADSCs hemmer levedyktighet av mange kreftceller
Fraværet av direkte celle-til-celle kontakt i vår eksperimentelle innstillingen bedt oss om å teste om ADSCs -conditioned medium (CM) kan også svekke kreftcellen levedyktighet. Faktisk har løselige faktorer er tidligere vist å formidle det immunsuppressive effekten av menneskelig ADSCs [19]. Som vist i figur 1B, ADSC-CM i seg selv en betydelig hemmet ikke bare levedyktigheten av flere pankreas adenokarsinom-avledede celler (CAPAN-1, CAPAN-2, BxPC3, Miapaca-2), men også levedyktigheten til hepatokarsinom-avledede celler ( HuH7, HepG2), av kolon-kreft-avledede celler (Caco-2), og av prostatakreft-cellelinje (PC3). I motsetning til dette, ADSC kultursupernatanten hadde liten, om noen, effekt på HeLa-celler avledet fra livmorhalskreft eller MCF-7, en brystkreft-cellelinje. Fordi de observerte responser kan reflektere utarming av næringsstoffer fra media og /eller ikke-spesifikk akkumulering av toksiske metabolitter, anvendte vi kondisjonert medium fra kreftceller alene som en kontroll, sammen med BM-MSC-CM. I motsetning til ADSC-CM, å behandle kreftceller med enten CAPAN-1 eller BM-MSC-CM svekket ikke signifikant kreftcellelevedyktighet selv en tendens til reduksjon ble observert med den siste (figur 1C).
ADSC kondisjonerte medium hemmer tumor celleproliferasjon og induserer tumor celledød
for å analysere potensielle effekten av ADSC-CM på kreftcelle spredning, CAPAN-en ble inkubert i nærvær av BrdU med eller uten ADSC-CM. FACS-analyse ble utført etter celle denaturering og inkubasjon med propidiumjodid. BrdU er innlemmet i S-fasen (gate P4) mens farging med propidiumjodid tillater diskriminering mellom 2n (G0 /G1, gate P2) og 4n (G2 /M, gate P3) kromosomer (Figur 2A). Prikkplott gating på enkeltceller viste at antall CAPAN-1 celler i G0 /G1 fase tendens til å øke når celler i S-fasen betydelig redusert med 10% i nærvær av ADSC-CM (figur 2B).
A. CAPAN-1-celler ble dyrket med eller uten ADSCs kondisjonert medium ble tilsatt. 48 timer senere ble spredning og DNA innhold analysert ved flowcytometri hjelp BrdU innlemmelse og propidiumjodid som beskrevet i Materiale og metode. Prikkplott er representativ for 3 uavhengige eksperimenter utført med ADSCs samplet fra forskjellige givere. B. Kvantifisering av cellesyklus-analyse ved hjelp ModFit programvare. CAPAN dyrket i kontroll forholdene var representert i svarte striper i kontrast til CAPAN behandlet med ADSC-CM representert i åpne barer. Verdier er gjennomsnitt ± bred singlett. av tre separate eksperimenter med ADSCs fra forskjellige givere. C. CAPAN-1-celler ble sådd ut i fire-kammers objektglass i 48 timer med eller uten ADSC-CM. DNA-fragmentering ble målt ved TUNEL (representative for tre separate eksperimenter). D. CAPAN-en kultivert kontroll mellom (svarte søyler) eller behandlet med ADSC supernatanter (åpne søyler) ble analysert for Annexin og propidiumjodid- merking som beskrevet i Materiale og metode. Verdier er gjennomsnitt ± bred singlett. av tre separate eksperimenter med ADSCs fra forskjellige givere. ***: P 0,001
neste avgjøre om ADSC-CM kan påvirke celledød.. For å oppnå dette, må vi først overvåket DNA-fragmentering i CAPAN-1-celler ved TUNEL assay. Som vist i figur 2C, ble PDAC-avledet celle DNA-fragmentering sterkt indusert av ADSC-CM. Vi neste kvantifisert antall kreftceller inn apoptose og /eller nekrotisk etter eksponering for ADSC-CM. Resultatene presentert figur 2D viser at ADSC-CM induserte en 3-dobling i propidiumjodid–positive, nekrotiske celler, uten tegn på tidlig apoptose overvåket av annexin merking. Igjen CM fra BM-MSC var ineffektiv i å endre signifikant tumorcellelevedyktighet (data ikke vist).
