Abstract
Aktivering av hakket reseptorene er avhengig av deres intracellulære proteolyse av gamma-sekretase kompleks. Dette cleavage frigjør HAKK intracellulære domenet (NIC), slik at translokasjon av NIC mot kjernen for å montere inn en transkripsjonen plattform. Lite informasjon er tilgjengelig om de regulatoriske trinnene opererer på NIC Følgende utgivelsen fra den transmembrane reseptor opp til sin tilknytning til transkripsjons partnere. Forstyrrer disse reguleringsmåten kanskje potensielt påvirker atom utfallet av HAKK signalering. Heri, vi utnyttet en pålitelig modell for å studere de molekylære hendelser som oppstår i etterkant NOTCH1 cleavage. I kreft i bukspyttkjertelen celler, pulsen NOTCH1 aktivering førte til økt uttrykk av HAKK målgener nemlig HES1 og c-MYC. Vi avdekket at ved utgivelsen, den NOTCH1 intracellulære domenet, NIC1, gjennomgår en rekke posttranslasjonelle modifikasjoner som inkluderer fosforylering. Mest interessant, har vi funnet at aktivering av MEK /ERK sti fremmer HES1 uttrykk. Hemming av gamma-sekretase kompleks hindret MEK /ERK-indusert HES1 ekspresjon tyder på en HAKK-avhengig mekanisme. Til slutt, høyere nivåer av NIC1 ble funnet i forbindelse med sine transkripsjonspartnere [CBF1, Su (H) og LAG-1] (CSL) og MASTERMIND LIGNENDE 1 (MAML1) ved MEK /ERK-aktivering, ved å gi en potensiell mekanisme hvorved MEK /ERK sti fremmer uttrykk for HAKK målgener. For første gang, våre data utsatt en signalveien, nemlig MEK /ERK sti som positivt påvirker på HAKK atom utfallet.
Citation: Tremblay jeg, Paré E, Arsenault D, Douziech M, Boucher M-J (2013) The MEK /ERK Pathway Fremmer HAKK Signalering i kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 8 (12): e85502. doi: 10,1371 /journal.pone.0085502
Redaktør: Irina V Lebedeva, Columbia University, USA
mottatt: 30 august 2013; Godkjent: 27 november 2013; Publisert: 31.12.2013
Copyright: © 2013 Tremblay et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra det kanadiske Institutes for Health Research (IC1-102949 og MOP-106456 til MJB). MJB er en lærd fra Fonds de Recherche Santé Québec (FRQ-S) og medlem av FRQ-S-finansierte Centre de Recherche Clinique Étienne-Le Bel. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
hakket reseptorer orkestrere en rekke utviklingsprosesser i tillegg sikre voksent vev homeostase [1,2]. Denne svært konservert signalveien har en forholdsvis enkel molekylær arkitektur. Ved ligand binding, de trans HAKK reseptorer (HAKK 1-4) gjennomgå sekvensielle splittelser av Adam-metallproteaser og gamma-sekretase kompleks. Sistnevnte, blokkert av gamma-sekretase hemmere, utgivelser HAKK intracellulære domenet (NIC) som er gratis å translocate mot kjernen å samarbeide med DNA-bindende protein [CBF1, Su (H) og LAG-1] (CSL) og ko-aktivator Mastermind-SOM 1 (MAML1) for å modulere genekspresjon. De er best karakterisert målgener av hakk veien er sikkert medlemmer av HAIRY ENHANCER av Split (HMS) familie, selv regulatorer av transkripsjon [1-3]. Et vesentlig trekk av den HAKK signalveien er altså den doble rolle av reseptoren, dvs. avføling av signalet og oppnå respons. Lite er kjent om de regulatoriske trinnene opererer på NIC etter sin utgivelse fra trans reseptoren til sin transkripsjonen handling. Imidlertid er atom resultatet av HAKK signalering, mest sannsynlig, kontrollert for å sikre nøyaktig regulering av signalstyrke og varighet. Videre studier er dermed klart behov for å avdekke mekanismer som det spaltede reseptor-koordinatene genuttrykk. I tillegg bør identifisering av potensielle modulator av HAKK signale forbedre vår forståelse av denne tilsynelatende enkle veien.
