Abstract
Menneskelig CMTM3 er foreslått som en antatt tumor suppressor genet. Tapet av CMTM3 har blitt funnet i flere karsinomer. Imidlertid er regulering av CMTM3 ekspresjon og dens funksjon i tumorprogresjon forblir stort sett ukjent. Her undersøkte vi regulering av CMTM3 uttrykk, funksjon og molekylær mekanisme i humane testikler kreftceller. CMTM3 ble ofte nedregulert eller brakt til taushet i testikkelkreft cellelinjer og tumorvev, men sterkt uttrykt i normale testis vev. Gjen uttrykk for CMTM3 undertrykte betydelig kolonien formasjon, spredning og migrasjon kapasitet på testikkelkreftceller ved å indusere en G2 cellesyklus og apoptose. Videre er gjen ekspresjon av CMTM3 aktivert transkripsjonen av p53, p53-induserte akkumulering, opp-regulert ekspresjon av p21, og øket spaltning av caspase 9, 8, 3, og PARP. Den nedregulering av
CMTM3
i kliniske tumorvev ble assosiert med metylering av en enkelt CpG området ligger innenfor SP1 /SP3-responsive region av kjernen promoter. Disse resultatene indikerer at CMTM3 kan fungere som tumor-suppressor ved induksjon av et G2 cellesyklus og apoptose. CMTM3 er dermed involvert i testikkelkreft patogenesen, og det er ofte i det minste delvis brakt til taushet av metylering av en enkelt, bestemt CpG området i tumorvev
Citation. Li Z, Xie J, Wu J, Li W , Nie L, Sun X, et al. (2014) CMTM3 hemmer Menneskelig testikkelkreft cellevekst gjennom Inducing Cell-syklus og apoptose. PLoS ONE 9 (2): e88965. doi: 10,1371 /journal.pone.0088965
Redaktør: Thomas G. Hofmann, tysk Cancer Research Center, Tyskland
mottatt: 15 oktober 2013; Godkjent: 16 januar 2014; Publisert: 28 februar 2014
Copyright: © 2014 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Basic Research Program of China (Grant No. 2014CD745200, https://www.973.gov.cn/AreaAppl.aspx), Natural Science Foundation of China (Grant No. 81272840, http National: //www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm), og Unge Forskere Fund of Natural Science Foundation of China National (Grant No. 81201579, https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Testicular bakterie celle svulster (TGCTs) er vanlig hos menn i alderen 15 til 35 år og utgjør 1% av alle ondartede svulster hos menn [1]. Forekomsten av TGCTs har økt dramatisk i løpet av det siste århundret [2].
TGCTs stammer fra transform gonocytes eller udifferensiert spermatogoniene, som er avledet fra fosterets kjønnsceller og voksne bakterie stamceller, henholdsvis. TGCTs er klassifisert som nomas eller ikke-seminomatøs bakterie celle svulster i henhold til deres histologiske karakteristika [1]. Nomas er de hyppigste (50-70%) testikkelkreft bakterie celle svulster. Non-seminomatøs bakterie celle svulster inkluderer embryonal karsinom, plommesekk svulster, choriocarcinom, og teratomas [1]. TGCTs har blitt en av de mest helbredelig solide svulster, på grunn av fremskritt i diagnostiske og terapeutiske metoder [3]. Imidlertid er de molekylære mekanismer som opererer i TGCTs ikke fullt ut forstått.
CKLF lignende MARVEL transmembrane domene inneholdende 3 (CMTM3) hører til kjemokin-lignende faktor gen superfamilien, en ny familie som er lik den kjemokin og trans 4 familiene av signalmolekyler.
CMTM3
er en av flere chemokin-lignende faktorgener som befinner seg i en klynge på kromosom 16q22. CMTM3 protein inneholder en leucine glidelås og to LXXLL motiver. Dette 20 kDa proteinet er lokalisert til cytoplasmaet og tjener som et stillas for proteiner i det endoplasmatiske retikulum og kjernemembranen [4].
CMTM3
er sterkt uttrykt i den mannlige reproduktive system, med det høyeste uttrykk nivå i testiklene [4].