tumor celledød indusert ved ADSC kondisjonert medium medieres ved inhibering av cellesyklusprogresjon
neste undersøkte mekanismen som tumorcellesyklus blir arrestert av ADSC-CM. Vi målte ekspresjon av hoved proteiner involvert i cellesyklusregulering. Vi fant at ADSC-CM induserte en betydelig hemming av Rb-fosforyleringen i CAPAN-1-celler, med ingen effekt på proteinet uttrykket (figur 3A, 3B). Merkbart ekspresjon av CDK4 og syklin D1, som er kritiske for Rb-fosforylering, redusert samtidig. Ekspresjon av Cyclin E, som ikke er involvert i den G1-S-overgang, forble uforandret (figur 3A, 3B). Av betydning, ble ingen forandringer funnet i uttrykket nivåer av spaltet caspase-3, caspase-8, caspase-9, caspase-6, caspase-7 og PARP etter behandling av cellene med ADSC-CM (data ikke vist). Også uttrykket nivåer av cytokrom C, BclXl og BCL2 forble relativt uendret i våre eksperimentelle innstillinger (data ikke vist).
A. CAPAN-1-celler ble dyrket med eller uten ADSC-CMfor 48 timer. Proteiner ble deretter ekstrahert og utsatt for immunblotting for de angitte proteiner som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultatene er representative for minst 3 uavhengige eksperimenter. B. Kvantifisering av immunoblot densitometry i kontrollkulturer (svarte søyler) eller kulturer behandlet med ADSC-CM (åpne søyler). Verdier er gjennomsnitt ± bred singlett. av tre separate eksperimenter med ADSCs fra forskjellige givere. *: P 0,05; **: P 0,01
ADSCs redusere
in vivo
vekst av menneskelige pankreastumorer
neste utvidede ADSCs antiproliferative aktiviteter til hemming av bukspyttkjertelsvulster.
in vivo
. Dermed ble humane PDAC svulster etablert i atymiske mus etter subkutan injeksjon av CAPAN-1 celler som en svært aggressiv modell av PDAC [42], [43]. Fjorten til sytten dager etter tumor engraftment, en enkelt dose av ADSCs, tilsvarende 10
3 ADSCs /mm
3 tumor ble overført
in vivo
inn voksende svulster. Kontroll tumorer ble injisert enten med bærer eller med paraformaldehyd (PFA) som er festet ADSCs. Kontroll svulster vokste raskt, i snitt 4076 ± 556 mm
3 i størrelse etter 28 dager etter utsetting (figur 4A, 4B). I motsetning til vekst av CAPAN-1 tumorer fikk ADSC injeksjon ble sterkt inhibert (2556 ± 232 mm
3, figur 4A, 4B). Hemming av bukspyttkjerteltumorvekst progresjon nådd -58% ± 8,9% (p 0,001), to uker etter en enkelt intratumoral injeksjon av ADSCs (figur 4C). Tumor vekt ble også betydelig redusert etter ADSCs implantasjon (kontroll: 4,6 g ± 0,8 vs ADSCs-behandlet 2,2 g ± 0,2, p 0,05). Som vist på figur 4D, vekst av tumorer injisert med enten bærer eller PFA-behandlede ADSCs var sammenlignbare, hvilket viser at inhiberingen av tumorveksten var ikke på grunn av en uspesifikk virkning av tumor dilacerations og avhengig av ADSC sekresjon, respektivt.
