Abstract
Modifisert gangliosider kan bli overuttrykt i visse typer kreft, og dermed blir de betraktet som en verdifull mål i kreft immunterapi. Strukturelle kunnskap om deres interaksjon med antistoffer er for tiden begrenset på grunn av den store størrelsen og høy fleksibilitet av disse ligandene. I denne studien bruker vi vår tidligere utviklet nettstedet kartlegging teknikk for å undersøke anerkjennelse av kreft-relaterte gangliosider av anti-gangliosid antistoffer. Resultatene viser en potensiell gangliosid-bindende motiv i de fire antistoffene undersøkt, hvilket antyder muligheten av strukturell konvergens i anti-gangliosid immunrespons. Det strukturelle grunnlaget for anerkjennelse av gangliosidantistoffer-mimetiske peptider er også undersøkt ved hjelp av nettstedet kartlegging og sammenlignet med gangliosid anerkjennelse. Peptidene er vist å fungere som etterligner strukturelle av gangliosider ved å kommunisere med mange av de samme bindingssted-rester som de beslektede karbohydrat epitoper. Disse studiene gir viktige ledetråder som den strukturelle grunnlaget for immunologisk etteraping av karbohydrater
Citation. Agostino M, Yuriev E, Ramsland PA (2012) Antistoff Anerkjennelse av kreft-relaterte gangliosider og deres Ligner Undersøkt Bruke
i silico
Site Mapping. PLoS ONE 7 (4): e35457. doi: 10,1371 /journal.pone.0035457
Redaktør: Bostjan Kobe, University of Queensland, Australia
mottatt: 6 februar 2012; Godkjent: 19 mars 2012; Publisert: 20 april 2012
Copyright: © 2012 Agostino et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av en liten bevilgning fra fakultet for farmasi og Pharmaceutical Sciences, Monash University, til EY. MA er en mottaker av Monash University Postgraduate Publication Award. PAR er Sir Zelman Cowen Forsker (Sir Zelman Cowen Fellowship Fund, Burnet Institute). Forfatterne ønsker å takke for bidraget til dette arbeidet av den viktorianske Operational Infrastructure Support Program mottatt av Burnet Institute. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Gangliosider er glykosfingolipider som har én eller flere sialinsyrerester. De er oftest assosiert med nervesystemet funksjon, hvor de spiller en avgjørende rolle i å opprettholde stabiliteten i myelin og aksoner [1]. Endringer i gangliosid-ekspresjonsnivåer har vært forbundet med flere nevrodegenerative tilstander, inkludert Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, Huntingtons sykdom og HIV-assosiert demens [2]. Produksjon av anti-gangliosid-antistoffer er en av de viktigste biokjemiske funksjonene til Guillain-Barré syndrom, en autoimmun nevropati [3]. Mens den spesifikke årsaken til syndromet er ukjent i de fleste tilfeller er det vanligvis kommer etter infeksjon med
Campylobacter jejuni product: [4], [5].
Gangliosider har blitt identifisert som svulst -associated karbohydratantigener (TACAs), en gruppe som omfatter Lewis-Y, Lewis-X, Thomsen-Friedenreich og Thomsen-nouvelle [6]. Gangliosidene mest ofte finnes i nervesystemet er GM1, GD1a, GD1b og GT1b [1], men gangliosidene vurderes for vaksine og antistoff-baserte målretting er generelt biosyntetiske mellomprodukter av disse, slik som GM2, GM3, GD2 og GD3 [ ,,,0],7], [8], [9], [10] (figur 1). Mens funnet i små mengder i nervesystemet, har de ofte i høye tettheter på en rekke tumorcelletyper [11], [12], [13]; således er de attraktive mål for immunterapi kreft. I tillegg til disse, gangliosider avslutter i
N
-glycolylneuraminic syre (Neu5Gc), for eksempel
N
-glycolyl GM3 (Neu5Gc-GM3), er også nyttige mål for kreftbehandling [14] [15]. I motsetning til
N