Aberrant HAKK signale ble vist seg å spille en viktig rolle i hematologiske maligniteter [4] og noen solide svulster [2] som bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom (PDA). Faktisk er reaktivering av HAKK signale observert tidlig i PDA patogenese og fortsetter gjennom hele utviklingen av sykdommen [5-8]. Exome sekvensering av menneskelig PDA vev gitt ytterligere støtte til en avgjørende rolle for HAKK signalisering i bukspyttkjertelen kreft [9]. Interessant, blokkering av signalisering HAKK med gamma-sekretase inhibitor forhindret utviklingen av premaligne lesjoner i bukspyttkjertelen til PDA i en musemodell av KRAS-indusert PDA [10,11]. Verdt å merke seg, KRAS nedstrøms signal spiller avgjørende rolle i bukspyttkjertelen kreftutvikling som onkogen mutasjon i KRAS er funnet i 95% av PDA [9,12]. Videre redusert HAKK signalering i humane bukspyttkjertelkreft cellelinjer korrelerte med reduserte priser spredning, økt apoptose, redusert forankringsuavhengig vekst og redusert invasjonsegenskapene [11,13-16]. Denne forbindelsen mellom HAKK og RAS signalering er ikke unikt for kreft i bukspyttkjertelen celler. Faktisk ble RAS og HAKK signale vist seg å samarbeide for å fremme kreftutvikling i brystkreftceller, melanom og leukemi [17-19]. Globalt målretting HAKK signale vises en attraktiv ny terapeutisk strategi spesielt for PDA pasienter [20]. Imidlertid er en bedre forståelse av veien kritiske for å utvikle effektive HAKK-inhibitorer og /eller antagonister siden y-sekretase-inhibitorer, selv om det er nyttig, ikke blir hakk spesifikk og ukritisk påvirke alle signalveier er regulert av gamma-secretase kompleks foruten egge gastrointestinal toksisitet [21-23].
I denne studien har vi utnyttet en pålitelig modell for å studere de molekylære hendelser etter spalting av trans NOTCH1 reseptoren opp til kjernefysiske lokalisering av kløyvde NOTCH1 fragment (NIC1). Vi avdekket at ved utgivelsen, NIC1 gjennomgår hierarkisk fosforylering i kreft i bukspyttkjertelen celler som korrelerer med uttrykk av HAKK målgener som HES1. Mest interessant, har vi funnet at aktivering av MEK /ERK sti fremmer HES1 uttrykk gjennom HAKK avhengige mekanismer.
Materialer og metoder
Cell Kultur og HAKK aktiveringsprosedyren
HEK293T og de menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer MIA PACA-2 og BxPC-3 ble innhentet fra ATCC og kultivert som tidligere beskrevet [24].
Å indusere en puls av HAKK aktivering, la vi etylenglykol-bis (2-aminoethylether) –
N, N, N
«,
N»
tetra syre (EGTA) (4 mM) i 15 minutter for å eksponentielt voksende MIA PACA-2 celler. EGTA ble deretter fjernet ved å erstatte mediet med frisk normal kulturmedium (DMEM).
Antistoffer og reagenser
Det spesifikke antistoff som gjenkjenner bare den spaltes NOTCH1 (D3B8) (NIC1) ble erholdt fra Cell signalering. Antistoffer mot dual-fosforylert (aktiv) ERK1 /2 (pErk1 /2), ble CSL, MAML1 og GAPDH kjøpt fra Cell Signaling. HES1 antistoff var fra Abcam. -Antistoff for påvisning av total ERK1 /2 var fra Santa Cruz. Myc og HA-antistoffer ble oppnådd fra Roche. Den gamma-sekretase inhibitor N- [N- (3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)] – S-fenylglycin
t
-butylester (DAPT) og den MEK1 /2 inhibitor U0126 ble innkjøpt fra Calbiochem . Alle andre materialer var fra Sigma, med mindre annet er angitt.
Western Blot
Som tidligere publiserte [24], ble cellene lysert i Triton-buffer (1% Triton X-100, 50 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,2 mM ortovanadat, 40 mM β-glycerofosfat, 50 mM natriumfluorid, 10% glycerol, 1 mM PMSF, 0,5 ug /ml leupeptin, 1 ug /ml pepstatin og 0,5 ug /ml aprotinin) og renset for cellerester ved sentrifugering. Lik mengde av proteiner ble separert ved SDS-PAGE (polyakrylamid gelelektroforese) og proteiner ble detektert immunologisk etter Elektro-til nitrocellulosemembraner.
