Abstract
Tradisjonelle lungekreft behandlinger innebærer kjemiske eller strålebehandling etter kirurgisk svulst fjerning; Men disse framgangsmåter ofte drepe normale celler i tillegg. Nyere studier viser at kjemoterapi, når det kombineres med tradisjonell kinesisk medisin, kan tilby en ny måte å behandle kreft.
In vitro
tester som måler induksjon av autophagy og /eller apoptose ble anvendt for å undersøke cytotoksisiteten til SBPE, som vanligvis brukes for lungebetennelse på A549-cellelinjen. Resultatene indikerte at intercellulær nivåer av p62 og Atg12 ble økt, LC3-I ble spaltet inn i LC3-II, og autophagy ble indusert med SBPE bare. Etter 24 timer ble den apoptotiske mekanismen indusert. Dersom Cisplatin ble tilsatt etter at cellene nådde autophagy tilstanden, ble det observert synergistiske virkninger av de to kan oppnå tilstrekkelig død av lungekreftceller. Derfor kan den Cisplatin doseringen anvendt for å indusere apoptose bli redusert til det halve, og mengden av tid som er nødvendig for å oppnå den inhibitoriske konsentrasjon på 50% ble også halvparten av den opprinnelige. I tillegg til å fremkalle autofagi i en forkortet periode, den SBPE og kjemoterapi narkotika kombinasjonsbehandling var i stand til å oppnå målet om rask low-dose kreftcelle eliminering. Dessuten SBPE ble påført med gemcitabin eller paclitaxel, og funnet at kombinasjonsbehandling faktisk oppnå forbedrede lungekreft celledrepende effekt. Imidlertid kan SBPE også være mindre toksisk for normale celler
relasjon:. Tseng C-Y, Lin C-H, Wu L-Y, Wang J-S, Chung M-C, Chang J-F, et al. (2016) Potential kombinatoriske Anti-Cancer Therapy i ikke-småcellet lungekreft med tradisjonell kinesisk medisin Søn-Bai-Pi Extract og Cisplatin. PLoS ONE 11 (5): e0155469. doi: 10,1371 /journal.pone.0155469
Redaktør: Ying-Jan Wang, National Cheng Kung University, TAIWAN
mottatt: 29 februar 2016; Godkjent: 30 april 2016; Publisert: 12. mai 2016
Copyright: © 2016 Tseng et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:.. Dette arbeidet ble støttet av bevilgning fra departementet for vitenskap og teknologi (NSC-102-2320-B-033-001-My3) i Taiwan
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
I Taiwan, ca 10 000 nye lungekreft tilfeller oppstår hvert år, og 7000 mennesker dør av lunge kreft årlig [1], som er større enn de med kolorektal, cervical, bryst, prostata, og mage kreft kombinert. Disse tallene fortsetter å vokse raskt hvert år. Det er mange årsaker til lungekreft, og tidlige symptomene er ikke alltid åpenbare. Lungekreftpasienter er ofte ikke klar over de tidlige symptomer og savner muligheter for tidlig diagnose og behandling [2]. Ifølge Department of Health statistikk, passiv røyking, varme tjæredamp, stråling, asbest, fabrikken røyk, sot, fine suspenderte partikler, og støvstormer er de viktigste årsakene til lungekreft [3-14]. Lungekrefttilfellene er klassifisert som liten celle eller ikke-småcellet karsinom etter om de er ikke-epitelial eller epitel-avledet henholdsvis [15]. Små cell carcinomas er meget ondartet og kan lett metastasere, særlig hvis den cellestørrelsen er svært liten [16]. Derfor er kjemisk behandling den foretrukne løpet av behandling av småcellet karsinom [17-19]. Lateral tilfeller kan deles inn plateepitelkarsinom, adenokarsinom (inkludert bronchioloalveolar karsinom, også referert til som alveolar karsinom), stor celle karsinom, kjertel plateepitelkarsinom, karsinoider, bronkial adenokarsinom (inkludert adenoid cystisk karsinom eller mucinous epithelial karsinom), etc [15, 20, 21]. Behandlinger for disse typer kreft først og fremst innebære kirurgisk fjerning supplert med stråling og kjemoterapi [22, 23].