CAPAN-en svulster ble implantert i atymiske nakne mus (fire til seks dyr per gruppe) som beskrevet i Materiale og metode. To uker senere ADSC ble injisert i tumoren, og progresjon ble deretter overvåket. A. Representant resected svulster fra atymiske nakne mus 15 dager etter å ha mottatt ingen behandling (venstre) eller en enkelt intratumoral dose på 5 × 10
5 ADSCs (til høyre). B. Volumet av kontroll (svarte symboler) eller ADSC behandlet (åpne symboler) svulster ble overvåket hver 2 dager, opp til 28 dager etter implantasjon (13 dager etter ADSCs injeksjon). C. Andel av kontroll (svarte striper) eller ADSC behandlet (åpne søyler) tumorprogresjon ble målt på den tiden indisert etter
in vivo
ADSCs injeksjon. D. Svulster ble injisert enten med bil, PFA faste ADSCs eller ADSCs og deres progresjon ble målt 6 dager etter intratumoral celle levering. E. Histologiske deler av pankreastumorer injisert eller ikke med ADSC ble analysert for spredning av Ki67 farging (Ki67 merking indeks, topp panel) eller for DNA-fragmentering av TUNEL analysen (nedre panel), 6 dager etter ADSC injeksjon. Prosentandelen av merkede kjerner ble målt i 15 felt ved høy forstørrelse (x 400) ved hjelp av visiolab 2000 analysesystemet. Alle resultatene var representative for tre til fire uavhengige eksperimenter (3 til 5 tumorer pr gruppe) ble utført med ADSCs samplet fra forskjellige friske donorer. Verdier er gjennomsnitt ± bred singlett. *: P 0,05; **: P 0,01; ***: P 0,01
Vi neste undersøkt hvilke mekanismer som er involvert i effektene av menneskelige ADSCs på PDAC svulster
in vivo
.. Svulster behandlet eller ikke med ADSCs ble behandlet for immunhistokjemi for atom antigen Ki67 for å oppdage prolifererende celler (figur 4E, topp panel), eller behandles for TUNEL analyse for å kvantifisere døde celler (figur 4E, nedre panel), 6 dager etter injeksjon . Kvantifisering av farging viste en signifikant reduksjon i antall prolifererende celler, i ADSCs-overførte tumorer sammenlignet med kontroll (-66,5% ± 3,8%, p 0,01). I tillegg ADSCs induserte en fem ganger høyere celledød i pankreastumorer målt ved TUNEL analysen.
Diskusjoner
Vi demonstrert i denne studien at menneske ADSCs samplet fra et stort panel av forskjellige friske donorer effektivt svekket vekst av en svært aggressiv kreft, dvs. PDAC, både
in vitro Hotell og
in vivo
ved å hemme kreftcelle spredning og fremme kreft celledød følgende G
1 -fase blokk. Den sistnevnte inhiberende effekt ble utvidet til ondartede cellelinjer fra ulik opprinnelse.
Flere av vår
in vitro
observasjonene rapportert her demonstrerer at ADSCs har evnen til å interferere med proliferasjon av tumorceller ved å endre cellesyklusprogresjon.
in vitro
molekylære data viste at kreftceller som hadde vært i kontakt med ADSC-CM var i en hviletilstand (G
0 /G
1), og nedregulert CDK4 og cyclinD1. Interessant, var vi ikke i stand til å identifisere enten ytre eller indre-mediert celledød ved apoptose etter eksponering av kreftceller til ADSCs klimaanlegg medium. Denne evnen til å interferere med cellesyklusen allerede er blitt beskrevet for stromale celler fra andre opprinnelse [44], [45]. Unormalt av G
1-S overgangs regulatorer, og mer spesifikt av Rb vei, har blitt anerkjent som viktige faktorer i utviklingen av kreft hos mennesker. Følgelig modulasjon av CDK er et viktig mål for tumor forebygging og terapi som kan forklare hvorfor ADSCs hemme proliferasjonen av celler avledet fra flere epiteliale kreftformer.
Bruken av ADSC som kjøretøy i kreft genterapi er nylig blitt foreslått [36], [46], [47]. Faktisk ADSCs utviklet for å konvertere anticancerous prodrug kan være effektive biler til potent hemmer veksten av xenopodet menneskelige kolon eller prostatakreft [36], [46]. Imidlertid har bare noen få studier som viser motstridende resultater utført med naive celler isolert fra fettvev [36] – [38], [48]. Disse avvikene kan forklares med prosessen med ADSC isolasjon og passasje, antall injiserte celler og prosedyrene som brukes for
in vivo
eller
in vitro
studier. Faktisk, i noen studier, ble ADSC injisert
in vivo
sammen med kreftceller, er det derfor vanskelig å sammenligne effekten av ADSC på installert svulst (i denne studien) versus voksende svulst [36] – [38 ]. I tillegg ble noen data oppnådd med museceller [38], mens modellen er laget av humane celler og kreftceller fra forskjellige opphav ble anvendt, selv om vi demonstrert at ADSC-CM påvirket ikke tumorcellelevedyktighet i samme grad. Sist og ikke minst, er innholdet av ADSC varierer i henhold til forskjellige studier, da det i de fleste tilfeller passert celler ble anvendt [36] – [38], [48], mens vi utførte eksperimenter med primærkulturer. Dette kan være av betydning som ADSC fenotype og potensielt funksjon er modifisert med passasjer [49]. Denne variabiliteten i de potensielle virkningene av stromale celler på kreftcelleformering er også blitt beskrevet i studier ved bruk av benmarg stamceller [16] – [18], som tyder på at andre mekanismer kan være involvert i henhold til flere faktorer som gjenstår å bli identifisert. For eksempel viser vi her at celle til celle kontakt er ikke helt nødvendig som anti-proliferative effekter ble observert både i direkte samarbeid kulturstudier ved hjelp av transwell (ingen celle kontakt) og i eksperimenter med ADSCs klimaanlegg medium. I kontrast, Khakoo
et al
nylig vist at BM-MSC hatt en potent antioncogenic effekt på Kaposis sarkom gjennom celle til celle kontakt og Akt inaktivering [18]. Dette ble senere bekreftet
in vitro
av Ramasamy
et al product: [45].