-acetylneuraminic syre, Neu5Gc kan ikke syntetiseres av mennesker, på grunn av mangelen på en funksjonell sialinsyre hydroksylase [16]. Utseendet til Neu5Gc på menneskelige celler er antatt å skje gjennom enzymatisk innlemmelse fra kosten [17]. Siden Neu5Gc uttrykk er i stor grad begrenset til kreftceller hos mennesker, målretting Neu5Gc-terminer gangliosider er sannsynlig å oppnå en svært selektiv terapeutisk utfall
CNS gangliosider. A. GT1b. B. GD1a. C. GD1b. D. GM1. Kreft-relaterte gangliosider: E. GD2. F. GD3. G. GM3. H. Neu5Gc-GM3. Siden hver struktur er differensiert ved fjerning av én eller flere rester fra GT1b, den glykosidiske bindinger som er angitt på GT1b gjelder for alle de strukturer, inkludert Neu5Gc-GM3. Karbohydrat symboler følger nomenklaturen av Consortium for Funksjonelle glycomics [63]:
N
-acetylneuraminic acid – lilla diamant; galaktose – gul sirkel;
N
-acetylgalactosamine – gul firkant; glukose – blå sirkel;
N
-glycolylneuraminic acid -. Lyseblå diamant
Karbohydrater er normalt anses T-celle-uavhengig antigener, vanligvis ute av stand til å fremkalle en sterk immunrespons [18], [19]. En måte å løse dette problemet er gjennom utvikling av karbohydrat mimetika, i stand til å indusere en anti-karbohydrat immunrespons. Peptider er blitt betraktet for dette formål mot et bredt spekter av mål [20]. Peptid-etterligner av den GD2 [21], [22], [23] og GD3 [24], [25] gangliosider er blitt identifisert, for eksempel ved fagdisplay mot anti-gangliosid-antistoffer. Noen av disse har blitt funnet å indusere anti-gangliosid-immunresponser [23], [25], [26]. Peptid-etterligner av anti-Neu5Gc-GM3 antistoffer er for tiden ikke kjent, men har anti-idiotypiske antistoffer mot disse antistoffene har blitt identifisert [27], [28].
Selv om tidligere kjente strukturstudier og i erkjennelse av gangliosider og deres etterligner av antistoffer er blitt utført [21], [29], [30], [31], disse har vanligvis benyttes enkle molekylære tilkoblings metoder. Vi har tidligere utviklet området kartleggingsteknikk, som vi har vist seg å være effektive for å studere karbohydrat-antistoff [32], [33] og karbohydrat-lektin gjenkjennelse [34], i tillegg til peptid-antistoff-gjenkjenning [35], [36 ], [37], [38]. Her vurderer vi en rekke molekylære docking programmer for deres evne til å forutsi bindende moduser av sure sukker til antistoffer og anvende vår side kartlegging teknikk for å studere antistoff anerkjennelse av sure sukker (tabell 1). Beregnings tilnærmingen mest egnet for validerings tilfellene blir så benyttet for å undersøke gjenkjennelse av karbohydrat epitoper av gangliosider med fire anti-gangliosid-antistoffer: R24, ME36.1, chP3 og 14F7 (tabell 2). Mens det er eksperimentelt løst tilpassede konstruksjoner av alle antistoffene av interesse er tilgjengelig, strukturen av ett av disse antistoffer, chP3, mangler et kort segment av nøkkelen HCDR3 sløyfen. Vi har derfor utvidet området kartlegging teknikk for å vurdere flere proteinstrukturer, i en prosess kalt «dynamisk område mapping». Til slutt, er nettstedet kartlegging teknikk som brukes til å undersøke antistoff anerkjennelse av gangliosidantistoffer-mimetiske peptider, som sammenlignes med anerkjennelse av karbohydrat determinanter av gangliosider.
Metoder
Validation og testsystemer
for metodevalidering, høyoppløselig komplekser ( 2,5 A) til antichlamydial antistoffer S25-2, S73-2 og S25-39 med poly-Kdo (ketodeoxyoctulosonic acid) antigener ble hentet fra protein data Bank (PDB) (tabell 1). Forsøkssystemet som er undersøkt (anti-gangliosid-antistoffer og deres ligander) er oppsummert i tabell 2. Antistoffer ble nummerert og CDR-er definert etter IMGT unike nummereringsplanen [39].