For behandling av konvensjonelle ikke-småcellet lungekreft etter kirurgisk inngrep, dreper kjemoterapi normale celler sammen med kreft seg . Jo lengre kjemoterapi fortsetter, jo sterkere motstand som er utviklet av kreftceller [24, 25]. Selv om denne behandlingsmetoden kan gi det ønskede resultatet, det øker også risikoen for samtidige sykdommer [25]. Høyere doser av cytostatika er nødvendig i løpet av de endestående stadier av kreft for å oppnå den samme effekten av lavere doser administreres i løpet av tidligere sykdomsstadier [20]. Bivirkningene av de tradisjonelle behandlingsmetodene gjør dem vanskeligere og mindre egnet for pasienter med mer avanserte stadier av kreft eller dårligere helse [26-29]. Basert på bivirkninger og skader forårsaket av disse terapi, nyere studier fokusert på kreftceller og betalt mer oppmerksomhet til mobilnettet immunterapi, genterapi, target medikamentell behandling, etc [30-34]. Noen studier prøvd å bruke urte medisiner til behandling av kreft [35-38]. Disse studiene indikerte at mange medisinske urter, for eksempel kinesisk barlind, Thalictrum formue, plumbagin, eller Ganoderma lucidum [39-42], ble funnet å redusere unormal betennelse [43-45] og raskt indusere tumor celle apoptose [46-48] .
Sun-Bai-Pi (SBP) er roten bark av hvitmorbær L. Ifølge Encyclopedia of tradisjonell kinesisk medisin «Compendium of Materia Medica,» SBP er et viktig legemiddel som brukes til å fjerne vanndamp fra lungene og å behandle spytter blod, oppvarmet tørst, ødem, fylde i magen, oppblåsthet, urin spor problemer, asthenic hodepine, indre energi mangel, hoste, betennelse, diabetes, kreft, hepatitt, og hjertesykdommer [49]. Tidligere studier indikerte at de viktigste ingrediensene i Sun-Bai Pi Extract (SBPE) inkludert Morusin, Prenylflavonoid, og Benzofuran [50-53]. Dette er antioksidanter som kan redusere NF-kB aktivitet i kreftceller, forårsaker cytotoksisitet, og hemmer kreft metastaser, men deres virkningsmekanisme er fremdeles uklart [54-57]. Derfor, i tillegg til å undersøke mekanismene for SBPE-indusert kreft celledød, trenger vi også å etablere et egnet synergistisk kreft behandling som kombinerer kinesisk urtemedisin og kjemoterapi narkotika. I denne studien fant vi at i tillegg til langsiktig apoptoseinduksjon, SBPE også indusert autofagi i A549 lungekreftceller. Når kjemoterapi stoffet, cisplatin, ble tilsatt til de autophagic A549-celler, og resultatene indikerte at SBPE forbedret kreftcelledrepende effektivitet av cytostatika selv ved reduserte doser.
Materialer og metoder
Chemical
SBP hentet fra Di Lian Sheng Pharmaceuticals (DLSP, Taiwan), som ble trukket ut av varmt vann i 30 minutter etterfulgt av centrifugtion, reserve dialyse og protein uttømming. Pelleten ble kassert, supernatanten ble oppsamlet og lagret ved 4 ° C. Cisplatin, gemcitabin, paclitaxel ble kjøpt fra Sigma-Aldrich.
Cell kultur
De menneskelige lungekreft alveolære A549 celler og normal lunge fibroblast WI 38VA13 underlinjen 2RA celler ble hentet fra Bioresource Collection and Research Centre (BCRC, Taiwan). Celler ble dyrket i Hams F-12K medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) med 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibco) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2. For eksperimentene ble cellene behandlet med SBPE for flere tidspunkter eller behandlet med SBPE i 6 timer etterfulgt av ytterligere eksponering cytostatika for flere tidspunkter.
MTS cytotoksisitetsanalyser
Levedyktighet ble oppdages ved hjelp av en kommersiell MTS analysen kjøpt fra Promega (Madison, WI), som måler mitokondriell succinatdehydrogenase aktivitet via konvertering av MTS og phenazinemethosulfate til formazan. Etter behandling, ble en blanding av 10 mL vann-oppløselige kit reagens pluss 190 ul friskt medium tilsatt til hver brønn i en 1 time inkubering ved 37 ° C i mørket. Supernatanter (100 ul /brønn) ble samlet, og absorbansen av den genererte formazan ble målt ved 490 nm med en microreader.