Tidligere studier har også indikert at flere medlemmer av cmtm super kan spille viktige roller i immunsystemet og mannlige reproduktive systemer og i tumorigenesis [5] – [12]. Det har nylig blitt vist at
CMTM3
er forstummet eller nedregulert i mage, bryst, nasofaryngeal, esophageal, tykktarm og nyre karsinom [8], [13]. Dets ekspresjon er omvendt korrelert med sin promoter CpG metylering status [8], [13]. Den re-ekspresjon av CMTM3 i tumorceller som mangler dets ekspresjon fører til undertrykkelse av cellevekst og apoptose, noe som tyder på at CMTM3 er en ny tumor suppressor [8]. Men dens rolle i kreftutvikling og progresjon er ikke klart definert oppdatert.
I denne studien, observerte vi at
CMTM3
var ofte nedregulert i testikkelkreft vev via metylering ved en spesifikk, enkelt CpG området ligger innenfor SP1 /sP3-responsive region av arrangøren. Ektopisk uttrykk for
CMTM3
hemmet kolonien formasjon, spredning, migrasjon og invasiv kapasitet på testikkelkreft celler. Disse funksjonene CMTM3 ble oppnådd ved å modulere cellecyklusprogresjonen og apoptose.
Materialer og metoder
Kreftceller og kliniske prøver
Et menneske seminom cellelinje (NCCIT), prostata kreft cellelinjer (LNCaP, DU145, PC3 og 22RV1), nyrekreft cellelinjer (fjernkontrollen på skjermen-2 og 786-O), blære tumorcellelinjer (HTB9-5637 og T24) og en HEK-293 human epitelial nyrecellelinje ble brukt . Celler ble dyrket i RPMI 1640 medium (Gibco /BRL) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C med en atmosfære av 5% CO
2.
Tyve par av testikkelkreft vev og de matchet ikke-kreft i testiklene vev ble oppnådd fra pasienter som gjennomgår primær kirurgi ved Shenzhen Second Folkets sykehus og Peking University Shenzhen Hospital med pasientenes eller fore «skriftlige samtykke, og har blitt godkjent av etisk komité av Shenzhen Second Folkets sykehus, Shenzhen, Kina. Prøvene ble enten umiddelbart fiksert i 10% nøytralt formalin for histologi og immunhistokjemi eller hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C i ytterligere PCR. H E-fargede objektglass fra alle saker ble anmeldt for å bekrefte diagnoser. De testikkelkreft bakterie celle svulster besto av 15 tilfeller av seminom, to embryo karsinom, en teratom, en blandet embryonal karsinom og teratom, og en Leydig celle tumor i henhold til Verdens helseorganisasjons kriterier [14]. Fem normal testikkel vevsprøver fra voksne som hadde gjennomgått rutine obduksjon ble også brukt for kontroller. Pasientene er 6-58 år gammel med et gjennomsnitt på 38 år.
semikvantitativ revers transkripsjon-PCR og real-time PCR
Isolering av totalt RNA og omvendt transkripsjon ble utført som tidligere beskrevet [15]. Den semi-kvantitativ PCR-analyse av
CMTM3
ble utført ved anvendelse av spesifikke primere, og
GAPDH
ble benyttet som intern kontroll.
CMTM3 Hotell og
GAPDH
primere var
CMTM3
-F: 5′-TTTTATCTGCTATGTGGCGTCC-3 «, og
CMTM3
-R: 5′-TGTCTTGTGGGCTGTGGTCTC -3 «;
GAPDH
-F: 5′-GTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3 «, og
GAPDH
-R: 5′-CTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3′. Real-Time PCR-analyser ble utført ved hjelp av Platinum SYBR Grønn qPCR Supermix UDG (Invitrogen Corporation, Carlsbad, California). Analysen ble utført i tre eksemplarer ved hjelp av ulike primersett:
CMTM3
-F: 5′-GCTTCTTTGCTACCATCGTGTTTG-3 «, og
CMTM3
-R: 5′-GCCTTCAGTCAG AGTCCGAGTC-3′;
GAPDH
-F: 5′-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC -3 «;
GAPDH
-R: 5′-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3 «. Den relative uttrykket nivået av
CMTM3
ble bestemt ved hjelp av to
-ΔΔCt metoden [16].