Molecular forankrings
Glide 5.6 [40], [41], GOLD 4.1.1 [42], Autodock 4.2 [43] og forankre 6.4 [44] ble evaluert for deres evne til å reprodusere den krystallografiske bindende modusen i hvert av valideringssystem. Innstillingene som brukes for disse programmene er beskrevet andre steder [34], [45]. I korthet ligandene ble behandlet fleksibelt ved hver dokking program, med unntak av pyranose-ringer, som ble holdt i stol konformasjoner. I validerings tilfeller, alle krystallografiske vann og buffermolekyler, samt ioner ble fjernet fra strukturer. Protein Forberedelse Wizard i Maestro 9.2 [46] ble brukt til å legge til hydrogen og finne de mest sannsynlige protonering statene titrerbar proteinrester i alle tilfeller.
Side kartlegging
Nettstedet kartlegging prosedyren ble brukt til de testsystemer som tidligere beskrevet [32]. Kort fortalt er samspillet som finner sted i de 100 rangert positurer hentet fra molekylær docking stemte ifølge proteinrester som de skjedde og hvilken type interaksjon som finner sted (dvs. hydrogenbinding eller van der Waals interaksjoner). De tallies blir normalisert ved å dividere antall interaksjoner observert med en bestemt rest av det totale antall interaksjoner observert. Normalisering utføres separat for hydrogen liming og van der Waals interaksjoner. De normaliserte tallies er sortert fra størst til minst bidrag, og den kumulative summen beregnes. Alle rester som oppstår over en gitt kumulative summen cutoff anses viktig for anerkjennelse.
De beregninger av reproduksjon og nøyaktighet ble brukt i vurderingen av nettstedet kartet kvalitet. Reproduksjon er beregnet som antall krystallografiske interaksjoner identifisert av nettstedet kartet delt på antall krystallografiske interaksjoner observert. Korrekthet er beregnet som antall krystallografiske interaksjoner identifisert av nettstedet kartet delt på totalt antall kartlagt interaksjoner. Reproduksjon og korrekthet verdier nær en indikere at den genererte områdekart nøyaktig identifisere krystallografiske interaksjoner, uten inkludering av feilaktige kontakter. Produktet av reproduksjon og nøyaktighet ble brukt til å vurdere kvaliteten på kartleggingen; større verdier indikerer optimal gjengivelse og korrekthet. Den kumulative summen cutoff var optimalisert for validerings systemer ved å vurdere den gjennomsnittlige produkt av reproduksjon og nøyaktighet på 10% cutoff intervaller fra 0-100%. Cut-off som ga den største gjennomsnittsprodukt for den serie av validerings tilfeller (tabell 1) ble anvendt for å undersøke den anerkjennelse av gangliosider og gangliosid-mimetiske peptider av de utvalgte anti-gangliosid-antistoffer (Tabell 2).
Dynamisk nettstedet kartlegging
Tre rester av HCDR3 sløyfe mangler fra strukturen i chP3 (PDB 3IU4) [30]. Den manglende del ble manuelt bygget, og lavenergistrukturer av dette parti, samt resten tilstøtende til hver side av den manglende del (som utgjør en total på fem residuer), ble samlet ved hjelp av sløyfen avgrensning verktøyet i Prime [47]. Nettstedet kartlegging prosedyren (se ovenfor) ble utført på de ti laveste energi konformere. Den mest sannsynlige konformer fra settet ble valgt på grunnlag av sin likhet til ensemblet gjennomsnittet av hydrogenbinding og Waals områdekart van der. Ensemblet gjennomsnittlig kartene ble beregnet ved å ta gjennomsnittet av interaksjons bidragene fra hver kartlagt rester over hele sett med ti konformere. Likheten av hver konformer nettsted kart til ensemblet gjennomsnittet ble bestemt ved hjelp av følgende uttrykk: der
en
er cutoff for utvelgelse av viktige hydrogenbindings kontakter (som en brøk),
b
er cutoff for utvelgelse av viktige van der Waals kontakter (som en brøk),
r
2
HB
er korrelasjonskoeffisienten beregnet mellom en bestemt konformer og ensemblet gjennomsnittet for hydrogen liming kontakter og
r
2
vdw
er korrelasjonskoeffisienten beregnet mellom en bestemt konformer og ensemblet gjennomsnittet for van der Waals kontakter. Den konformer viser den høyeste likhet med ensemble gjennomsnittlig kartene ble valgt som den mest sannsynlige konformer.