Autophagy immunfluorescens
Etter fiksering og permeabiliseringen, ikke-spesifikk reaktivitet ble blokkert av Tilsetningen av 2% normalt geiteserum med 0,02% NaN
3. De A549-celler ble deretter inkubert med primære anti-LC3 (Abcam) og anti-LAMPE-1 (Abcam) monoklonale antistoffer ved en 1: 200 fortynning i 24 timer, 4 ° C. Sekundært antistoff merket med Alexa Fluor 488 (Invitrogen) eller Alexa Fluor 594 (Invitrogen) ble brukt og lysbilder var dekket med Forleng Gold (Invitrogen) anti-fade montering media før bruk. Alle bildene ble observert på en Olympus IX51 mikroskop.
Måling av caspase 3-aktivitet
caspase aktivitet ble vurdert med hjelp av caspase-Glo 3/7 analysen kit (Promega). Etter SBPE behandling ble kultur platene fjernet fra inkubatoren og fikk innstilles til likevekt til romtemperatur i ca 30 min, deretter ble den Caspase-Glo 3/7 assay-reagens (200 ul /brønn) brukt i henhold til produsentens instruksjoner. Relativ Luminans enhet (RLU) som utsendes av produktet ble målt ved anvendelse av en microreader.
Western blot
proteiner (40 ug /brønn /sample) separert electrophorectically på SDS-geler ble overført til nitrocellulosemembraner. Uspesifikk reaktivitet av membranene ble blokkert, og primære anti-p62 (Abcam), anti-Atg-12 (Cell signalering), anti-p53 (Abcam), anti-LC3 (Abcam), anti-BCL-2 (Cell signalering) , anti-Bax (Cell signalering), anti-Bad (Cell signalering), anti- α-tubulin (Abcam) ble undersøkt med passende fortynninger. Sekundært geite-anti-muse-IgG eller anti-kanin-IgG konjugert med HRP ble brukt, og de Blottene ble visualisert ved forsterket kjemiluminescens (Promega ™ ECL Western blotting Substrate) og analysert på Odyssey infrarød avbildningssystem (Li-COR Biosciences) (Lincoln, NE).
Cell syklus analyse
Etter behandlingene, ble cellene samlet og fikset i iskald 75% etanol over natten ved -20 ° C. Cellene ble deretter sentrifugert ved 300 x g i 5 minutter og inkubert med en propidiumjodid (PI) arbeidsløsning (100 ug /ml PI og 100 mikrogram /ml RNaseA) i 30 minutter ved 37 ° C. Cellesyklus distribusjon ble analysert ved hjelp av en FACScan flowcytometer og analysert med hjelp ModFit programvare (Becton Dickinson, CA).
statistikker
For statistisk analyse, ble hvert eksperiment utført i tre eksemplarer og gjentatte tre ganger . Resultatene ble uttrykt som middel ± SD for tre uavhengige eksperimenter, og forskjellene mellom grupper ble analysert ved hjelp av Student t-test med GraphPad programvare statistikk. *, ** Og *** angir p 0,05, s 0,01, og p 0,001 betydelig forskjell, sammenlignet med den negative kontroll. # Og ## viser p 0,05 og p. 0,01, sammenlignet med prøver med eller uten SBPE-behandling
Resultater
celleviabilitet
Vi brukte MTS test for å detektere virkninger SBPE hadde på levedyktigheten til WI 38VA13 sublinje 2RA celler, normale lunge fibroblast-celler og A549 lungekreftceller. Som vist i figur 1a, har vi funnet at 24 timer etter administrering SBPE, ble vitalitet av A549-celler reduseres ettersom SBPE økes dosen. Den cellelevedyktigheten etter administrering av 5 mg /ml var 85%, IC50 ble oppnådd etter administrering av 9 mg /ml, og cellelevedyktigheten etter administrering av 10 mg /ml var 23%. Tvert imot, SBPE viste ingen signifikant toksisitet mot normale WI38-celler på det laveste dose som ble testet, men signifikant celledød oppstod i løpet av 24 timer etter behandling med SBPE på 5 og 10 mg /ml. Hvis SBPE doser på 5 mg /ml og 10 mg /ml ble brukt ved ulike tidspunkt, fant vi at SBPE medført betydelig celledød i løpet av 24 timer.