Forbigående transfections
Forsøk ble utført som beskrevet tidligere [24-26]. Kort fortalt ble HEK293T celler transfektert med Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens anbefalinger. Vektoren koder for en MYC-merket versjon av cytoplasmaområde av mus
notch1 plakater (pLIA-NIC1) ble hentet fra Addgene (plasmid 15131). HA-merket villtype MEK1 (MEK1 WT) og konstitutivt aktiv mutant av MEK1 (MEK1 CA) kodende cDNA ble vennlig levert av N. Rivard (Université de Sherbrooke, Canada) og ble tidligere beskrevet [27]. Cellene ble lysert tjuefire timer etter transfeksjon og forberedt for western blot.
Immunpresipitasjon, fosfatase og kinasebestemmelsene
immunoutfellinger ble i hovedsak utført som tidligere beskrevet [25,26]. I korthet ble cellene vasket to ganger med iskald PBS, lysert i Triton-buffer og renset for cellerester ved sentrifugering. Primært antistoff ble tilsatt til 2 mg av ryddet cellelysater og inkubert i 3 timer ved 4 ° C under omrøring. Endogen NIC1 ble immunopresipitert ved bruk av anti-spaltet NOTCH1 (NIC1) antistoff, mens anti-myc antistoff ble brukt for å immunoprecipate den overuttrykt NIC1 (MYC-merket). Protein G-Sepharose (GE Healthcare) ble deretter tilsatt i 1 time ved 4 ° C under omrøring. Immunkomplekser ble vasket tre ganger med iskald Triton buffer. Deretter immunokomplekser ble demontert, enten ved tilsetning av 4X Laemmli-prøvebuffer (1X = 62.5mm Tris-HCl pH 6,8, 2,3% SDS, 10% glycerol, 1 mM PMSF, 0,005% bromfenolblått og 5% β-merkaptoetanol) eller benyttes til fosfatase og kinase analyser.
For fosfatase analyser, immunkomplekser ble ytterligere vasket to ganger med 1X NEBbuffer pakke for Protein MetalloPhosphatase (New England Biolabs Inc.) supplert med 1 mM MnCl
2 og 1 mM PMSF, 0,5 ug /ml leupeptin 1 ug /ml pepstatin og 0,5 ug /ml aprotinin. Perlene ble deretter delt likt i to Eppendorf-rør. 400 enheter av lambda proteinfosfatase (New England Biolabs Inc.) ble tilsatt til en av dem, og begge rørene ble inkubert i 30 min ved 30 ° C. Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 4X Laemmli-prøvebuffer.
For kinasebestemmelsene Triton-vaskede immunkomplekser ble ytterligere vasket to ganger med ERK1 reaksjonsbuffer (25 mM Tris pH 7,5, 0,02 mm EGTA, 0,2 mM orthovanadate, 1 mM PMSF, 0,5 ug /ml leupeptin 1 ug /ml pepstatin og 0,5 ug /ml aprotinin). Perlene ble deretter delt likt i to Eppendorf-rør og inkubert i 30 min ved 30 ° C i ERK1 reaksjonsbuffer supplert med 10 mM magnesiumacetat, 0,1 mM ATP og 2μCi [γ-
32P] ATP inneholdende eller ikke 0,1 ug av aktivt ERK1 ( Millipore). Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 4X Laemmli-prøvebuffer. Radiomerket NIC1 ble separert ved SDS-PAGE og behandlet for autoradiografi.
datapresentasjon
Alle forsøkene ble utført i minst tre uavhengige eksperimenter. Typiske Western blot vises. Densitometriske analysene ble utført ved hjelp av Image J 1,42 programvare.
Resultater
Kalsium chelation aktiverer NOTCH1 reseptoren
For å betimelig studie NOTCH1 aktivering, vi utnyttet en modell som tillater synkron aktivering av NOTCH1 reseptoren. På grunn av arten av hakket reseptorer som er sammensatt av to subenheter som holdes sammen ikke-kovalent av kalsiumavhengige interaksjoner [1,2], ble det tidligere vist at kalsium uttømming dissosierer og aktiverer hakket-reseptorer [28]. Denne strategien ble påvist en pålitelig metode for HAKK aktivering [29-34]. Derfor gikk vi til en puls av HAKK aktivering ved å utsette kreft i bukspyttkjertelen NOTCH1-uttrykkende celler til kalsium chelator EGTA. Som forventet, et 15 minutter puls av EGTA resulterte i reseptor-spalting [28,31] som fører til øket ekspresjon av det spaltede fragmentet NIC1 (figur 1A). Etter EGTA eksponering, ble mediet fjernet og cellene ble returnert for ulike tidsperioder (dvs. 30 til 240 minutter) til sin normale kultivert tilstand, som inneholdt kalsium. Økt protein uttrykk nivåer av NIC1 målgener HES1 og c-MYC ble observert, men med litt annen timelig profil (figur 1A). Denne observasjonen er i overensstemmelse med en fersk undersøkelse som viser forskjellige RNA profiler av HAKK responsive gener; medlemmer av
E
(
spl
) familie gener (
Drosophila
homologer av menneske
HMS
familie) er unik i hurtighet av deres respons på HAKK aktivering [30].