Peptide etteraping av gangliosider
gangliosid-mimetisk peptider ble separert i overlapp heksapeptid fragmenter og forankret til antistoffet mål ved hjelp GOLD. Nettstedet kartlegging teknikk (se ovenfor) ble påført de resulterende ensembler av positurer. Interaksjonsdata for settet av heksapeptider ble slått sammen for å gi et sett med områdekart for det komplette peptider, som beskrevet tidligere [36].
Sammenligning av gangliosid og etterligne anerkjennelse
Å sammenligne anerkjennelse av gangliosider og deres peptid-baserte ligner ble spredningsplott sammenligne interaksjons bidrag antistoffrester i gangliosid anerkjennelse og etterligne anerkjennelse generert. Avstanden mellom hvert punkt og linjen representerer ekvivalens av gangliosid og etterligne gjenkjennelse (
d
) ble beregnet som tidligere beskrevet [36]. Positiv
d
verdier indikerer et større antall interaksjoner ved at rester med mimikk, mens negativ
d
verdier indikerer mer samhandling med gangliosid. Rester med
d
større enn en absolutt verdi på 3,00 ble ansett å variere betydelig fra likeverdighet linjen.
Resultater
Molecular docking evaluering
Flere molekylær tilkoblings programmene ble evaluert for deres evne til å forutsi den krystallografiske bindende modusen for en serie av antichlamydial antistoffene i kompleks med poly-KDO antigener (tabell 1). Resultatene av molekylært docking evalueringen viser at de fleste programmene er generelt mislykket i nøyaktig vurdering den krystallografiske bindingsmodus (tabell 3). Men alle programmene var i stand til å identifisere den korrekte bindingsmodusen (dvs. mindre enn 2,0 Å rmsd mellom positur og krystallografisk bindende modus) i minst ett tilfelle, uten hensyn til klassifisering. Unntaket fra dette er gull, som var i stand til å både nøyaktig identifisere og rang, som beste positur, riktig innbindingsmodus i fire tilfeller, disse er alle de S73-2 komplekser (PDB koder 3HZK, 3HZV og 3HZY), og komplekset av S25-39 med Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-OAll) (PDB 3OKK). To av disse vellykkede tilfeller er vist i figur 2. Generelt, øker størrelsen og fleksibiliteten av karbohydrat-determinant som undersøkes ført til redusert kvalitet prediksjoner. Videre kan bindingssetet topografi også påvirke kvaliteten på spådommer, som observert tidligere [45], men også noen passende modell komplekser er tilgjengelige for å bekrefte dette.
A. Sammenligning av topp rangert positur hentet fra molekylær docking (gul) med den krystallografiske bindingsmodus (blå) av Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-OAll): S25-39 kompleks (PDB 3OKK). B. Sammenligning av topp rangert positur (gul) hentet fra molekylær dokking med den krystallografiske bindingsmodus (blå) av Kdoα (2 → 8) Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-OAll): S73-2 kompleks (PDB 3HZV ). C. Skjematisk fremstilling av interaksjoner i Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-OAll): S25-39 spådd av molekylær docking. D. Skjematisk fremstilling av interaksjoner i Kdoα (2 → 8) Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-OAll): S73-2 kompleks. Molecular docking utføres ved hjelp GOLD 4.1.1. Figurene 2A og 2B fremstilt ved å anvende PyMOL [64]. Figurene 2C og 2D fremstilt ved å anvende LIGPLOT [65]. Legend til figur 2C og 2D: hydrogenbindinger – grønne streker; hydrofobe interaksjoner – rød buer; carbon – svart; oksygen – rød; nitrogen – blå; ligand obligasjoner – lilla; protein obligasjoner -. orange
Optimalisering av nettstedet kartlegging for antistoff anerkjennelse av sure sukker
Siden GOLD produsert de mest nøyaktige positurer, uavhengig av evnen til å rangere disse utgjør, den ble brukt til å gi posere ensemble inngang for nettstedet kartlegging. En kumulativ sum cutoff på 80% for både hydrogen-binding og van der Waals interaksjoner har vist seg å være optimale når området kartleggings anti-karbohydrat-antistoffer, hvor kortere, mindre fleksibel og mindre funksjonelt forskjellige karbohydrater ble ansett [32]. Denne grenseverdi er også blitt brukt for å gjenkjenne peptid-antistoffer og karbohydrat lektin interaksjoner [34], [36]. For å finne ut om dette cutoff var egnet for å studere antistoff anerkjennelse av sure sukker med svært fleksible bindinger (dvs. (1 → 6) eller (2 → 8) bindinger), et utvalg av cutoff-verdier ble undersøkt (tabell S1). Den 90% cutoff ble funnet å være mest konsekvente, affording en lavere standardavvik i produktdata (dvs. reproduksjon × korrekthet) oppnådd for settet av tilfellene (S.D. = 0,05). Den 80% cutoff gis en identisk gjennomsnittet til 90% cutoff over sett studert tilfeller, men var litt mindre konsistent enn 90% cutoff (S.D. = 0,08). Men bruk av 90% cutoff resulterte i relativt dårlig kart korrekthet (~0.5-0.6) sammenlignet med tidligere saker [32], [34], [36]. Dette lavt nivå av kartet korrekthet kan tilskrives inkludering av mange feilaktig van der Waals kontakter.