(a) Utført celle levedyktighet tester ved å administrere ulike konsentrasjoner av SBPE til WI38 og A549 celler. (B) gitt 5 mg /ml og 10 mg /ml av SBPE til A549 og inkuberes cellene i forskjellige tidspunkter. Deretter brukte vi MTS-reagens for å teste sine viabilities.
SBPE indusert Cancer Cell Autophagy Effect
For å vurdere mekanismen, antar vi at i forkant av celledød, SBPE induserer kreftcellene til å bli autophagic. Som vist i figur 2a og 2b, fluorescens mikroskopi observasjoner indikerte at uavhengig av SBPE dosering. Når de to fluoriserende farger ble lagt og kvantifisert, økte autolysosome innholdet gradvis over tid. Derfor er forholdet mellom autolysosome formasjon for celler som administreres med SBPE 10 mg /ml betydelig øket som en funksjon av SBPE dose (figur 2b). Etter forholdet forsterkning, den autophagosome og lysosomet overlaped, noe som indikerer at SBPE kan faktisk simulere A549 celler til å bli autophagic (figur 2c). Den statistiske diagrammet vist i figur 2d viste at innen 8 timer etter SBPE (10 mg /ml) behandlings, 70% av A549-celler generert lysosomale autophagy, og den hastigheten økt til 90% i løpet av 12 timer. Western blots (figur 2e) viste at p62 protein betydelig økt fire ganger den for kontrollgruppen (figur 2f) i løpet av 8 timer, og LC3-I ble spaltet inn i LC3-II i løpet av denne perioden. Disse resultatene betyr at SBPE behandling indusert kreftcellene til å bli autophagic, som toppet seg i løpet av åtte timer. I tillegg, med hjelp av autofagi inhibitor, klorokin (CQ) pluss SBPE (10 mg /ml), fant vi cellen levedyktighet ble betydelig restaurert på 6 timer og 24 timer etter behandling (S1 figur).
SBPE 5 mg /ml (a) og 10 mg /ml (b) ble henholdsvis tilsatt til cellene og inkubert i 2, 4, 6, 12 og 24 timer. Farging ble brukt til å merke autofagi protein LC3 (grønn), LAMP-en (rød), og DAPI (blå) kreftceller. Forstørrelse var 400X. (C) Forstørret cellene inkubert i seks timer ved 630x for å observere autophagy fordeling. (D) Overlegg av grønn fluorescens (LC3) og den røde fluorescens (LAMP-1), og beregnet antall celler med autophagic lysosomer. Den vertikale aksen representerer det totale celleantall per enhetsareal dividert med antall celler med autophagic lysosomene. (E) Western blot ble anvendt for å observere effekten SBPE hadde på reguleringen av A549-celle Autophagy relaterte proteiner, og fant at SBPE induserte celle autophagy, som økte med tiden og nådde en topp på åtte timer. Alle geler er blitt kjørt under de samme forsøksbetingelser. (F) Statistiske analyser for proteiner forestillinger.
SBPE apoptose
SBPE var cytotoksiske og frekvensen av autophagy induksjon styrket som dosering og administrasjon tid økt. Imidlertid er det fortsatt ukjent om forvaltning av SBPE mer enn 12 timer kan indusere kreftceller til å bli apoptotiske. Derfor ble den apoptotiske markørprotein Caspase3 /7 detekteres for å bestemme hvorvidt det er generert over tid. Fig 3a viser at ytelsen kapasitet på Caspase3 /7 innenfor A549 celler gjorde forsterke som SBPE administrasjonstid økt. Imidlertid forsterkning startet ved 12 timer og nådde toppen yteevne ved 24 timer. Basert på det foregående resultater, kan SBPE faktisk initiere apoptose mekanismen etter 12 timer og kan fremme tumorcelle autofagi innen åtte timer. Western blots (figur 3b) indikerte at manifestasjoner av den pro-apoptotiske proteiner p53, Bax, og Bad økt over tid, mens de anti-apoptotiske protein Bcl-2 betydelig redusert. I henhold til figur 3d, etter at A549 lungekreftceller ble behandlet med SBPE (10 mg /ml) i forskjellige tidsperioder, ble et flowcytometer som brukes til å observere cellefordelingen status i løpet av cellesyklusen. Resultatene indikerte at når eksponeringstiden økte, antall celler som er igjen i G1 fasen hadde en tendens til å øke, og forholdet mellom S-faseceller øket etter hvert som tiden gikk, men avtar etter å ha nådd toppen ved 12 timer.