Identifiseringen av de involverte i stromale celler og kreftceller interaksjoner mekanismer og spesielt utskilt faktor ansvarlig for den anti-proliferative effekt av ADSC er for tiden under undersøkelse. Mange kandidater som utskilles av ADSCs (slik som TGF β1, SDF1, RANTES), interleukiner (for eksempel IL6, IL1 β, IL8, GSF, IL11) eller prostaglandiner (PGE2, PGI2, PGJ2) er kjent for å utøve en anti-proliferativ /pro -apoptotic effekt. Trekkende studier utført med CAPAN avslørte at ADSC-CM presentere ingen kjemotiltrekkende aktivitet (Supplementary Figur S2, og tekst S1), noe som tyder på at faktor involvert i ADSC anti-proliferativ effekt er ikke en kjemokin. Nylig PGS har vist seg å mekle ADSCs blandet lymfocytt reaksjon hemming [35]. Under utarbeidelsen av dette manuskriptet, en studie foreslått at DKK-en kan være en av disse faktorene (48). IL-6 har nylig vært involvert i å beskytte normale og premaligne epitelceller fra apoptose i kolitt forbundet kreft (50). Dette tyder på at dette interleukin kan spille motsatte roller avhengig av inflammatorisk status, tumor stadium og /eller type.
In vivo
, fikk vi en, men effektivt, men forbigående anti-proliferativ effekt på tumorprogresjon. GFP-merket ADSCs ble oppdaget rundt perifere kreft fartøy og innen sentrale og perifere acellulær og nekrotiske områder av svulsten, opp til 5 dager etter injeksjon (Supplerende Figur S3 og tekst S1). Basert på denne observasjonen, konsentrasjonen og /eller halveringstiden av de løselige faktorer som er ansvarlige for den anti-proliferative /anti-tumoral virkning er sannsynligvis ikke er tilstrekkelig til å holde tumorceller i en hvilende tilstand i lang tid, men er tilstrekkelig for å innledningsvis antagonisere kreftcelle-proliferasjon. En slik forbigående effekten kan bli reddet av flere, intratumoral injeksjon av ADSCs. Levere humane celler i en mus xenopodet med humane kreftceller kan resultere i en ikke-spesifikk immunrespons xenogen i mottakeren for å motvirke
in vivo
tumorigenesis. Imidlertid, fordi (i) CAPAN-1-celler ikke uttrykker MHC fra klasse I og II (data ikke vist), og (ii) atymiske mus immunsystem (kun mediert av NK-celler) er mindre viktig enn i immune dyr, vi rimelig utelukke en ikke-spesifikk immunrespons i den observerte effekten. Tatt i betraktning muligheten for ADSC til å delta i vaskulær-lignende struktur formasjon [23], kan det ikke utelukkes en spesifikk pro-angiogene virkning av ADSC i sammenheng med bukspyttkjerteltumorvekst. Men denne virkning, om noen, synes å være mindre ved det stadium av sykdommen, det vil si i løpet av den eksponensielle fasen av tumorvekst som vi testet i dette arbeidet. I tillegg har vi ikke var i stand til å identifisere endringer i vaskulær tetthet, enten fra mus eller human opprinnelse, etter intratumoral injeksjon av ADSCs (data ikke vist). Alternative endringer i ADSCs fenotype følgende intratumoral injeksjon bør overvåkes nøye. Ja, vi nylig viste at ADSCs raskt og massivt ervervet høy phagocytic aktivitet og indeksen, når injisert i bukhulen på nakne mus [51].