For å optimalisere valg av samspill rester, hydrogenbindinger og van der Waals kontakter ble vurdert med separate tidsavgrensninger, i stedet av den samme cutoff for hver interaksjon type som tidligere er brukt [32], [34], [36]. Når hydrogenbinding ble vurdert alene, ble den 90% cutoff funnet å være optimalt for omfanget av testsystemer (Tabell S2) og ga overlegne resultater for å vurdere både hydrogenbinding og van der Waals med den samme cutoff. Hensynet til noen van der Waals kontakter er nødvendig for å identifisere interaksjoner med ikke-polare sidekjeder. Det ble funnet at en 40% cutoff av van der Waals kontakter, i kombinasjon med en 90% cutoff for hydrogenbindingsvekselvirkninger, forutsatt at den optimale forutsigelse av krystallografisk kontakter (tabell S3).
Ved hjelp av denne optimaliserte cutoff, det ble demonstrert at nettstedet kartlegging og toppen positur hentet fra molekylær docking yter tilsvar ved prediksjon av samspill rester (figur 3, tabell 4). Videre gir dette optimalisert cutoff site map kvalitet sammenlignbare i reproduksjon og korrekthet til tidligere studert antistoff, og lektin-karbohydrat systemer [32], [34].
Kdoα (2 → 4) Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-OAll) binding til S73-2 (PDB 3HZY) beskrevet av hydrogenbinding kart (A) og van der Waals interaksjoner kart (B). Kdoα (2 → 8) Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-OAll) binding til S25-39 (PDB 3OKO) beskrevet av hydrogenbinding kart (C) og van der Waals interaksjoner kart (D). Den fargedybde indikerer nivået av involvering av en bestemt rest in ligand anerkjennelse; sterkere opplyste rester er mer involvert i ligand anerkjennelse enn svakt opplyste rester. Krystallstrukturen bindende modus, er vist i hver struktur i staver farget av atom type (C, gul, O: rød). Bilder gjengitt ved hjelp PyMOL [64].
Dynamisk område kartlegging av chP3
Strukturen chP3 (PDB 31U4) mangler tre rester fra HCDR3 sløyfe [30] . Det er kjent at rester fra denne løkke er viktige for antigengjenkjennelse ved chP3. For å identifisere de mest aktuelle konformasjon av denne sløyfen, «dynamisk» site kartlegging av chP3, der nettstedet kartlegging av flere chP3 konformere – varierende bare i konformasjon av den manglende delen av HCDR3 sløyfe – ble gjennomført. Siden mindre enn ti poses ble oppnådd når båten Neu5Gc-GM3 til den fjerde laveste energi konformer av chP3 HCDR3, kunne området kartlegging ikke utføres på denne struktur. Den ellevte laveste energi konformer ble brukt i stedet, for å gjøre et sett med ti strukturer.