Protein utvinning og Western blot analyse
vev eller celler lysert ved RIPA buffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) supplert med en proteasehemmer cocktail og fosfatase hemmere. En mengde på 30 pg av totalt protein ble oppløst på SDS-12% polyakrylamidgeler og overført til PVDF-membraner (Hybond-P, Amersham Biosciences Piscataway, NJ, USA). Etter blokkering med 5% BSA i Tris-bufret saltvann med 0,1% Tween 20 (TBST) ved romtemperatur i 2 timer, ble membranen probet med primært antistoff ved 4 ° C over natten. Etter vasking tre ganger med TBST-buffer, ble membranene inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert IgG. De blotting signaler ble visualisert med Super Signal West Pico kjemiluminescenssubstrat (Pierce, Rockford, IL, USA). Membranene ble strippet med strippebuffer ved 40 ° C i 30 minutter med forsiktig risting og reprobed med et kanin polyklonalt antistoff mot β-aktin (1:10000, Santa Cruz Biotechnology) som en kontroll for protein lasting.
Anlegg av arrangøren reporter plasmider, transfeksjon og luciferase assay
for å konstruere en serie av
CMTM3
promoter-drevet luciferase reporter plasmider, seks DNA-fragmenter av oppstrøms
CMTM3
startkodon ble forsterket av PCR (PCR primere i tabell S1 i File S1) og klonet inn i pGL3-Basic vektor (Promega). De innsettinger ble bekreftet ved direkte sekvensering. 293ft og PC3-celler ble sådd ut i 24-brønners kulturplater ved 1 x 10
5-celler /brønn og transient transfektert med pGL3-promoter reporter og pRLSV40 som tidligere beskrevet [15], [17]. Når angitt, pCMV-Sp1 eller pCMV-SP3 ekspresjonsplasmider (OriGene, Rockville, MD, USA) ble ko-transfektert inn i cellene. Luciferase-aktiviteten ble bestemt ved bruk av dual-luciferase reporter Assay System (Promega, Madison, WI) og normalisert til den Renilla luciferaseaktivitet. Hvert eksperiment ble utført tre ganger i tre eksemplarer. Aktivitet ble definert som forholdet mellom ildflueluciferase til Renilla luciferase. For
in vitro
metylering analyse på
CMTM3
promoter fragmentet ble Sss jeg metylase brukt som rapportert tidligere [15].
DNA bisulfite behandling og metylering analyse
bisulfitt modifikasjon av DNA og bisulfitt genomisk sekvensering (BGS) ble utført som beskrevet tidligere [15], [18]. Bisulfite sekvense PCR primere (BGS-F, TAGATAGTTTTTTTGGATAGGGGTAGA, og BGS-R, ACCTTTAAAAAAACAAAAAAAAACCC) ble utformet ved hjelp av den elektroniske program, MethPrimer (https://itsa.ucsf.edu/urolab/MethPrimer) [19]. PCR ble utført i 40 sykluser med Hotstart Taq polymerase (Qiagen, Hilden, Tyskland). PCR-produktene ble klonet inn i pGEM-T (Promega, Madison, WI) vektor. Åtte til ti hvite kloner for hver prøve ble tilfeldig utvalgt for sekvensering.
Immunohistochemistry
immunhistokjemisk analyse av CMTM3 ble utført ved hjelp av en standard to-trinns teknikk som beskrevet tidligere [15]. Etter deparaffinization og rehydratisering, ble vev lysbilder tilberedt for å hente antigenet i en mikrobølgeovn med 10 mM citratbuffer (pH 6) i 15 min. Platene ble neddykket i 3% H
2o
2 i 20 minutter for å blokkere endogen peroksidase-aktivitet, ble vasket med PBS, og inkubert med 3% normalt bovint serum i TBS i 30 minutter for å forhindre ikke-spesifikk binding av det primære antistoff. Deretter ble vev lysbilder inkubert med renset kanin polyklonale antistoff mot CMTM3 (1:500, vennlig levert av Dr. Han, Peking University Center for menneskelig sykdom Genomics) eller normal kanin IgG som en kontroll ved 4 ° C over natten. Etter vasking med PBS tre ganger, ble platene inkubert med geite-anti-kanin IgG-HRP (sc-2030, Santa Cruz, CA, USA). Etter vasking, ble vev farget med nylaget DAB-løsning (DAKO, Carpinteria, CA) og visualisert og fotografert med en Leica DM4000B (Leica Microsystems, Inc.).