A. MIA PACA-2-celler ble etterlatt ubehandlet (-) eller behandlet med EGTA (4 mM) i 15 minutter (+). EGTA-inneholdende medium ble fjernet og erstattet med vanlig kulturmedium (Ca
2 +) for de angitte tidsperioder. B. MIA PACA-2-celler ble forbehandlet (+) eller ikke (-) med DAPT (25 pm) i 30 min. Cellene ble deretter eksponert for EGTA (4 mM) i 15 minutter (+). EGTA-inneholdende medium ble fjernet og erstattet med vanlig kulturmedium (Ca
2+) inneholdende DMSO (-) eller DAPT (25 pm) i 90 min. C. MIA PACA-2-celler ble etterlatt ubehandlet (-) eller behandlet med EGTA (4 mM) i 15 minutter (+). EGTA-inneholdende medium ble fjernet og erstattet med vanlig kulturmedium (Ca
2+) inneholdende DMSO eller actinomycin D (1 ug /ml) for de angitte tidsperioder. Western blot analyser ble utført ved bruk av passende antistoffer.
For å støtte HAKK avhengige mekanismer involvert i EGTA-indusert HES1 uttrykk, vi pre-behandlet cellene med gamma-sekretase inhibitor DAPT, godt kjent for å blokkere HAKK cleavage. Forbehandling av cellene med DAPT forhindret EGTA-indusert NIC1, HES1 og c-myc protein uttrykk (figur 1B og data ikke vist) som understøtter at EGTA virkninger HES1 uttrykk gjennom aktivering av hakket reseptorer. Også tilsetningen av transkripsjonen inhibitor actinomycin D følgende EGTA eksponering var ikke signifikant innvirkning på EGTA-indusert ekspresjon NIC1 men hindret ekspresjon av HES1 og c-myc (figur 1C og data ikke vist). Til sammen våre data er i tråd med det som tidligere er vist i andre cellelinjer [29-34] dvs. forbigående eksponering for EGTA fører til NOTCH1 aktivering ved å slippe den intracellulære domenet NIC1, slik at det å translocate mot kjernen å modulere gentranskripsjon . Subcellulære fraksjone bekreftet at NIC1 finnes hovedsakelig i kjernen følgende EGTA eksponering (figur S1).
NIC1 fosforyleres i kreft i bukspyttkjertelen celler
Interessant, vi har oppdaget forskjellige molekylvektformer NIC1 etter en puls av NOTCH1 aktivering av EGTA med hovedsakelig høy molekylvekt danner gradvis observert over tid (figur 1A ). Verdt å merke seg, 240 minutter etter EGTA eksponering, returneres NIC1 uttrykk til nivåer sammenlignes med ubehandlede celler som tyder på en rask omsetning av NIC1 etter dens transkripsjonen handling. Følgelig HES1, en kortvarig protein [3], ble bare uttrykt forbigående, med en topp på 90-120 minutter etter EGTA eksponering og tilbake om kontrollnivåer etter 240 minutter.
For å forklare de forskjellige molekylvekt profilen til NIC1, testet vi om NIC1 gjennomgår posttranslasjonelle modifikasjoner etter sin løslatelse fra transmembrane reseptor. Mer spesifikt, vi analyserte fosforylering nivåer av NIC1 i kreft i bukspyttkjertelen celler nemlig MIA PACA-2 og BxPC-3. Disse cellelinjene viser basal aktivering av NOTCH1 reseptoren som vist ved ekspresjon av det spaltede fragmentet NOTCH1 NIC1 (figur 2). Bemerkelsesverdig, eksponentielt voksende MIA PACA-2 celler vise lavere NOTCH1 aktivering i forhold til BxPC-3. Fosfatase analyser viste at NIC1 fosforyleres i eksponentielt voksende MIA PACA-2 og BxPC-3 celler (figur 2). Videre påfølgende EGTA-indusert NOTCH1 aktivering i MIA PACA-2, NIC1 ble hovedsakelig funnet i en fosforylert tilstand (figur 2).
