Abstract
Lungekreft den vanligste kreftformen og den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis. Mens røyking er den klart største årsaken til lungekreft, andre miljømessige og genetiske faktorer påvirker utvikling og progresjon av kreft. Siden unike mutasjoner mønstre har blitt observert i enkelte kreftprøver, identifisering og karakterisering av den særegne lungekreft molekylære profil er viktig for å utvikle mer effektive og skreddersydd behandling. Inntil nylig, til personlig DNA-sekvensering identifisere genetiske mutasjoner i kreft var upraktisk og dyrt. De nye teknologiske fremskritt i neste generasjons DNA-sekvensering, slik som halvlederbaserte Ion Torrent sekvensering plattform, har gjort DNA-sekvensering kostnadseffektiv og tidseffektiv med mer pålitelige resultater. Bruke Ion Torrent Ampliseq Cancer Panel, sekvensert vi 737 loci fra 45 kreftrelaterte gener for å identifisere genetiske mutasjoner i 76 humane lungekreft prøver. Sekvenser Analysen avdekket missense mutasjoner i KRAS, EGFR og TP53 gener i brystkreft prøver av ulike histologiske typer. Dermed denne studien viser nødvendigheten av å sekvensere individuelle menneske kreft for å utvikle personlige narkotika eller kombinasjonsterapier for effektivt å målrette enkelte, brystkreftspesifikke mutasjoner
Citation. Cai X, Sheng J, Tang C, Nandakumar V, Ye H, Ji H, et al. (2014) Hyppige Mutasjoner i EGFR, KRAS og TP53 Gener i Menneskelig Lung Cancer Svulster oppdaget av Ion Torrent DNA-sekvensering. PLoS ONE 9 (4): e95228. doi: 10,1371 /journal.pone.0095228
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 25. juli 2013, Godkjent: 25 mars 2014; Publisert: 23 april 2014
Copyright: © 2014 Cai et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation i Kina, Wu Jieping Foundation og National Institute of Health (R01 CA90427 R01 AI084811 til SY Chen). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Chuanning Tang, Hua Ye Feng Lou, Dandan Zhang Hong Sun, Haichao Dong , Guangchun Zhang, Zhiyuan Liu, Zhishou Dong, Baishuai Guo, Han Yan, Chaowei Yan, Lum Wang, Ziyi Su, og Yangyang Li er ansatte i San dalen Bioteknologi, Inc. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS One politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Lungekreft er den vanligste kreftformen i verden, og også den ledende årsak til kreft dødsfall. I 2008 ble anslagsvis 1,61 millioner nye tilfeller rapportert globalt, sto for 12,7% av alle nye krefttilfeller [1]. I tillegg ble ca. 1.38 million dødsfall (18,2% av total kreftdødsfall) rapporterte rundt om i verden [2]. I Kina har lungekreft den høyeste forekomsten av alle nye krefttilfeller i både menn og kvinner (21,7% i 2008) med mer enn en 24,9% dødelighet [2]. Kvinner i Kina rapporteres bare en litt høyere forekomst av lungekreft enn brystkreft samme år; imidlertid, er dødeligheten av lungekreft mer enn 3 ganger høyere enn for brystkreft (20,2% vs. 6,1%, henholdsvis) [2]. Lungekreft viser ofte uspesifikke symptomer, og diagnosen ofte oppstår på et avansert stadium eller etter metastase allerede har skjedd [3]. Mens arbeidet fortsetter å forbedre tidlig diagnostisering og behandling av lungekreft, svimlende forekomsten, dårlig prognose, og betydelig dødelighet råder.
Den viktigste årsaken til lungekreft er røyking, og økt eksponering er direkte korrelert med en økt risiko for utvikling av lungekreft [4]. 85-90% av lungekreft dødsfall er forbundet med røyking, og nåværende røykere er 15 ganger mer sannsynlig å dø av lungekreft enn aldri-røykerne [5]. Det er to hovedformer av lungekreft: ikke-små-celle lungekreft (NSCLC) og småcellet lungekreft (SCLC). NSCLC, som står for omtrent 85% av alle lungekrefttilfellene, kan videre deles inn i tre store histologiske undergrupper: plateepitelkreft (SCC), adenokarsinom og stor-celle lungekreft. Mens røyking kan tilskrives alle former for lungekreft, er det som oftest knyttet til SCLC og SCC. Aldri-røykere, på den annen side, er oftest diagnostisert med adenokarsinom [3], [5]. Interessant nok bare 10-24% av røykere utvikle lungekreft, noe som indikerer viktigheten av andre miljømessige og individuelle genetiske faktorer [6], [7]. Bortsett fra tobakksrøyk, andre etiologiske og risikofaktorer er identifisert, inkludert okkupasjon, eksponering for passiv røyking, asbest, radon gass, og luftforurensning, i tillegg til genetiske faktorer [8] – [10]. Omtrent 10-15% av lungekrefttilfellene oppstår hos pasienter som rapporterer aldri har røykt, og disse kreftformene gjør det spontant med en opphopning av genetiske og epigenetiske forandringer [5].