immunhistokjemisk uttrykk for CMTM3 ble evaluert basert en representant høy effekt felt fra to vev array-spots av to uavhengige etterforskere. Ekspresjonen av CMTM3, basert på beregning av en total poengsum immunofarging (TIS) som produktet fra en andel poengsum (PS) og en poengsum intensitet (IS), ble kvantifisert i henhold mikroskop og klassifiseres i fire undergrupper: ingen uttrykk (0-4) ; svake uttrykk (+: 5,6,8); moderat uttrykk (++: 9,10,12); intense uttrykk (+++: 15). [20]
Adenoviral infeksjon
adenovirus bærer
CMTM3
genet (Ad
CMTM3
) og den tomme adenovirus (Ad-null) ble vennlig levert av Dr. Han Lab [7]. NCCIT celler ble sådd med 5000 celler /cm
2 inn i vevskulturplater, og etter 24 timer ble infeksjon oppnådd ved å eksponere cellene til adenovirus ved den nødvendige multiplisitet av infeksjon (MOI) i serumfritt celledyrkningsmedium for 60 min, etterfulgt av tilsetning av seruminneholdende medium i 1-4 dager.
celleproliferasjon
for analyse av celleproliferasjon, NCCIT-celler ble infisert som ovenfor, og celleproliferasjon ble målt på 24, 48 og 72 timer med Cell Counting Kit-8 (CCK-8) etter produsentens anvisninger. Den spektrofotometrisk absorbans ved 490 nm ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser. Dataene er rapportert som gjennomsnittet av minst tre uavhengige eksperimenter.
Colony formasjon analysen
Celler ble infisert med Ad-
CMTM3
eller Ad-null. 24 timer etter infeksjon, ble 1000 celler sådd ut i hver brønn av seks-brønners plater og holdt i komplett medium i 2 uker. Overlevende kolonier (≥ 50 celler per koloni) ble fiksert med metanol, farget med krystallfiolett, telles og fotografert. Hvert forsøk ble kjørt i tre eksemplarer og utført tre ganger.
sårhelende analysen
For in vitro sårhelende analysen, celler infisert med Ad-
CMTM3
eller Ad -null ble dyrket i seks-brønns plater inntil sammenflytende. En rett bunnen er laget på tvers av cellelaget ved hjelp av en steril mikropipette spissen, og avfallet ble fjernet ved vasking av cellene med serumfritt medium. Celler ble fotografert 0 og 36 timer etter såret. Forsøkene ble utført in triplo.
apoptose assays
apoptotisk celledød ble vurdert ved strømningscytometri ved bruk av Annexin V-FITC /PI Apoptose Detection Kit ifølge produsentens instruksjoner. Etter 72 timer ble cellene høstet og inkubert med Annexin V-FITC og PI i 30 minutter i mørke ved 4 ° C. Flowcytometrisk analyse ble umiddelbart utført. Dataene er presentert som bi-parametrisk dot plots viser Annexin V-FITC grønn fluorescens sammenlignet med PI rød fluorescens. Forsøkene ble utført tre ganger.
Kvantitativ PCR for apoptose pathway
Førti-åtte timer etter celler ble infisert med Ad-
CMTM3
eller Ad-null, cellene ble høstet , og total RNA ble isolert og renset med RNeasy RNA Isolation Kit (Qiagen). En mengde på 2 pg av total RNA ble brukt til å syntetisere cDNA med den RT2 First Strand Kit (SABiosciences, QIAGEN). CDNA ble tilsatt til en 96-brønns plate fra RT
2 Profiler PCR rekkesystem (human apoptose PCR array). Kvantitativ RT-PCR for 84 gener knyttet til menneskelig apoptose ble utført ved hjelp av iCYCLER iQ5 Real-Time PCR System (Bio-Rad, Hercules, CA). Dataanalyse ble utført ved hjelp av ΔΔ
C
T
metode med fem housekeeping gener (
GAPDH
,
RPL13A
,
B2M
,
ACTB
, og
HPRT1
) valgt for normalisering. Transkripsjoner ble ansett fraværende hvis C
t 35 og ble fjernet fra analysen. Endringer i genekspresjon ble bestemt ved å sammenligne gentranskripsjon nivåer i celler infisert med Ad-CMTM3 til celler infisert med Ad-null.