NIC1 immunoutfelt (IP NIC1) fra total lysater av eksponentielt voksende MIA PACA-2 (MIA), MIA PACA-2 celler behandlet med EGTA (4 mM) for 15min og deretter tilbake til sin normale kultur media for 90min, eller eksponentielt voksende BxPC-3 (Bx). Etter NIC1 immunoutfelling ble fosfatase-analyser utført (+) ved å bruke lambda fosfatase (λ fosfatase). IP NIC1 ikke inkuberes med lambda fosfatase er angitt som pNIC1. En representant Western blot ved hjelp av et antistoff mot NIC1 vises.
I vårt arbeid med å identifisere potensielle kinaser som modulerer NIC1 fosforylering, vi gikk videre til forbigående transfections i HEK293T celler. Interessant, observerte vi høymolekylære former av et eksogent NIC1 når cellene ble ko-transfektert med en konstitutiv aktiv form av MEK1 (MEK1 CA) som fører til ERK1 /2-aktivering (figur 3A). Fosfatase analyser gitt bevis for at NIC1 er fosforylert når det uttrykkes i HEK293T celler (figur 3B venstre, NIC1 + MEK1 WT). Imidlertid NIC1 fosforylering nivåer ble betydelig økt når det MEK /ERK-reaksjonsveien ble aktivert ved nærværet av en MEK1 CA (figur 3B til høyre). Ligner NIC1 fosforylering statene ble oppdaget når cellene ble ko-transfektert med en onkogene RAS (data ikke vist). Disse resultatene antydet at MEK /ERK-reaksjonsveien kan påvirke nivåene av fosforylering NIC1. Den ERK1 /2 er vel kjent til å fosforylere et antall av cytoplasmiske og kjerneproteiner, inkludert transcriptional regulator [35,36]. Derfor ble det undersøkt hvorvidt NIC1 kan være et direkte mål for den ERK1 /2. Interessant, en aktiv ERK1 var i stand til å fosforylere NIC1 i
in vitro
kinase analyser (figur 3C). Til sammen våre resultater tyder på at NIC1 er fosforylert i kreft i bukspyttkjertelen celler. Ifølge vår observasjon at NIC1 fosforylering statene økt over tid etter EGTA eksponering mens avtagende i uttrykket, er det fristende å spekulere i at NIC1 kan gjennomgå hierarkiske fosforylering hendelser etter sin utgivelse fra transmembrane reseptor som koordinerer NIC1 uttrykk samt NIC1 avhengig transkripsjonsaktivering og demping. Videre påfølgende til våre resultater, potensialet involvering av MEK /ERK-veien i reguleringen av NIC1 funksjonen sikkert fortjener ytterligere oppmerksomhet.
A. HEK293T ble transfektert med pLIA-NIC1 (MYC-merket) konstruere sammen med en cDNA som koder for en villtype (WT) eller konstitutiv aktiv (CA) versjon av MEK1 (HA-merket). Cellene ble lysert 24h etter transfeksjon. NIC1 ekspresjon ble analysert ved western blot ved anvendelse av et anti-myc antistoff. Ekspresjonsnivået av det eksogene MEK1 ble undersøkt ved western blot ved anvendelse av et anti-HA-antistoff. Dual-fosforylerte og totale ERK1 /2 uttrykk nivåer ble vurdert ved hjelp av spesifikke antistoffer. Den MEK1 CA-indusert høyere molekylvekt form av NIC1 er merket med en stjerne *. B. HEK293T ble transfektert med pLIA-NIC1 konstruere sammen med en cDNA som koder MEK1 WT eller MEK1 CA. Celler ble lysert og NIC1 ble immunopresipitert (IP NIC1) ved anvendelse av et anti-myc antistoff. Fosfatase-analyser ble deretter utført (+) ved å bruke lambda fosfatase (λ fosfatase). De fosforylerte formene for NIC1 betegnes pNIC1. Den MEK1 CA-indusert høyere molekylvekt form av NIC1 er merket med en stjerne *. NIC1 ekspresjon ble analysert ved western blot ved anvendelse av et anti-myc antistoff. C. NIC1 ble immunopresipitert (IP NIC1) fra pLIA-NIC1 transfektert HEK293T hjelp av en anti-MYC antistoff. Kinase-analyser ble deretter utført som beskrevet i forsøksprosedyrene. Den autoradiografi viser fosforylert NIC1 (pNIC1) vises. Etter Elektro-av gelen, ble mengden av NIC1 immunopresipitert bekreftet ved Western blot (WB) under anvendelse av et anti-myc antistoffet.