Til tross for pågående arbeidet med å forbedre screening og behandling av lunge kreft, prognosen for pasienter med de fleste former for lungekreft forblir dårlig [3]. Fordi de genetiske og miljømessige faktorer som forårsaker lungecancer variere innen vide grenser, har hver tumor potensiale til å oppvise en unik genmutasjon profil. Som sådan, samler bevis tyder på at individualisert, skreddersydd behandling er avgjørende for effektiv behandling mot lungekreft. Dette kan oppnås ved profilering et individs kreft genom for å dissekere onkogene mekanismene som regulerer utviklingen av kreft. Nylig har en ny teknologi basert på halvledere sekvense kalles Ion Torrent sekvensering [11] er å takle mange av problemene forbundet med andre sekvenseringsmetoder, nemlig kostnader, tid, og mange praktiske fordeler av individualisert genomsekvensering. I denne studien har vi brukt Ion Torrent sekvensering for å analysere 76 kliniske lungekreft prøver å identifisere de genetiske mutasjoner i 737 loci av 45 kjente kreftrelaterte gener.
Resultater
Mutasjon analyse av menneskelig kreftsvulster med Ion Ampliseq Cancer Panel
lunge
totalt 76 lungekreft~~POS=TRUNC prøver (Tabell 1) ble analysert ved hjelp av Ion Torrent Ampliseq Cancer Panel å identifisere mutasjoner i 737 loci av 45 onkogener og tumorsuppressorgener i humane lungekrefttilfellene . Disse Lungekreft prøvene var alt fra kinesiske pasienter som strekker seg fra 28-80 år representert med 40 menn med en gjennomsnittsalder på 62 år og 36 kvinner med en gjennomsnittsalder på 59 år.
sekvensert data ble behandlet og mutasjoner identifisert ved hjelp av Ion Torrent Suite programvare v3.0 med en plug-in «variant som ringer». For å eliminere feil basen ringer, ble tre filtreringstrinn som brukes til å generere pålitelig variant ringer som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Sekvensen lese fordeling over 189 amplikonene som genereres fra 76 FFPE-prøver ble normalisert til 300 000 leser per prøve (fig. 1). Ved hjelp av en streng standard variant kall, identifiserte vi mutasjoner i de følgende gener som er oppført i tabell 1. BRAF, EGFR, erbB2, KRAS, PIK3CA, PTEN, SMAD4, og TP53
A. Fordeling av gjennomsnittlig dekning av hvert fragment. Dataene er vist som gjennomsnitt ± SD. B. Antall amplikonene med en gitt lese dybde, sortert i skuffer av 100 leser. (Blå søyler dagens antall mål amplikonene innenfor lese- dybde, presenterer rød linje% av målet amplikonene = lese dybde)
Prøvene ble klassifisert basert på deres opprinnelse som lunge adenokarsinom, stor celle lunge. karsinom, lunge plateepitelkarsinom og lunge nevroendokrin kreft. De ulike stadier av kreft har kommet til ble scoret basert på «American Joint Committee on Cancer /Tumor størrelse, lymfeknuter berørt, metastaser (AJCC /TNM)» system (Ia, Ib, IIa, IIb, Ula, Illb) og som metastasering og ikke-metastasering lunge kreft. Også kreft ble sortert ut som fra storrøykere, lys-røykere og ikke-røykere å sjekke korrelasjonen av røyking med opphopning av disse mutasjonene. Den detaljerte listen over missense punktmutasjoner, insersjoner og delesjoner profilert på 737 loci av 76 lungekreft prøvene er gitt i tabell S1.