Helt, vårt arbeid representerer den første studien ved hjelp av ikke-konstruerte celler til behandle PDAC. Denne anti-proliferativ effekt av ADSC på bukspyttkjertelcancerceller er mediert i det minste delvis av et utskilt faktor, men det er også fristende å spekulere i at
in vivo
ADSC kan modifisere mikromiljøet av tumoren og derved hemme dens spredning . Konklusjonen til ADSCs evne blokkere G
1-S fase overgang og deretter å hemme kreftcellene spredning
in vitro Hotell og
in vivo
kan være en effektiv og gjennomførbar tilnærming for behandling av 85% av PDAC pasienter som ikke kan drives i en helbredende måte på grunn av en lokalavansert sykdom.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Menneskelig fettvev var innhentet som avfall fra estetiske kirurgi prosedyrer. Alle pasienter ga sitt skriftlige samtykke. Prosedyrene ble godkjent av regional etisk komité «Comité de beskyttelse des personnes Sud Ouest et Outre Mer I».
Kjemi
For fettvev fordøyelse, collage ble kjøpt fra Roche (Roche Diagnostic, Tyskland). Bovint serumalbumin (BSA), deksametason, askorbat-2-fosfat, pantotensyre, og insulin-transferrin-natriumselenitt supplement ble innkjøpt fra Sigma Aldrich (St. Quentin Fallavier, Frankrike). Fosterkalveserum (FCS), trypsin, DMEM, RPMI-1640, Fungizone, penicillin, streptomycin, og PBS ble levert av Invitrogen (Cergy-Pontoise, Frankrike). Foster bovin serum (FBS) for ADSC kultur ble kjøpt fra Perbio (Paris, Frankrike). Den antimycoplasma agent, Plasmocin ™ ble levert av InvivoGen (Toulouse, Frankrike).
Tumor cellekultur
CAPAN-en, CAPAN-2, BxPC-3, Miapaca-2 og Panc-1 cellelinjer avledet fra humane PDAC ble dyrket som tidligere beskrevet [52]. HuH7 og HepG2 celler, avledet fra leverkreft, ble dyrket som beskrevet andre steder [53]. PC3 (human prostatakreft) og Caco-2-celler (human colon carcinom) ble dyrket i DMEM 1 g /l glukose-medium supplert med 10% FCS. Hela (human cervikal karsinom), ble dyrket i DMEM 4,5 g /l glukose-medium supplert med 10% FCS. Alle media ble supplert med Fungizone, antibiotika, L-glutamin, og antimycoplasma reagens (Plasmocin ™, InvivoGen). Cellene ble holdt ved 37 ° C og 5% CO2.
Menneskelige ADSCs forberedelse og kultur
Menneskelige ADSCs ble samplet fra 20 friske givere. Stroma vaskulær fraksjonen ble isolert fra humant fettvev hentes fra mage dermolipectomy i plastisk kirurgi avdeling Rangueil Hospital (Toulouse, Frankrike) som tidligere beskrevet [19]. Kort sagt ble SVF-celler sådd ut i T75-kolber over natten i DMEM-F12 (01:01) medium supplementert med 5% FBS, 100 ug /ml pantotensyre, 100 mM askorbinsyre, 16 mM biotin, 250 ug /ml amfotericin, 5 ug /ml streptomycin og 5 U /ml penicillin. Etter 24 timer ble kulturene vasket grundig ved å bruke PBS for å fjerne gjenværende ikke-adherente celler. HADSC vekst ble forfulgt inntil cellene nådde 75% samløpet (passasje 0).
In vitro
celle nummer vurderings
50 × 10
3 CAPAN-1 celler ble dyrket i komplett RPMI-medium i 24 timer i 35-mm skåler, før serum sult i 16 timer. Celler ble dyrket i triplikat i nærvær eller ikke av ADSCs eller BM-MSC-kondisjonert medium i ytterligere 48 timer. Kontrollceller ble dyrket i DMEM-F12 (01:01) medium supplementert med 5% FBS. Celleveksten ble målt ved celletelling ved hjelp av en Coulter-teller modell ZM. For ko-kultur-analyser, ble CAPAN-1-celler først sådd ut i cellekultur innsatser med 4 um porer (BD Biosciences) i komplett medium i 24 timer. Etter en 16 timers berøvelse trinn, ble CAPAN-1-celler overført til 35-mm skåler i nærvær av ADSCs ved forskjellige forhold. Alle eksperimenter ble utført med ADSCs og MSC renset fra forskjellige friske donorer.