Aktivering av MEK /ERK-reaksjonsveien fremmer HAKK aliserte
Vi neste adressert vidt MEK /ERK-reaksjonsveien kan påvirke HAKK signale særlig i vårt bukspyttkjertelkreft cellemodell MIA PACA-2, som viser basal NOTCH1 aktivering /NIC1 uttrykk men induserbar NOTCH1 aktivering (se figur 1A). Verdt å merke seg, som de fleste kreft i bukspyttkjertelen celler, MIA PACA-2 celler havn en KRAS mutasjon fører til basal ERK1 /2 aktivisering, sistnevnte er viktig for MIA Paca-2 celleproliferasjon og overlevelse [37]. Sterkt og bærekraftig stimulere MEK /ERK vei, behandlet vi MIA PACA-2-celler med forbol 12-myristat 13-acetat (PMA). Som vist i figur 4A, tilsetning av PMA hurtig førte til vedvarende ERK1 /2-aktivering, som korrelert med øket HES1 og c-myc-proteinet ekspresjonsnivåer. For å sikre at effekten var HAKK-avhengige, vi pre-behandlede cellene med DAPT å slippe NIC1 uttrykket (figur 4A) og til mest sannsynlig hemme spaltningen av de andre HAKK reseptorer. Forbehandling med DAPT vesentlig hindret PMA-induserte HES1 ekspresjon, mens virkningen på c-MYC var delvis (figur 4A). Dette kan potensielt bli forklart ved det faktum at, selv om c-myc er blitt identifisert som en NOTCH1 direkte målgen [38,39], blir c-MYC også kjent for å være direkte regulert av ERK1 /2 [35,36]. Derfor kan det være mulig at c-MYC er regulert av både hakk og ERK-avhengige mekanismer i vår modell. Verdt å merke seg, i vår modell, DAPT helt avskaffet PMA-indusert HES1 uttrykk som tyder på at PMA fremmer i stor grad HES1 uttrykk gjennom hakket reseptorer kontrast med tidligere studier som tyder på en MEK avhengig HAKK-uavhengig regulering av HES1 [40,41].
A. MIA PACA-2-celler ble forbehandlet (+) eller ikke (-) med DAPT (25 pm) over natten. Cellene ble deretter behandlet med PMA (100 nM) for de angitte tidsperioder. B. MIA PACA-2-celler ble etterlatt ubehandlet (-) eller behandlet med EGTA (4 mM) i 15 minutter (+). EGTA-inneholdende medium ble fjernet og erstattet med vanlig kulturmedium (Ca
2 +) som inneholdt DMSO, PMA (100 nM) eller PMA + U0126 (10 uM) for de angitte tidsperioder. A. og B. Celler ble lysert og Western blot analyser ble utført ved anvendelse av de angitte antistoffer. C. Fra lignende eksperimenter er presentert i B., en grafisk fremstilling som viser relativ HES1 uttrykk, for hver tidsperiode, i behandlede celler (PMA, PMA + U0126) sammenlignet med kontroll-celler (DMSO-behandlede) er vist. D. Fra lignende eksperimenter er presentert i B., en grafisk fremstilling som viser relativ c-MYC uttrykk, for hver tidsperiode, i behandlede celler (PMA, PMA + U0126) sammenlignet med kontrollceller (DMSO-behandlede) er vist. C. og D. Resultatene er gjennomsnitt ± SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** p 0,005, *** p 0,0005 sammenlignet med samme periode i DMSO-behandlede celler. # P 0,05, ## p 0,005, ### p 0,0005 sammenlignet med samme periode i PMA-behandlede celler.