Av de identifiserte mutasjoner i vårt prøvesett, BRAF (2,6%), EGFR (42,1%), erbB2 (1,3%), KRAS (5,3%), PIK3CA (2,6%), PTEN (1,3%), SMAD4 (1,3%), og TP53 (22,4%) som påløper den høyeste forekomsten av mutasjoner (tabell 2 ). Mutasjonsfrekvenser på sine ulike differensieringsnivåer (tabell 3), på ulike AJCC iscenesettelse (tabell 4), av metastatiske og ikke-metastatisk lungekreft (tabell 5) og fra pasienter med ulike røykevaner (tabell 6) er skissert i tabeller. Detaljert sekvensering analyse i eksoner og funksjonelle domener av disse genene ble dermed utført.
missense mutasjon fordeling i eksoner og funksjonelle domener av EGFR
ut av 76 sekvensert lungekreft prøver, 36,1% av EGFR mutasjoner var missense sammen ekson 19, 50,0% var missense sammen ekson 21, 5,6% sammen ekson 20 og 8,3% sammen ekson 18 (fig. 2A). Disse mutasjonene var i og rundt tyrosin kinase domene av EGFR (fig. 2B-3C). Aktiverende mutasjoner i tyrosinkinasedomene av
EGFR
genet stimulerer protein-tyrosin-kinase, noe som fører til aktivering av signalveier assosiert med cellevekst og overlevelse. Mutasjoner i det ekstracellulære domene av EGFR er ofte forbundet med amplifikasjon av gener i andre kreft [12]. 57,7% av EGFR-assosiert lungekreft var adenokarsinomer (tabell 2) og 86,7% av EGFR mutasjoner assosiert med «høy differensiering «kreft (Tabell 3). I vårt utvalg satt 50% av EGFR-assosiert lunge kreft spredning til lokale regioner, 27,3% til lymphs og 46,2% av kreft spredning til fjerne organer i vårt utvalg sett (tabell 5).
A. Frekvenser av påviste mutasjoner i forskjellige eksoner. B. Mutasjon distribusjon i eksoner. C. Mutasjon distribusjon i funksjonelle domener.
A. Frekvenser av påviste mutasjoner i forskjellige eksoner. B. Mutasjon distribusjon i eksoner. C. Mutasjon distribusjon i funksjonelle domener.
missense mutasjon fordeling i eksoner og funksjonelle domener av KRAS
Ut av 76 sekvensert Lungekreftprøver, 100% av KRAS-mutasjoner var missense sammen exon 2 (fig. 3A). Den 34g t mutasjoner resulterer i en aminosyresubstitusjon i posisjon 12 i KRAS, fra en glycin (G) til et cystein (C), eller et valin (V). Den 64C en mutasjon resulterer i en aminosyresubstitusjon i posisjon 22 fra et glutamin (Q) til et lysin (K) i KRAS. Alle disse aminosyresubstitusjoner oppstått langs GTP-bindende domene av KRAS (Fig. 3A-C). KRAS binder seg til GTP i aktiv tilstand og besittelse av en iboende enzymatisk aktivitet som spalter terminalen fosfat av nucleotide, konvertere den til BNP. Ved konvertering av GTP til BNP, er KRAS slått av [13]. Resultatet av disse mutasjonene er konstitutiv aktivering av
KRAS
signalveier. Når den er slått på, rekrutterer det og aktiverer proteiner som er nødvendig for forplantning av vekstfaktor og andre reseptorer «signal, slik som c-Raf og PI3-kinase [13]. 7,7% av KRAS-forbundet lungekreft var adenokarsinomer (tabell 2) og 6,1% av KRAS-mutasjoner assosiert med «lav differensiering» kreft og 7,4% av KRAS-mutasjoner var «mid differensiering «kreft (Tabell 3). I vårt utvalg satt 6,3% av KRAS-forbundet lunge kreft spredning til lokale regioner, 9,1% til lymphs og 5,1% av kreft spredning til fjerne organer i vår prøvesett (tabell 5).