(a) Etter administrasjon av SBPE 10 mg /ml; den Caspase3 /7 reagens ble brukt til å oppdage sine forestillinger. (B) Effektene som SBPE har på protein kontrollfaktorer i forbindelse med A549-celle apoptose og anti-apoptose. Alle geler er blitt kjørt under de samme forsøksbetingelser. (C) Statistisk diagrammet for protein ytelse. (D) FACS analyser for cellesyklus distribusjon og bruk av ModFit LT programvare for å analysere cellesyklus distribusjon.
Cisplatin og SBPE kombinasjonsterapi kan redusere kreft celleviabilitet
Ifølge fig 4, mellom 24 og 48 timer etter cisplatin ble administrert til A549 lungekreftceller, dets cytotoksiske effekter forsterkes som Cisplatin-konsentrasjonen øket. Imidlertid kan effekten bare nå IC50 48 timer etter at 25 mikrometer av Cisplatin ble administrert, og behandlingen kan bare føre til 33% celledød i 24 timer mark. Derfor har vi tatt i kombinasjonsterapi, fremgangsmåten hvorved SBPE ble administrert i seks timer, og cisplatin ble administrert i 24 timer. Målet var å bruke Cisplatin behandling for å drepe kreftceller etter celle autofagi har blitt stimulert i håp om at denne kombinasjonen metoden kan betydelig styrke cytotoksiske effekt samtidig redusere Cisplatin dosering. Som vist i figur 4a, ved administrering av 10 uM og 25 uM av Cisplatin i 48 timer etter at cellene ble forbehandlet med SBPE (5 mg /ml) i seks timer, kan kreftcellen levedyktighet bli redusert med 52% og 37%, respektivt . Sammenlignet med resultatene, har vi funnet at cellene forbehandlet med SBPE bare nødvendig Cisplatin 10 uM i 48 timer for å oppnå IC50, som er den samme ytelse som kan oppnås ved Cisplatin 25 uM alene ved det samme tidspunkt. Dersom Cisplatin konsentrasjonen økes til 25 uM, er tumorcelledrepende effekt forbedres. Som vist i figur 4b, hvis SBPE 10 mg /ml ble tilsatt før Cisplatin behandling i 24 timer, fant vi at kreftcelle viabilities etter 5 uM, 10 uM og 25 uM Cisplatin behandlinger kan bli redusert til 58%, 50%, og 36%, respektivt. Cisplatin 25 uM alene kan bare oppnå IC50 konsentrasjon ved 48 timer i fravær av SBPE. De cytotoksiske virkninger av cisplatin 10 pM kan oppnå IC50 etter behandling i 48 timer. Bevisene indikert at forbehandlet SBPE kan faktisk betydelig styrke kreftcelle cytotoksiske effektene av Cisplatin samtidig redusere Cisplatin dosering eller behandlingstiden.
A549 tumorcelleoverlevelsesrate analyser etter 1 mikrometer, 5 mikrometer, 10 mikrometer , og 25 uM av cisplatin ble administrert, og inkubert i 24 og 48 timer. MTS-reagens ble brukt til å oppdage overlevelse. Forbehandling med hjelp av SBPE 5 mg /ml (a) og SBPE 10 mg /ml (b) doser av cisplatin ble tilsatt og inkubert i 24 og 48 timer. MTS-reagens ble brukt til å oppdage overlevelse.
apoptose indusert av Cisplatin og SBPE kombinasjonsterapi
Vest-blotter ble brukt til å observere hvordan kombinasjonsbehandling endret regulering av apoptose proteiner (fig 5a); og resultatene indikerte at pro-apoptotiske proteiner p53 (figur 5b), Bax (figur 5d), og Bad (figur 5e) økte ettersom tiden kommet i løpet av 24 timer. Dette gjaldt spesielt for p53, som i betydelig øket etter bare 12 timer. Den anti-apoptotiske protein, Bcl-2, betydelig redusert som tiden kommet (figur 5c) og ble redusert med 32% etter 24 timer, som oppnådde effekten en dag tidligere enn 37% reduksjon som oppnås etter 48 timer da bare Cisplatin var administrert.