For å også utforske innflytelsen av ERK1 /2 aktivisering etter en puls av NOTCH1 aktivering, har vi lagt til PMA i media etter vask ut EGTA. Tilsetning av PMA fremmet EGTA-indusert HES1 og c-myc ekspresjonen, en effekt som ble opphevet ved nærværet av MEK-inhibitor U0126 (figur 4B-D). Det er verdt å nevne at vi merket en økning i ERK1 /2 fosforylering at redusert over tid etter utskiftning av mediet for EGTA-behandlede celler med normal dyrkningsmedier (se kontroll (DMSO-behandlet) celler, figur 4B). Denne svake økningen kan representere en begrensning av fremgangsmåten (som krever fjerning av EGTA), og kan bare være en konsekvens av å erstatte EGTA-inneholdende medium med ferskt kulturmedier, ERK1 /2-fosforylering er ganske følsomme for medium endring. Vi har utelukket en rolle for HAKK signalisering ved modulering av ERK1 /2 aktiviteter fordi i) DAPT forhindret behandling EGTA-indusert NIC1 uttrykket (figur 1 B) uten å påvirke ERK1 /2 fosforylering (data ikke vist), og ii) hemming av HAKK signalering ved DAPT behandlings ikke signifikant modulerer ERK1 /2 fosforylering (figur 4A). Til sammen våre resultater peker mot en positiv regulering av HAKK avhengig HES1 uttrykk av MEK /ERK veien.
Vi etablerte at EGTA-indusert HES1 uttrykk kreves transkripsjons hendelser (figur 1C) støtter en modell der utgitt NIC1 translocates mot kjernen til å påvirke (
HES1
) genuttrykk. Iboende til dette, foreningen av NIC1 med sin DNA-bindende partner CSL og co-aktivator MAML1, dermed danner en funksjonell transkripsjonsenhet, er absolutt en forutsetning for å genet modulasjon [1,2]. Derfor, for å begynne å avsløre mekanismene som står for den positive virkningen av MEK /ERK sti på HAKK signalering, undersøkte vi om aktivering av MEK /ERK sti kan fremme foreningen av NIC1 med enten CSL eller MAML1. I motsetning til NIC1 ble CSL og MAML1 uttrykk nivåer ikke modulert på EGTA behandling (figur 5A). Derfor immunopresipitert vi CSL og MAML1 og testet NIC1 foreningen. Etter en puls av NOTCH1 aktivisering, ble høyere nivåer av NIC1 funnet assosiert med enten CSL eller MAML1 (figur 5B) igjen forsterke vår modell der, på EGTA-mediert NOTCH1 aktivering, samler den frigjorte NIC1 til en aktiv transkripsjonen komplisert å modulere genekspresjon. Interessant, sammenlignet med DMSO-behandlede celler, behandling med PMA fremmet av nesten to ganger foreningen av NIC1 med enten CSL (figur 5C) eller MAML1 (figur 5D). Tillegg av U0126 hindret både PMA-indusert NIC1 /CSL og NIC1 /MAML1 forening (figur 5C-D) som støtter MEK-avhengige mekanismer.
MIA PACA-2-celler ble etterlatt ubehandlet (-) eller behandlet med EGTA (4 mM) i 15 minutter (+). EGTA-inneholdende medium ble fjernet og erstattet med vanlig kulturmedium (Ca
2 +) som inneholdt DMSO, PMA (100 nM) eller PMA + U0126 (10 uM) i 90 min. A. NIC1, MAML1 og CSL uttrykk nivåer ble vurdert av western blot bruke de riktige antistoffer. B. CSL og MAML1 ble immunopresipitert (IP) før western blot analyser med de angitte antistoffer. C. CSL ble immunopresipitert (IP) etterfulgt av western blot analyser av NIC1 (til venstre). En grafisk fremstilling som viser den relative mengden av NIC1 co-immunopresipitert med CSL (NIC1 /CSL) vises (til høyre). D. MAML1 ble immunopresipitert (IP) etterfulgt av western blot analyser av NIC1 (til venstre). En grafisk fremstilling som viser den relative mengden av NIC1 co-immunopresipitert med MAML1 (NIC1 /MAML1) vises (til høyre). C. og D. Resultatene er gjennomsnitt ± SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05 sammenlignet med DMSO-behandlede celler.