missense mutasjon fordeling i eksoner og funksjonelle domener av TP53
abnormitet av TP53-genet er en av de mest betydningsfulle hendelser i lungekreft og spiller en viktig rolle i tumordannelse av lunge epitelceller. P53 tumor suppressor-genet er lokalisert på kromosom 17p13 og spenner over 20 kb genomisk DNA som omfatter 11 exoner som koder for et 53KD fosfoprotein [14]. De fleste TP53 mutasjoner klynge i TP53 DNA-bindende domene, som omfatter exon 5 til 8 og strekker seg over omtrent 180 kodoner eller 540 nukleotider, og er ikke begrenset til noen bestemte sekvenser eller kodoner langs dette genet [15]. TP53 pådratt flere skadelige mutasjoner i vårt eksempelsett med 76 lungekreft, hovedsakelig langs den DNA-bindende domene kodet for av exon 5 (27,8%), 6 (16,7%) 7 (33,3%) 8 (16,7%), og langs oligomeriseringen domene kodet fra ekson 10 (15,6%) (fig. 4A-C). De fleste TP53 missense mutasjoner fører til syntesen av et stabilt protein, som mangler dets spesifikke DNA-binding og transaktivering funksjon og akkumuleres i cellekjernen. Slike mutante proteiner blir inaktive og mangler evnen til å transactivate nedstrøms målet gener som regulerer cellesyklus og apoptose [16]. Bortsett fra disse mutasjonene som påvirker rollen som TP53 som en svulst-suppressor protein, TP53 mutasjoner også gi gave til det muterte proteinet med «gain-of-funksjon» (GOF) aktiviteter som kan bidra aktivt til ulike stadier av tumorprogresjon, inkludert fjernmetastaser , og til økt motstand mot antikreftbehandlinger [17] – [19]. 50,0% av TP53-forbundet lungekreft var plateepitelkarsinom (tabell 2) og 20,0% av TP53 mutasjoner assosiert med «høy differensiering» kreft og 25,9% av TP53 mutasjoner var «mid differensiering «kreft (Tabell 3). I vårt utvalg satt 25,0% av TP53-tilknyttede lunge kreft spredning til lokale regioner, 54,5% til lymphs og 12,8% av kreft spredning til fjerne organer i vårt utvalg sett (tabell 5).
A. Frekvenser av påviste mutasjoner i forskjellige eksoner. B. Mutasjon distribusjon i eksoner. C. Mutasjon distribusjon i funksjonelle domener.
Flere mutasjoner og mutasjon hot spots i humane lungekrefttilfellene
Klinisk suksess med individualisert kombinasjonsbehandling er avhengig av identifisering av mutasjonskombinasjoner og mønstre for co -administration av en enkelt eller en kombinasjon av target midler mot de detekterte mutasjons kombinasjoner. Noen av mutasjonene som detekteres i vår tumor gruppe gjennom sekvensanalyse var ikke bare tilbakevendende og hyppig forekom, men også i kombinasjon med andre mutasjoner. Lunge cancer i vårt prøvesett inneholdt følgende: 64,5% av prøvene hadde minst én eller flere missense mutasjoner, 19,7% hadde minst to eller flere missense mutasjoner, 3,9% har minst tre eller flere missense mutasjoner, hadde 1,3% minst fire eller flere missense mutasjoner, og 35,5% av prøvene pådratt uten skadelige mutasjoner i en hvilken som helst av den siktede 13500 loci av potensialet tumor suppressor og onkogener (tabell 7).
diskusjon
som lungekreft er den vanligste kreftsykdommen og ledende årsak til kreft dødsfall over hele verden, er det pågående arbeidet forsøkte å forbedre forebygging, diagnostisering og effektiv behandling for pasienter med lungekreft. Foreløpig er det en rekke behandlingstilbud for lungekreft pasienter med kirurgi er den mest effektive for behandling av NSCLCs, og kjemoterapi med eller uten strålebehandling som standard behandling for SCLCs. Fordi de fleste SCLCs metastaserer tidlig å fjerne organer, er kirurgi ofte ineffektive i herding denne kreftformen. NSCLCs, på den annen side, er mer sannsynlig å forbli lokalisert under utvikling, og er således mer effektivt behandlet med kirurgiske inngrep. I tillegg SCLCs er vanligvis mye mer følsomme overfor kjemoterapi og /eller strålebehandling enn det som er NSCLCs [20], [21]. En utfordring i riktig klassifisering og behandling av lungekreft er den ekstreme heterogenitet forårsaket av ulike genetiske, biologiske og kliniske egenskaper, inkludert respons på behandling, med over 50 histologiske varianter anerkjent av WHO typing system [22], [23]. På grunn av dette, er korrekt klassifisering av lungekreft tilfellene er nødvendig for å sikre at pasienten mottar en optimal administrasjon [24].