Apopthsis indusert ved SBPE og Cisplatin kombinasjonsbehandling (a) 6 timer etter behandling ved anvendelse av 10 mg /ml av SBPE og 25 uM av Cisplatin ble tilsatt og inkubert i 24 og 48 timer. Western blot ble brukt til å observere effekter på celle apoptose fenomen knyttet proteiner (p53, BCL-2, Bax, og Bad). Alle geler er blitt kjørt under de samme forsøksbetingelser. Kvantifisering Kart for p53 (b); BCL-2 (c); Bax (d); Bad (e).
Etablering av optimal SBPE konsentrasjon for å fremkalle kreft celle cytotoksisitet og en Optimal Tid for å administrere flere kjemoterapi narkotika
Vår cytotoksisitet analyser viste at så SBPE konsentrasjoner og behandlingstider økt så gjorde sitt cytotoksiske effekt. Derfor etablerte vi et forhold mellom A549 kreftceller, SBPE konsentrasjoner, og eksponeringstider for å optimalt indusere A549 celle autofagi (Figur 6). Ved hjelp av Matlab 2015a, gjennomførte vi en tredimensjonal kvantifisering av de eksisterende (a) cellelevedyktighet verdier; (b) SBPE konsentrasjoner; og (c) SBPE eksponeringstider for å avdekke eventuelle sammenhenger. I henhold til figur 2, har vi funnet at når den cellelevedyktighet hastigheten var på 70%, ble omtrent 70% av cellene indusert til å bli autophagic. På dette punktet, kan Cisplatin deretter tilsettes for å akselerere den cytotoksiske effekten av behandlingen. Ved en cellelevedyktighet på 70%, vi deretter plukket ti tidspunkter ved denne dosering og utledes et relasjonsuttrykk som brukes til å beregne sammenhengen mellom tid og SBPE dosering. Den relasjonelle uttrykket for den tid og dosering av SBPE på A549 lungekreft celle ko-inkubering var som følger: hvor
y
representerer middelkonsentrasjon gitt til cellene,
x
representerer gjennomføringstiden og 5,7665 er beregningen konstant.
MTS cytotoksisitet test påvisning verdi ble inngått MATLAB matematisk analyse programvare gjennom en statistisk programvare for å lage en tredimensjonal koordinere diagram på forholdet mellom konsentrasjon, tid og levedyktighet . XYZ var variablene. X-aksen representerer SBPE konsentrasjon X = [X, x1]; matriser X og X1 representerer SBPE konsentrasjoner på 0 mg /ml, 1 mg /ml, 5 mg /ml, 10 mg /ml, 25 mg /ml, og 50 mg /ml; Y-aksen representerer SBPE handling tid Y = [Y, Y1]; matriser Y og Y1 representerer 24 og 48 timer; Z-aksen representerer cellelevedyktighet Z = [Z, z1]; og matriser Z og z1 representerer viabilities etter SBPE administrasjon i 24 og 48 timer. Data matriser ble matet inn ved hjelp av surf-kommandoer og en tredimensjonal overflate diagram ble plottet. Fargene representerer handlings relasjoner mellom de tre.
Kontrollere Optimal dosering og konsentrasjon for SBPE å indusere Cancer Cell Autophagy
Ifølge figur 2, har vi funnet at når cellen levedyktighet hastigheten var på 70%, omtrent 70% av cellene ble indusert til å bli autophagic. Cisplatin kan legges på dette tidspunktet å akselerere cytotoksiske effekter. I henhold til fig 6 og den formel som er vist, for celler for å oppnå en autophagic tilstand, må cellene bli gitt SBPE for en viss tid for å få dem til å oppnå en 70% overlevelsesrate. Vi har utført MTS tester på SBPE 5 mg /ml (32 t), 6,25 mg /ml (30 timer), 7,5 mg /ml (16 timer), og 10 mg /ml (6 timer) for å bekrefte at denne tidsrammen gitt den optimale dosering og konsentrasjon for SBPE å indusere kreftcelle autofagi. Resultatene indikerte at cellelevedyktighet kan bli opprettholdt på 70%, som vist i fig 7a. Vi utførte fluorescens mikroskopi og funnet ut at LC3 overlappet med LAMP-en når SBPE ble administrert på disse 4 konsentrasjoner. Denne observasjonen representerte en overlapping av autophagosome og lysosome. Derfor administrere SBPE for en bestemt periode kan faktisk stimulere A549 celle autofagi (Fig 7b).