Diskusjoner
I overensstemmelse med tidligere studier [29-34], våre resultater viser at en forbigående eksponering for EGTA er en nyttig og pålitelig modell til rettidig studie NOTCH1 aktivering i NOTCH1- uttrykke celler. Ja, det mulig for oss å oppdage at, ved løslatelse fra transmembrane reseptor, NIC1 gjennomgår en rekke posttranslasjonelle modifikasjoner som inkluderer fosforylering. Det bekreftes også tidligere etablert konsept der NIC1 er en kortvarig protein [1] som, innenfor en 4t tidsramme, et uttrykk for den nylig spaltet NIC1 nesten helt forsvunnet. Sammen med økt NIC1 uttrykk, posttranslasjonelle modifikasjoner og omsetning, klarte vi, for første gang, for å påvise økt uttrykk av endogene HAKK mål som tyder på at den EGTA-indusert NIC1 uttrykk oversettes til en funksjonell transkripsjonsenhet i kreft i bukspyttkjertelen celler. Den viktigste nyheten for vår forskning er demonstrasjonen at MEK /ERK sti fremmer uttrykk for HAKK mål HES1. Selv om flere studier vil definitivt være nødvendig for å fastslå om de MEK /ERK aktivering påvirker alle eller bare en undergruppe av HAKK mål, våre data gi bevis på at MEK /ERK sti styrker HES1 uttrykk mest sannsynlig gjennom mekanismer avhengig hakket reseptorer fordi pre- behandling av cellene med et gamma-sekretase inhibitor (DAPT) forhindret PMA-induserte HES1 ekspresjon. Tidligere studier har også rapportert virkningen av RAS sti på HAKK signale [18,42]. Disse studiene, hovedsakelig skjer under langvarig RAS aktivering eller MEK hemming, antydet at RAS signale fremmer NOTCH1 reseptor spalting /aktivisering. Våre funn er nyskapende fordi de avslører at MEK /ERK signalveien er effektiv til, minutter etter NOTCH1 cleavage, direkte påvirke NIC1 transkripsjonen funksjon. En hypotese som følge av våre resultater er at MEK /ERK-reaksjonsveien fremmer dannelsen av en funksjonell NIC1 transskripsjonsenhet med CSL og MAML1. Men videre studier er nødvendig for å avgrense de nøyaktige mekanismer som MEK /ERK sti fremmer HAKK signalering.
Interessant, det var tidligere antydet at posttranslasjonelle modifikasjoner, spesielt fosforylering, er nesten helt sikkert moduler NIC1 avhengig transkripsjon [1]. Først i
Drosophila product: [43], men senere i pattedyr, ble hyperfosforylering av det intracellulære domenet av NOTCH1 og NOTCH2 påvist etter løslatelse fra transmembrane reseptor [44,45]. Verdt å merke seg, hyperfosforylering av NIC1 var assosiert med i) NIC1 atom opphopning [45-48], ii) samspill med CSL [44] NIC1, iii) økt CSL-avhengig transkripsjon [44,47,48] og iv) NIC1 trans kapasitet [ ,,,0],48]. Disse resultatene antydet at NIC1 fosforylering kan fremme transkripsjonen potensialet i NIC1 /CSL kompleks. Men til dags dato har det meste kinaser som negativt regulerer NIC1 funksjon vært identifisert: AKT ble vist seg å fremme NIC1 cytoplasma lokalisering [49], fosforylering av NIC1 av DYRK1A svekket HAKK signale [50], og NLK avhengig NIC1 fosforylering redusert dannelse av den NIC1 /CSL komplekse [51]. Capobianco gruppe nylig gitt bevis for at før eller under NIC1 /CSL /MAML1 kompleks forening, er NIC1 fosforylert av CK2 at tilgjengeligheten til en påfølgende fosforylering side [52]. Begge fosforylering hendelser opptrådte som kreves for dissosiering av komplekset fra DNA. I tillegg er CycC /CDK8 kompleks tenkt å spille en viktig rolle i å forstyrre NIC1 /CSL /MAML1 komplekset ved fosforylering NIC1 innenfor sin C-terminal PEST domene påfølgende FBW7-mediert NIC1 ubiquitinering og degradering [53]. Likevel, til dags dato, ingen positive NIC1 regulatorer (kinaser) ble identifisert og nesten alle fosforyleringsseter på NIC1 fortsatt ikke bestemt. Våre resultater gir nå grunnlag for å undersøke det positive bidraget fra MEK /ERK sti på HAKK signale spesielt i sammenheng med kreft i bukspyttkjertelen celler. Verdt å merke seg, det ble tidligere vist at tvangs uttrykk for NIC1 i musen bukspyttkjertelen epitel fremmer dannelsen av premaligne bukspyttkjertelen lesjoner initiert av en onkogen
KRAS product: [54] antyder at KRAS og HAKK signale samarbeide for å fremme bukspyttkjertelen kreftutvikling.