På grunn av disse forskjellige nivåer av heterogenitet, kan gener behandlinger være mindre effektive. Alternativt målrettet terapi, som involverer bruk av spesielt utformede medikamenter for å selektivt målrette molekylære reaksjonsveier korrelert med den ondartede fenotypen til lungekreftceller, kan være mer nyttig [25]. Flere gener ofte funnet å være mutert i forskjellige lunge cancer er blitt rapportert, inkludert ALK /ELM4 fusjon, K-
ras
, EGFR, VEGF, og p53, men hele genetiske profilen av hver form er fortsatt ikke blitt fullstendig definert [3]. Dette viser nødvendigheten av sekvense individuelle menneskelige lunge cancer for å samsvare med bruk av en enkelt målrettet medikament eller to eller flere målrettede medikamenter i kombinasjon mot individuelle lungecancerspesifikke mutasjoner. I denne studien har vi brukt Ion Ampliseq Cancer Panel å sekvensere 13.500 loci i 45 kreftrelaterte gener, hovedsakelig onkogener og tumorsuppressorgener av 76 humane lungekreft prøver. Vi identifiserte hyppige mutasjoner i en gruppe av gener, inkludert EGFR, KRAS, og TP53 (tabell 2). Selv om de fleste av disse genene var allerede kjent å være assosiert med lungekreft, den muterte punktene og assosierte mutasjoner i andre gener var forskjellige i vår prøvesett (Tabell 7).
er det en økende bevissthet om endringene i lunge kreftceller i nyere tid, har nyere medikamenter som spesifikt retter disse endringene blitt utviklet. Disse målrettede medikamenter enten jobber sammen med cytostatika eller dem selv med mye lavere toksisitet på grunn av en selektiv effekt som et alternativ til en mer systemisk modulering av proteiner forbundet med onkogenese. EGFR-hemmere (Afatinib, Erlotinib og gefitinib) og VEGF-hemmere (bevacizumab) blir i dag brukt til målet behandlinger for NSCLC pasienter med mutasjoner i VEGF og EGFR [26]. Erlotinib er et medikament som blokkerer EGFR fra signale cellen til å vokse. Det hindrer utviklingen av lungekreft, spesielt i røykfrie kvinner, og er mest brukt i avansert NSCLC behandling som ikke var lydhør overfor kjemoterapi. Det er også brukt som første behandling hos pasienter med kreft har en mutasjon i
EGFR
genet [27]. Cetuximab er et monoklonalt antistoff som er rettet mot EGFR som også brukes i avansert NSCLC i kombinasjon med standard kjemoterapi som en del av førstelinjebehandling [28]. Som erlotinib, afatinib er et medikament som blokkerer veksten signal fra EGFR og brukes til avanserte NSCLCs som har mutasjoner i
EGFR
genet [29]. Noen yngre, ikke-røykere med adenokarsinomer er funnet å ha en ALK /EML4 fusjon onkogen som for tiden er et mål for stoffet Crizotinib [30]. Andre legemidler som i dag brukes til å behandle lungekreft er ikke genet spesifikke, og i stedet målet generelle molekylære stier som folat anitmetabolites (metotreksat og pemetrexed), mitotiske hemmere (docetaxel, piclitaxel, og vinorelbin), topoisomerase-hemmere (Etopophos og topotekan) og nukleosid -analoger som interfererer med DNA-syntese (carboplatin, cisplatin, og gemciabine) [31], [32]. Hemmere av EGFR-rettede tyrosin kinase er etablert for å være et effektivt behandlingsalternativ for avansert NSCLC som ikke responderer på kjemoterapi. Men EGFR-rettede monoklonale antistoffer i kombinasjon med platinabasert førstelinje kjemoterapi, cetuximab kombinert med cisplatin /vinorelbin og bevacizumab i kombinasjon med platinabasert kjemoterapi resulterte i bedre overlevelse sammenlignet med kjemoterapi alene hos pasienter med avansert EGFR-positive NSCLC [ ,,,0],33]. Andre målrettet terapi inkludert doble og fler kinase hemmere er i tidligere stadier av klinisk utvikling [34].
Med akkumulering av kunnskap og erfaring i neste generasjons teknologier, er det nødvendig å utvide vår forståelse i følsomheten spesifikke mutasjoner til individualisert behandling. Derfor, samle en komplett profil av mutasjoner i lungekreft for anvendelse av tilpasset og skreddersydd målrettet terapi er avgjørende for å utvikle fremtidige kreftbehandlinger. Vi tror en raskere og kostnadseffektiv genotyping verktøy som Ion Torrent sekvenseringsteknologi vil være svært gunstig for tildeling av slike spesifikke legemiddel i nær fremtid bruke for lungekrefttilfellene.