Cell syklus analyse
Førti-åtte timer etter celler ble infisert med Ad-
CMTM3
eller Ad-null, ble cellene trypsinert, vasket to ganger, resuspendert i fosfatbufret saltvann (PBS), og fiksert i iskald 70% etanol. Etter at cellene ble farget med propidiumjodid (PI), ble cellesyklusanalyse utført ved flowcytometri på en fluorescens-aktivert cellesortering skanner. Cellesyklus distribusjon ble analysert med Cell quest software.
Statistiske analyser
statistiske analysene ble utført ved hjelp av SPSS versjon 19 programvare. Uttrykket analyse av CMTM3 mellom testikkelkreft vev og de tilsvarende tilstøtende vev ble vurdert ved hjelp av Students t-test. Sammenlikninger av kategoriske variabler ble utført ved anvendelse av x
2-test eller 2-tailed t-test. Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant dersom ap verdien var mindre enn 0,05.
Resultater
CMTM3 er ofte nedregulert i testikkelkreft kreft
For å undersøke CMTM3 rolle i urogenitale kreft, må vi først spørres den Oncomine databasen [21] for å vurdere de relative uttrykk nivåer av
CMTM3
i urogenitale kreft. To uavhengige studier viste at
CMTM3
uttrykk ble statistisk signifikant redusert i testikkelsvulster [22], [23] (figur 1A, 1B). Vi har også målt
CMTM3
mRNA nivåer i 10 urogenitale kreftcellelinjer. Sammenlignet med den høye uttrykk for
CMTM3
i normale menneskelige testis vev, uttrykk for
CMTM3
ble stille i en seminom cellelinje (NCCIT) og nedregulert eller brakt til taushet i to av fire prostata cancercellelinjer, 2 av 3 renale kreftcellelinjer, og i ingen av blæretumorcellelinjer undersøkt (figur 1C). Vi videre analysert uttrykk for
CMTM3
i 20 parvise testis tumorvev og tilsvarende godartede tilstøtende vev.
CMTM3
mRNA nivåer ble brakt til taushet eller sterkt nedregulert i 16 av 20 testikkel krefttilfeller med en samlet 5-fold nedgang sammenlignet med tilsvarende godartet nærliggende vev (
P
= 0,002) (figur 1D) . Resultatene ble bekreftet i proteinnivåer ved immunhistokjemisk farging (figur 1E).
(A og B) Ekspresjon av CMTM3 i enkelte prøver fra normale testis vev eller testikkelkreft er vist (data normalisert til den log2 skala fra de Sperger datasett [23] og Korkola [22]). Sammenligninger mellom grupper ble utført ved hjelp av Student t test, med P-verdiene angitt i hvert panel. (C) Et uttrykk for
CMTM3
i normalt vev og testis urogenitale cancercellelinjer ble bestemt ved sanntids RT-PCR. Data er vist som gjennomsnitt ± S.D. for tre uavhengige eksperimenter. (D) Uttrykket av
cmtm
3 i 20 testiklene vevsprøver og sammenkoblede normale testis vev ble bestemt ved real-time RT-PCR. Data er vist som gjennomsnitt ± S.D. fra tre uavhengige eksperimenter. (E) Representant immunhistokjemi farging for CMTM3 i testiklene vevsprøver og sammenkoblede normale testis vev.
I tillegg utvidet vi analysen av CMTM3 uttrykk for en uavhengig kohort av testis tissue microarray ved immunhistokjemi (tabell 1, Figur S1 i File S1). Av 75 tilfeller av testis svulster, 36 (48%) tilfeller av svulster viste ingen CMTM3 uttrykk, 27 (36%) tilfeller av svulster hadde lav CMTM3 uttrykk, og 12 (16%) tilfeller av svulsten hadde moderat CMTM3 uttrykk. Alle saker av 18 (100%) av kreft tilstøtende normale vev og normal testikkelvevet hadde intensiv eller sterk intensiv CMTM3 uttrykk (tabell 1). Hele 8 (100%) ved atrofi hadde intensiv CMTM3 uttrykk. Viktigere, ble det ikke observert noen eneste tilfelle hvor CMTM3 flekker var mer intens i svulsten enn i normal testikkel, noe som ytterligere fremhever spesifisiteten av den observerte mønster (tabell 1). Vi har også undersøkt sammenhengen mellom CMTM3 uttrykk i seminom med patologiske parametre, og la merke til at redusert CMTM3 er signifikant assosiert med avansert T stadium (tabell S2 i File S1).