In vitro
cellenes levedyktighet assay
Målceller (15 x 10
3) ble dyrket i fullstendig medium i flatbunnede 96-brønners plater i 24 timer, før serum sult i 16 timer. Celler ble dyrket i triplikat i nærvær eller ikke av ADSC-kondisjonert medium i ytterligere 48 timer. Kontrollceller ble dyrket i DMEM-F12 (01:01) medium supplementert med 5% FBS. Celleviabilitet ble målt ved MTS analysen, i henhold til produsentens anbefalinger (CellTiter96 vandig Analyse, Promega Frankrike, Charbonnieres, Frankrike). Eksperimenter ble utført med ADSCs renset fra forskjellige friske donorer. Resultatene er uttrykt som prosent av verdiene erholdt i kontrollforhold.
Strømningscytometri-analyse av proliferasjon og celledød
CAPAN-1-celler ble dyrket og behandlet med ADSCs-CM som er beskrevet i
«in vitro celle nummer vurdering»
delen. Cellene ble inkubert med BrdU 10 um (Sigma Aldrich) i 4 timer ved 37 ° C. CAPAN ble oppsamlet, vasket en gang i PBS og deretter fiksert i iskald 70% etanol i 1 time ved 4 ° C. Celler ble oppsamlet ved sentrifugering ved 600 g, vaskes i PBS inneholdende BSA 0,5% og Tween-20 0,5%, og resuspendert i HCl 2 N og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Etter vasking ble cellene suspendert i natriumboratbuffer (0,1 M, pH 9) for å nøytralisere resterende syre. Celler ble farget med anti-BrdU monoklonalt antistoff (Becton Dickinson) i 30 minutter ved romtemperatur. Etter vask, ble CAPAN-1-celler ble resuspendert i propidiumjodidfarging oppløsning (5 ug /ml) før analyse på strømnings cyotmeter (CantoII, Becton Dickinson). For annexin-V og propidiumjodid påvisning ble Celler merket enten med annexin-FITC (Apoptotest FITC, DakoCytomation), eller propidiumjodid (Invitrogen) i henhold til produsentens anbefaling. Apoptotiske og nekrotiske celler ble kvantifisert ved hjelp av en BD FACS Calibur (Beckton Dickinson) og Cell søken pro programvare (Beckton Dickinson).
tunel
analyser
Påvisning av celledød ved TUNEL assay på CAPAN-1 tumorer ble utført som beskrevet andre steder [42]. For
In vitro
celle-døden-analyser, 50 × 10
3 CAPAN-1 celler ble sådd i i 4-brønn glass (Lab-Tek II kammer lysbilde, Nalge Nunc International, Naperville IL) i komplett medium i 24 timer. Etter serum sult i 16 timer, ble cellene dyrket i triplikat i nærvær eller ikke av ADSC-CM i ytterligere 48 timer. Kontrollceller ble dyrket i DMEM-F12 (01:01) medium supplementert med 5% FBS. Påvisning av de tidlige stadier av kromosom sammenbrudd ble utført ved hjelp Apopdetek etter produsentens anbefalinger (ApopDETEK, Enzo biovitenskap, Farmingdale, NY, USA).
Western Blot analyse
Proteiner ble hentet fra CAPAN-1-celler, oppløst på SDS-polyakrylamidgeler, og overført til nitrocellulosemembran som beskrevet andre steder [53]. Etter romtemperatur blokkering i 1 time, ble blottene inkubert med antistoffer som er kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Heidelberg, Tyskland) frembrakt mot cyclinD1 (sc-124), CDK4 (sc-260), CyclinE (sc-247), βactin (SC-8432) eller glyceraldehydes-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) (sc-24778). Rb og phosphospecific Rb antistoffer var fra Cellesignalering Technology (Ozyme, St Quentin en Yvelines, Frankrike). Sekundære HRP-konjugert antistoff (Perbio Science, Erembogdegem-Aalist, Belgia) ble tilsatt, og blotter ble inkubert i 1 time ved romtemperatur.