Materialer og metoder
etikk uttalelse
studiet er godkjent av human forskningsetiske komité for First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Kina. For Formalin fast og parafin innebygd (FFPE) tumorprøver fra svulstvev banken ved Institutt for patologi ved sykehuset, den institusjonelle etisk komité fravikes behovet for samtykke. Alle prøver og medisinske data som brukes i denne studien er irreversibelt anonymisert.
Pasientinformasjon
tumorprøver som brukes i studien ble samlet inn fra First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Kina. Totalt 76 FFPE- tumorprøver fra lungekreftpasienter ble analysert. Gjennomsnittsalderen for de 76 pasientene var 61 år (range: 28-80 år). Av disse 40 pasientene var menn med en gjennomsnittsalder på 61 år (range: 28-80 år), og 36 var kvinner med en gjennomsnittsalder på 61 (område: 36-75 år). Tumorprøver som brukes i studien ble samlet inn fra First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Kina. Totalt 76 FFPE- tumorprøver fra lungekreftpasienter ble analysert. Gjennomsnittsalderen for de 76 pasientene var 61 år (range: 28-80 år). Av disse 40 pasientene var menn med en gjennomsnittsalder på 61 år (range: 28-80 år), og 36 var kvinner med en gjennomsnittsalder på 61 (område: 36-75 år). 33 av de 76 pasientene (20 menn, 13 kvinner) ble gradert som lav patologisk differensiering; 27 (14 menn, 13 kvinner) på midten, 15 (6 menn, 9 kvinner) ved høy og 1 kvinner med ukjent differensiering. AJCC stadieinndeling er som følger: 0 pasienter på I eller Ia; 18 (10 menn og 8 kvinner) på scenen Ib; 3 (2 menn, 1 kvinne) på scenen IIa; 9 (5 menn, 4 kvinner) på scenen IIb; 26 (14 menn, 12 kvinner) på scenen IIIa; 8 (4 menn, 4 kvinner) på scenen IIIb; 0 pasienter ved stadium IIIc; og 12 (5 menn, 7 kvinner) på scenen IV. Ut av de totale 76 pasienter, 16 av de 40 mennene rapporterte ingen historie med røyking, mens ingen av de 36 kvinnene rapporterte å være røykere; 6 menn rapporterte lys røyke; 17 menn rapportert tunge røyking, og en mann med en ukjent røyking historie.
DNA forberedelse
DNA ble isolert fra FFPE-prøver etter deparaffinization og utvinning av 3-5 mikrometer tykk parafinsnitt i xylen, bruker QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) per produsentens instruksjoner.
Ion torrent PGM bibliotek forberedelse og sekvense
en Ion Torrent adapter-ligert bibliotek ble gjort etter produsentens protokoll for Ion AmpliSeq bibliotek Kit 2.0 (Life Technologies) (Part # 4475345 Rev. A). Kort, 50 ng sammenslåtte amplikonene var slutt reparert, og DNA ligase ble brukt for å ligere Ion Torrent adaptere P1 og A. Etter rensing med AMPure perler (Beckman Coulter, Brea, CA, USA), adapter-ligert produkter var nick-oversatt og PCR-amplifisert for en total av 5 sykluser. AMPure perler (Beckman Coulter) ble brukt til å rense den resulterende bibliotek og Agilent 2100 BioAnalyzer (Agilent Technologies) og Agilent BioAnalyzer DNA Høy følsomhet LabChip (Agilent Technologies) ble brukt for å bestemme konsentrasjonen og størrelsen på biblioteket.
Prøve emulsjon PCR, emulsjon bryte, og berikelse ble utført ved hjelp av Ion PGM 200 Xpress Mal Kit (Part # 4474280 Rev. B), i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, en inngang konsentrasjon av en DNA-templat kopi /ion-Sphere Partikler (ISP) ble tilsatt til emulsjonen PCR masterblanding, og emulsjonen som genereres ved hjelp av en IKADT-20 blander (Life Technologies). Deretter ISPer ble gjenvunnet og mal-positive ISPer ble beriket for bruk med Dynabeads MyOne streptavidin C1 perler (Life Technologies). ISP berikelse ble bekreftet ved hjelp av qubit 2,0 fluorometer (Life Technologies). 316 chips ble anvendt for sekvensering på Ion Torrent PGM for 65 sykluser, og prøvene ble strekkode. Ion PGM 200 Sequencing Kit ble brukt til sekvenseringsreaksjoner, som per anbefalte protokollen (Part # 4474004 Rev. B). Datasettet er avsatt til NIH Sequence Les Archive, og tiltredelse tallet er SRP028756 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?study=SRP028756).