Re-uttrykk for CMTM3 hemmer celle vekst og celle migrasjon
stanse av
CMTM3
i testikkelkreft indikerte at CMTM3 kan være en funksjonell tumor suppressor i testikkelkreftutvikling. For å undersøke den veksthemmende effekt på
CMTM3
, re-ekspresjon av
CMTM3
de forbigående infiserte NCCIT-celler ble bekreftet ved RT-PCR og Western blotting (figur 2A). Som vist i figur 2B, ble cellevekst betydelig redusert i Ad
CMTM3
-infected NCCIT celler sammenlignet med Ad-null-infiserte kontrollceller. Den undertrykkende virkning på kreftcellevekst ble ytterligere bekreftet ved en kolonidannelse assay. Colony tallene ble betydelig redusert sammenlignet med kontrollcellene til 32% i NCCIT celler infisert med Ad-
CMTM3 product: (P 0,01). (Figur 2C)
(A) Uttrykk for CMTM3 i NCCIT celler etter infeksjon med Ad-CMTM3 ble bekreftet ved hjelp av RT-PCR og Western blot. (B) Celleproliferering ble oppdaget av WST-1-analysen i NCCIT celler etter infeksjon med Ad-null eller adresse
CMTM3
. (C) Representative resultater av kolonidannelses analyser med NCCIT celler. (D) Migration ble bestemt av en sårhelende analysen i NCCIT celler infisert med Ad-null eller adresse
CMTM3
. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
I tillegg er effekten av CMTM3 på testikkelkreft celle motilitet ble undersøkt ved en sårhelende analysen. Sammenflytende monolag av celler ble skrapet for dannelse av sår og deretter dyrket i 24 timer. Ektopisk CMTM3 uttrykk ført til betydelig redusert sårheling celle migrasjon i forhold til Ad-null-infiserte celler (figur 2D). Ad
CMTM3
-transfected celler ble rund og frittliggende, mens ingen åpenbare endringen ble observert i Ad-null-infiserte celler, som er konsistent med en tidligere rapport [8].
Re- uttrykk for CMTM3 induserer cellesyklus arrest i G2 fag og celle apoptose
den merkede undertrykkelse av spredning av CMTM3 bedt oss om å evaluere effekten av CMTM3 på cellesyklus distribusjon og apoptose av testikkelkreft celler. Representative resultatene av cellesyklus distribusjon i Ad-null- eller adresse
CMTM3
-infected NCCIT celler er vist i figur 3A. Strømningscytometri-analyse viste en signifikant G2-cellesyklusarrest i CMTM3-uttrykkende celler sammenlignet med kontroll-infiserte celler (figur 3A).
(A) Representative cellesyklusanalyse. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± S.D og er basert på tre uavhengige eksperimenter (p 0,01). G1 og G2 faser i rødt, S faser i hvitt. (B) NCCIT celler infisert med Ad-null og adresse
CMTM3
ble merket med FITC-Annexin V /PI, og apoptose ble vurdert ved flowcytometri. (C) Western blot analyse av celle cycle- og apoptose relaterte proteiner i Ad-null- og adresse
CMTM3
-infected NCCIT celler. β-aktin ble benyttet som en kontroll. Alle forsøkene ble utført tre ganger. (D) En skjematisk illustrasjon av den foreslåtte modellen viser en p53-uavhengige apoptose veien i testikkelsvulster.
Vi undersøkte også apoptotisk effekt av CMTM3 i testikkelkreft celler ved hjelp Annexin V-FITC /PI farging analyser. Andelen Annexin V-positive /PI-positive celler økte med 15,4% i Ad
CMTM3
-transduced NCCIT celler (figur 3B). Disse resultatene indikerer at den hemmende effekt på celleproliferasjon ved CMTM3 er mest sannsynlig mediert av G2 cellesyklus og apoptose.