(a) Konsentrasjon og verifisering mot levedyktighet ble gjennomført i henhold til de matematiske analyseverdier generert av statistisk programvare MATLAB som vist i figur 6. SBPE konsentrasjoner på 5 mg /ml, 6,25 mg /ml, 7,5 mg /ml, og 10 mg /ml; tidsrammer var 32, 30, 16 og 6 timer; og MTS reagens ble brukt til å påvise deres aktiviteter. (B) Farging ble brukt til å merke autofagi protein, LC3; lysosomal markør, LAMP-1; og kjernefysisk markør, DAPI. Cellene ble inkubert i åtte timer, og ble forstørret ved 630x for å observere autophagy fordeling. Pilene viser autophagosomes (overlappet med grønn og rød).
Effekter som kombinerer SBPE til kjemoterapi narkotika gemcitabin og paklitaksel har på Cancer Cell Livskraftig Ranger
Ifølge figur 8, den cytotoksiske effekter av gemcitabin og paklitaksel innen 72 timer kan forbedres som SBPE konsentrasjonen økes. Imidlertid Gemcitabin kreves administrering av 100 uM i opp til 72 timer og Paclitaxel kreves administrering av 100 uM for opp til 48 timer for å oppnå IC50. I likhet med Cisplatin, vi pre-behandlet cellene med SBPE i seks timer, og deretter lagt til gemcitabin eller paklitaksel kombinasjon for å observere om SBPE kan signifikant øke den cytotoksiske effekten av gemcitabin eller paclitaxel samtidig redusere sin dose. Resultatene viste at etter behandling ved anvendelse av 50 uM av gemcitabin og paclitaxel i 48 timer, ble overlevelsesrater effektivt reduseres fra 78% til 44% og 65% til 45%, respektivt. Når sammenlignet med ikke-behandlede resultater (figur 8a og 8e), de SBPE forbehandles cellene bare kreves halve mengden av gemcitabin eller paclitaxel i 48 timer for å oppnå IC50.
(a) A549 svulst celle levedyktighet analyse etter administrasjon av gemcitabin. Etter 1 uM, 5 uM, 10 uM, 50 uM og 100 uM av gemcitabin ble administrert i 24 og 48 timer, ble MTS reagenset ble brukt til å påvise deres aktiviteter. For det andre, etter 6 timers behandling med 10 mg /ml av SBPE; Gemcitabin ble lagt i 24 timer (b), 48 timer (c) og 72 timer (d). (E) A549 tumor cellelevedyktighet analyse etter behandling med 1 uM, 5 uM, 10 uM, 50 uM og 100 uM av Paclitaxel og inkubert i 24 og 48 timer. MTS-reagens ble brukt til å påvise deres aktiviteter. For det andre, etter 6 timers behandling med 10 mg /ml av SBPE; Paclitaxel behandling ble innført i 24 timer (f), 48 timer (g) og 72 timer (h).
Diskusjoner
Det er mange bivirkninger forbundet med eksisterende tradisjonelle cytostatika [26-29]. For eksempel, Cisplatin, en kjemoterapi medikament som vanligvis brukes for å behandle lungekreft har en lang responstid, er utsatt for medikamentresistens, og langvarig anvendelse kan hemme apoptose eller produsere ubehagelige bivirkninger for pasientene [58]. En annen kjemoterapi narkotika, gemcitabin, kan føre til ubehagelige symptomer, som svimmelhet, oppkast, leukopeni, trombocytopeni, og nyretoksisitet [59]. Tradisjonell kinesisk urtemedisin har begynt å dukke opp som anti-kreft narkotika [35-38]. I dag er om lag to tredeler av kreftpasienter er i midten til slutten av stadium av sin diagnose på grunn av diagnostiske teknikk restriksjoner og redusert kirurgiske muligheter [2, 15-23]. Pasienter under disse avanserte stadier er for fysisk svake til å tåle traumer av kirurgi og giftige bivirkninger av cellegift. Konvensjonell kreft kirurgi, stråling og kjemoterapi behandlingsmetoder alle har begrensninger, for eksempel omfanget av pasientenes patologi, behandlingstiden, alder, fysisk tilstand, eksistensen av komplikasjoner, og narkotika allergier. Noen pasienter kan være motvillige til å akseptere disse behandlingsmetodene eller ville stoppe behandlingen på grunn av bivirkninger [2, 15-23]. Urte medisiner mangler disse restriksjonene og kan brukes i henhold til [60, 61]. Fordelene med urte medisiner er mer enn bare de cytotoksiske effekt mot kreftceller, de også forbedre fordelene fra fysisk form, indusere immun cytokiner, og styrke cellulær immunitet; derved, som gir beskyttelse mot kreft. Men det er ingen store kliniske studier med tradisjonell kinesisk medisin som gjentatte ganger viser deres «evidensbasert medisinsk» effekt. Derfor er kinesisk urtemedisin fortsatt blir klassifisert som sekundære og alternative legemidler for kreftbehandling.