Fra seterettet mutagenese studier er det kjent at Arg111.2H (Arg100AH i Kabat nummerering) er avgjørende for gangliosid anerkjennelse [ ,,,0],30]. Det ville derfor være forventet at disse restene er tungt involvert i antigen interaksjon. Når området kartlegging prosedyren ble utført på det laveste energi chP3 HCDR3 konformer sto Arg111.2H for bare 5,31% av alle observerte hydrogenbindinger, mens andre rester sto for en betydelig større antall hydrogenbindinger (tabell S4). Således er den øverste scoring konformer potensielt ikke den mest representative for biologisk relevant tilstand. I likhet områdekart til dette ble observert for fifth- og niende laveste energi chP3 strukturer. Det nest laveste energi chP3 HCDR3 konformer omtalt nesten ingen interaksjoner med Arg111.2H (0,90% av hydrogenbindinger og 1,34% av van der Waals interaksjoner), noe som tyder på at sløyfen er også sannsynlig å være i en biologisk irrelevant konformasjon. Ved inspeksjon av denne strukturen, sidekjeden av Arg111.2H stabler med sidekjeden av Trp57H, og kan derfor ikke lett å kommunisere med liganden (figur 4). I den tredje laveste energistruktur, ble de fleste hydrogenbindinger observert med Arg111.2H – litt over 20% av alle hydrogenbindinger. Derfor er denne strukturen sannsynlig å være representativt for biologisk relevant tilstand. Andre viktige kontakter i denne strukturen inkluderte Ala112.1H, His107L og Tyr108L. Den sjette laveste energistruktur kjennetegnet Arg111.2H og Ala112.1H som viktige kontakter, men ikke fremtredende funksjon de to rester fra den lette kjeden, som er identifisert som viktig for interaksjoner i den tredje laveste energistruktur. I stedet Ser38H ble identifisert som en viktig kontakt. Den åttende laveste energistruktur var lik denne, med litt større vekt på samhandling med His107L og Tyr108L. I den syvende laveste energistruktur, Arg111.2H dominerte hydrogen bonding interaksjoner, sto for nesten en tredjedel av alle hydrogenbindinger observert med denne strukturen. Men Ala112.1H, Gln112H, His107L og Tyr108L hvert utgjorde -10% av alle hydrogenbindinger. Den tenth- og ellevte laveste energistrukturer som gis lik områdekart til hverandre, med hydrogenbindinger nokså jevnt fordelt mellom Arg112.2H, Ala112.1H, Gln112H, Ala113H, His107L og Tyr108L.
A. Det nest laveste energi konformer, fremhever stable mellom sidekjedene Arg111.2H og Trp57H. B. Den tiende laveste energi konformer, spådd å være mest sannsynlig å bli involvert i ligand binding. C. Hydrogen bonding områdekart for tiende laveste energi konformer. D. van der Waals kartet for tiende laveste energi konformer. Rester som bidrar til den foreslåtte gangliosid-bindende motiv er markert på hydrogen binding områdekart.
I alle tilfeller ble van der Waals kontakter dominert av Trp57H og Trp116L (tabell S5). De HCDR3 rester – Arg111.2H, Ala112.1H og Gln112H – var også viktig for van der Waals kontakter. Deres betydning er vanligvis i samsvar med deres viktighet for hydrogenbinding (dvs. rester som er sterkt viktig for hydrogenbinding er vanligvis sterkt viktig for van der Waals kontakter).
å analysere de genererte områdekart, ble det fastslått at chP3 konformer mest representative for gjennomsnittet tilstand var den tiende rangerte konformer (figur 4, tabell 5). Dette konformer har betydelig hydrogenbinding med Arg111.2H, kjent for å være viktig for anerkjennelse fra seterettet mutagenese studier, men antyder også viktigheten av nærliggende HCDR3 rester (Ala112.1H, Gln112H, Ala113H) og LCDR3 rester His107L og Tyr108L. De van der Waals interaksjoner i stor grad skje med tryptofan rester i posisjonene 57h og 116L. Denne resten utnyttelse er lik andre anti-karbohydrat antistoffer [32].