CMTM3 induserer cellesyklus og apoptose i en p53-uavhengig måte
Å utforske den molekylære mekanismen for CMTM3-indusert cellesyklus arrest, vurdert vi effekten av CMTM3 re-uttrykk på uttrykk for cellesyklusen regulator, p21. Som vist i figur 3C, kan CMTM3 øke mRNA og proteinnivåer p21.
For å bestemme molekylære mekanismen av CMTM3-indusert apoptose, benyttet vi den menneskelige apoptose RT
2 Profiler PCR Array, som inneholder 84 kjente apoptotiske gener, for å overvåke uttrykk profiler av NCCIT celler infisert med Ad-
CMTM3
. Til vår overraskelse, viste resultatene at
TP53
og en rekke gener (
APAF1
,
BAX
, og
BCL10
) var betydelig opp- regulert (tabell 2). Disse resultatene ble bekreftet av qPCR med forskjellige primere enn de som brukes i PCR-matrisen. Protein nivåer ble også økt med en tilsvarende størrelse (figur 3C, tabell 2).
Neste, vi utforsket aktivering av apoptotiske sti ved Western-analyse. Som vist i figur 3C, ble spaltet caspase-3-fragmentet markert øket, mens pro-kaspase-3 ble markert redusert i CMTM3 re-uttrykkende testikkelkreft celler sammenlignet med kontroller (figur 3C). Re-uttrykke CMTM3 også markert fremmet caspase-9 protein uttrykk i testikkelkreftceller. I mellomtiden ble økt spaltet poly (ADP-ribose) polymerase observert i CMTM3-transfekterte celler, men var sjelden påvist i kontrollceller (Figur 3C). Disse dataene antyder at CMTM3 forenkler testikkelkreft celle apoptose i en p53-uavhengig måte, som p53 er ikke fullt funksjonell i NCCIT celler [24] (figur 3D).
metylering av en bestemt, enkelt CpG område i klinisk testikkelkreft prøver er signifikant assosiert med CMTM3 avskrift uttrykk
Som epigenetisk regulering er involvert i uttrykket av
CMTM3 product: [8], spurte vi om
CMTM3
promoter DNA metylering er assosiert med en tilsvarende reduksjon i CMTM3 uttrykk i testikkelkreft kreft.
for å definere den promoter regionen kontrollere
CMTM3
uttrykk, en serie med avkortede promoter konstruksjonene ble generert og satt inn i pGL3 luciferase reporter vektorer, og aktiviteten til promotoren ble bestemt ved å analysere for luciferase. Som vist i figur 4A, er den mest betydelige promoter-aktivitet funnet i en ~400 bp fragment (-343 til -83 bp fra start kodonet området). To antatte bindingsseter for Sp1 /SP3 elementer i ~400 bp-fragmentet ble identifisert ved transkripsjonsfaktor-motivet prediksjon programmer.
(A) Promoter aktivitet av humane CMTM3 delesjonskonstruksjonene i 293ft og PC3-celler. Cellene ble transfektert med 0,8 ug pGL3-basis eller luciferase reporter-konstrukter inneholdende forskjellige størrelser promotorfragmenter. (B) Effekter av SP1 /SP3 på reporter genuttrykk. 293ft og PC3 cellene ble transfektert med pCMV-
SP1 /SP3
ekspresjonsplasmider eller tom vektor som en kontroll. (C) Et promoter fragment (PGL-D) og in vitro-metylert fragment (PGL-PD SSSI) ble transfektert inn i 293ft og PC3-celler, og et luciferase-assay ble utført. Alle konstruksjoner ble kotransfektert med pRLSV40 vektor som en intern kontroll for transfeksjonseffektivitet. Luciferase-aktivitet er uttrykt som prosent aktivitet av kontrollen. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SE
For å bekrefte om den aktuelle
cis
-acting elementer, SP1 og SP3, er involvert i reguleringen av
CMTM3
genuttrykk, 293ft og PC3 cellene ble ko-transfektert med konstruksjonen pGL3-
PD Hotell og pCMV-
SP1
eller pCMV-
sp3
. Luciferasereportergenet analyser viste at overekspresjon av SP1 eller sp3 kunne gi en betydelig økning
CMTM3
promoter aktivitet (figur 4B). Videre ble CMTM3 promoter aktivitet reduseres dramatisk etter metylering (Figur 4C).