Variant ringer
data~~POS=TRUNC fra PGM går ble behandlet i utgangspunktet bruker Ion Torrent plattformspesifikk rørledning programvare Torrent Suite for å generere sekvensen leser, trim adapter sekvenser, filter, og fjerne dårlig signal-profil leser. Initial variant ringer fra Ion AmpliSeq sekvense data er generert ved hjelp Torrent Suite programvare v3.0 med en plug-in «variant som ringer» program. For å eliminere feilaktige basen ringer, ble tre filtreringstrinn som brukes til å generere endelige variant ringer. Det første filteret ble satt til en gjennomsnittlig total dekning dybde 100, hver variant dekning ved 20, en variant frekvens for hver prøve 5, og P-verdi 0,01. For å eliminere feil basen ringer, ble flere filtreringstrinn som brukes til å generere endelige variant ringer (fig. S1.). Det første filteret ble satt til en gjennomsnittlig dybde på total dekning av 100, en hver variant dekning av 20, en variant frekvens for hver prøve 5 og P-verdi 0,01. Den andre filter ble ansatt ved visuelt undersøke mutasjoner ved hjelp Genomics Viewer (IGV) programvare (http //www.broadinstitute.org /IGV) eller Samtools programvare SAMtools programvare (https://samtools.sourceforge.net), samt av filtrere ut eventuelle trådspesifikk feil, altså. en mutasjon ble bare påvist i enten «+» eller «-» strand, men ikke i begge DNA-tråder. Den tredje filtrering trinnet ble satt som varianter innenfor 727 hotspots, i henhold til produsentens instruksjoner. Det siste filteret skritt var å eliminere varianter i amplicon AMPL339432 (PIK3CA, exon13, chr3: 178938822-178938906), som ikke er unik matchet i menneskelige genom. Fra vår sekvense driver med Ion Ampliseq Cancer Panel, ble falske sletting av data generert fra JAK2 genet locus og dermed sekvense data fra denne locus ble ekskludert fra videre analyse.
Somatiske mutasjoner
Detected mutasjoner ble sammenlignet med varianter i 1000 genomer prosjektet [35] og 6500 exomes av National Heart, Lung, and Blood Institute Exome Sekvense prosjektet [36] for å skille somatiske mutasjoner og germline mutasjoner.
Bioinformatical og eksperimentell validering anvendt
Vi brukte COSMIC [37] (versjon 64), MyCancerGenome database (https://www.mycancergenome.org/) og noen publikasjoner for å vurdere tilbakekomst mutasjoner i lungekreft (tabell S1). I tillegg ble noen oppdaget missense mutasjoner bekreftet av Sanger sin sekvensering (fig. S2).
Statistisk analyse
Vi velger tilbakekomst somatiske missense /i-del mutasjoner av lungekreft for å gjøre statistisk analyse.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Filter prosessen varianter. Merk: (a) Strand-partisk varianter ble eliminert ved hjelp av Genomics Viewer (IGV) programvare (http //www.broadinstitute.org /IGV); (B) Varianter i AMPL339432 bør fjernes, fordi dette amplicon er ikke unikt tilpasset PIK3CA i menneskelige genom; (C) Alle våre statistisk analyse var basert på dataene i blå boks
doi:. 10,1371 /journal.pone.0095228.s001 plakater (docx)
Figur S2.
Sanger valideringer av 15 varianter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0095228.s002 plakater (DOC)
Tabell S1.
Frekvenser av punktmutasjoner, innsetting og sletting mutasjoner i 737 loci av 76 humane lungekrefttilfellene
Doi:. 10.1371 /journal.pone.0095228.s003 plakater (DOCX)
Takk
Vi vil gjerne takke Rong Shi på Wu Jieping Foundation, Dr. Haibo Wang, Zhi Yu, Ying Li og andre medlemmer av San dalen Bioteknologi Inc. Beijing for deres hjelp i prøven og datainnsamling. Vi ønsker også å takke de ansatte på Beijing Military Hospital for deres generøse støtte for DNA-sekvensering og datainnsamling.