I denne studien undersøkte vi om den tradisjonelle urtemedisin, SBPE kan indusere tumorcelle autofagi. Vi videre administrert Cisplatin å observere om SBPE kan drepe lungekreft celler samtidig redusere Cisplatin doser. Til slutt sammenlignet vi effekten produsert av andre cytostatika i håp om å etablere en kinesisk-vestlig kombinasjonsbehandling behandling. Våre resultater viste at SBPE ikke ville produsere signifikant cytotoksisitet til normale lunge epitelceller, men vil føre til lungekreft celledød under de samme konsentrasjoner. Vi fant også at lungekreftceller ville nå sin IC50 etter behandling med 10 mg /ml SBPE i 24 timer. Selv om mekanismen for SBPE nedre cytotoksisitet mot normale celler forblir ukjent, disse resultatene betyr at SBPE kan effektivt drepe lungekreft celler uten å skade normale celler.
Når autofagi skjer, LC3-merket autophagosomes danne autophagic lysosomer med LAMP-en -merkede lysosomer. Vi fant ut at SBPE kan indusere autofagi av A549 celler og dette ble mer tydelig ettersom tiden kommet. De autophagic lysosomer i de behandlede cellene nådde et maksimum volum åtte timer etter legemiddeladministrasjon. Ekspresjon av det merkede, lysosomal protein, p62, og den merkede, autophagosomal protein, Atg12, bekreftet våre fluoriserende data. Åtte timer etter legemiddeladministrering, LC3-I spaltes den maksimale mengden av LC3-II. Etter 12 timer begynte lungekreftceller til apoptose, gjenspeiles av øket protein ekspresjon av apoptotiske og pro-apoptotiske markører og den reduserte ekspresjon av anti-apoptotiske markør. Basert på resultatene omtalt ovenfor, kan SBPE indusere lungekreft celle apoptose etter autofagi. Imidlertid, selv om antallet celler i G1 fase hadde en tendens til å øke etter 24 timer i løpet av cellesyklusanalyse, antallet celler i G2 /M fasen ble ikke endret, og det var ingen tegn som viser at SBPE kan føre til cellesyklus-stans for kreftceller . Interessant er antall celler i S-fasen økte fra 31% til 38% som SPBE behandling tiden utviklet, men falt tilbake til 30% etter 24 timer. Årsaken til denne virkning er ikke kjent, men det antas at de fleste av cellene beveget seg mot apoptose og en liten del av cellene beveges langs G1 faserest etter 24 timer.
I henhold til figur 4, det tok 48 timer for å oppnå IC50 etter behandling av A549-celler med kjemoterapi stoffet, Cisplatin. Videre forskning funnet at forbehandling av lungekreftceller med 10 mg /ml SBPE i seks timer forårsaket 30% av de behandlede cellene dør og indusert autophagy i 50% av disse cellene. Kreftcelle overlevelsesrate en tendens til å avta i celler forbehandlet med SBPE sammenlignet med grupper som ikke ble forbehandlet. Videre Cisplatin konsentrasjon og behandlingstiden som kreves for å oppnå IC50 ble betydelig redusert. Tendensen diagram i figur 6 viste at jo større SBPE konsentrasjon og behandlingstiden, jo sterkere den cytotoksiske effekten innen 24 timer. Ifølge vår Matlab analyse diagram, fant vi at når konsentrasjonsnivåer nådd blå regionen i diagrammet, cytotoksisitet var nesten 80%. Behandling med 5 mg /ml i 24 timer SBPE redusert cellelevedyktighet med opptil 80%.