neste utførte bisulfite sekvensering av 53 CpG steder, inkludert
CMTM3
kjerne promoter-regionen (-353 til 126 bp fra start kodon stedet) på 13 parvise primære testis tumorprøver (figur 5A). Resultatene viste at en enkelt CpG nettsted på -155 bp, som ligger i krysset mellom de to SP1 /SP3 bindingsseter, ble mer betydelig metylert i tumorvev (40,4% og 9,0%, henholdsvis), der
CMTM3
ble nedregulert, enn i tilsvarende ikke-tumorvev (figur 5B). Ingen signifikant DNA-metylering ble observert i den andre 52 CpG områder. En statistisk signifikant omvendt forbindelse ble observert mellom metylering av den eneste CpG området på -155 bp og nivået av
CMTM3
mRNA-ekspresjon i kliniske prøver (
P
= 0,01, R «sup> 2 = 0,246) (figur 5C). Dette funnet tyder på at
CMTM3
transkripsjon i testikkelkreft er bestemt, i hvert fall delvis, ved metylering av en bestemt, enkelt CpG området innenfor
CMTM3
promoter-regionen.
(A) Skjematisk struktur av CMTM3 genet, CpG-øyer, antatte transkripsjonsfaktorbindingsseter og transkripsjonsstartsetet. Exoner er indikert med rektangler grønne. Translasjonsstartsetet er angitt med en buet pil. Pilen nedover indikerer potensialet bindingssetet for SP1 /SP3. BGS primere for metylering analyser er angitt. (B) metylering av den CMTM3 promoter-regionen ble analysert ved BGS. Den metylering av 8 CpG steder i kjernen promoter regionen for tre paret svulst og tilhørende godartede tilstøtende vev er vist. (C) Et metylering av det indre CpG området på -155 bp av CMTM3 promotorområdet for 13 sammenkoblet tumor og tilsvarende benigne tilstøtende vev, plottet som den CMTM3 mRNA-ekspresjon i testikkelkreft vev. En statistisk signifikant negativ korrelasjon er observert. Pearson korrelasjon, p = 0,01, R
2 = 0,246.
Diskusjoner
CMTM3
er sterkt uttrykt i normale testikler [25], men dens rolle i testikkelkreft fortsatt ukjent. I denne studien fant vi at
CMTM3
ble ofte nedregulert eller brakt til taushet i testikkelkreft cellelinjer og primære svulster (figur 1, tabell 1) .Vi videre utført funksjonelle studier i NCCIT celler til å avsløre den biologiske funksjonen til CMTM3. Vi fant at den re-ekspresjon av CMTM3 sterkt nedsatt NCCIT celle motilitet og trykkes kolonidannelse (figur 2), som var i samsvar med tidligere rapporter i andre kreft [8], [13]. Cellesyklusanalyse viste at CMTM3 hemmet celleproliferasjon ved å øke andelen av celler i G2-fasen og fremmer celle apoptose (figur 3A, 3B). Disse data antydet at CMTM3 fungerer som en tumor suppressor i TGCTs. Tidligere studier har vist at cmtm familie proteiner, inkludert CMTM3 [8], CMTM5 [26], [27] og CMTM8 [28], [29], kan indusere celle apoptose. Men den apoptotiske sti og mekanismen forblir unnvikende. I denne studien fant vi at den re-uttrykk for CMTM3 i NCCIT celler fremmet transkripsjon av
TP53
,
P21
, og
BAX
, og økt protein nivåer av samme størrelsesorden (tabell 2, figur 3C). p53 er ikke fullt ut funksjonell i NCCIT celler, noe som tyder på at det ikke er noen klar sammenheng mellom trans-aktivering av p53 og induksjon av apoptose i NCCIT celler [24]. Imidlertid p21 ble betydelig økt. Dermed ble det åpnet hevet som CMTM3 kan indusere en G2 cellesyklus arrest og lette celle apoptose gjennom p21 eller andre baner i en p53-uavhengig måte, som rapportert i andre studier (Figur 3D) [30] -. [32]
nedregulering av tumor-suppressorer er forbundet med transkripsjonen hemming gjennom induksjon av undertrykkende epigenetiske modifikasjoner i promoteren, inkludert DNA-metylering og histon modifisering [33].