Fastsettelse av den sannsynlige gangliosid-gjenkjenne motiv
Vi hadde undersøkt gangliosid anerkjennelse av de fire anti-gangliosidantistoffer antistoffer (tabell 2) under anvendelse av identiske hydrogenbinding og van der Waals konsentrasjon, i henhold til vår tidligere arbeid [20], [32], [34], og dette identifisert noen av restene sannsynlige å være involvert i gjenkjennelse gangliosid [48]. For å bekrefte resultatene av denne forstudien disse tilfellene har nå blitt re-undersøkt ved hjelp av optimalisert cutoff-verdier. De tilsvarende karbohydrat epitoper av gangliosidene var forankret til R24, ME36.1 og 14F7, og de optimaliserte cutoffs ble brukt til å identifisere sannsynlige antistoff rester involvert i gangliosid anerkjennelse. De genererte områdekart, i tillegg til det som genereres av den dynamiske kartleggingsprosedyren brukt til chP3, ble brukt til å identifisere nærvær av en potensiell gangliosid-bindende motiv i anti-gangliosid-antistoffer. De viktigste rester involvert i gangliosid anerkjennelse er oppsummert i tabell 6.
Gangliosid anerkjennelse av antistoffene ble vanligvis dominert av interaksjoner med den tunge kjeden (figur 4 og 5). I de tilfeller av mAbs R24 og 14F7, anerkjennelse var helt avhengig av tungkjede rester, mens for mAbs ME36.1 og chP3, omtrent en tredjedel av all samhandling skjedde med lettkjederester. Disse forskjellene i CDR utnyttelse kan forklares i form av bindingsstedet kretsmønstre for hver av antistoffer; bindende hulrom i R24 og 14F7 er begge består utelukkende av tungkjede rester, med tilgang til LCDRs blokkert av HCDR2.
hydrogenbindinger og van der Waals områdekart av R24 (A og B), ME36.1 (C og D) og 14F7 (E og F). Rester som bidrar til den sannsynlige gangliosid-bindende motiv er merket på hydrogen binding områdekart.
Til tross for forskjeller i bindingssete topografi, det er viktige likheter mellom de antistoffer som blir synlig ved strukturell undersøkelse av områdekart. Fire rester, arrangert i en relativt lik «spiral» rundt hvert antistoff bindingssetet, er i stor grad ansvarlig for hydrogen liming samhandling med gangliosider. Forløp med urviseren, den sannsynlige gangliosid-bindende motiv av de antiganglioside antistoffene omfatter to polare rester (typisk Tjen, etterfulgt av Tyr, Thr eller Asp), en aromatisk rest (typisk Tyr) og en basisk rest (Arg). Ikke alle av antistoffene strengt samsvar med dette motiv; for eksempel R24 har treonin rest der en arginin forventes, og chP3 har en alaninresiduum hvor en serin forventes
Peptide etteraping av gangliosider
peptid ligner av GD3. – RHAYRSMAEWGFLYS – kunne replikere nesten alle av van der Waals interaksjoner gjort av gangliosid med R24, men noen markerte forskjeller i hydrogenbindinger profilen inntraff (tabell S6). Kartene viste at peptidet ikke klarte å gjenskape antall hydrogenbindinger gjort mellom GD3 trisakkarid og antistoff rester Gly38H og Ser58H. Imidlertid er en betydelig økning i hydrogenbindinger med den HCDR3-rester, Tyr113H og Tyr114H, ble observert. Den reduserte potensialet i peptid til dypt og konsekvent trenge gjennom bindingssetet over positur ensemble kan forklare hvorfor færre interaksjoner ble observert med Gly38H og Ser58H. Tyr113H og Tyr114H kan ha råd til mer samhandling med peptidet, siden de er lettere tilgjengelig. Fra sammenligning av ganglioside- og peptid-avledet områdekart (figur 6), vises peptid å være en delvis strukturell etterligner av GD3 [20]. Dette delvis strukturelle mimikk kunne gjøre rede for den observerte immunologiske mimikk til GD3 av dette peptidet [25].
A. Hydrogenbinding nettsted kart som beskriver peptid (RHAYRSMAEWGFLYS) anerkjennelse av R24. B. van der Waals interaksjoner nettsted kart som beskriver peptid anerkjennelse av R24. Site maps generert og gjengis ved hjelp PyMOL [64]. C. Sammenligning av hydrogenbinding områdekart som beskriver GD3 og peptid anerkjennelse. D. Sammenligning av van der Waals-områdekart som beskriver GD3 og peptid anerkjennelse. I figurene 6C og 6D, åpne punkter viser rester som avviker vesentlig fra den linjen som representerer verdigheten av karbohydrat og peptid interaksjoner (dvs.,
