Abstract
Svulster er ofte heterogene der tumorceller i ulike fenotyper har forskjellige egenskaper. For vitenskapelige og kliniske interesser, er det av grunnleggende betydning for å forstå deres egenskaper og de dynamiske variasjoner mellom ulike fenotyper, spesielt i henhold til radio- og /eller cellegift-behandling. Foreløpig er det to kontroversielle modeller som beskriver svulst heterogenitet, kreftstamcelle (CSC) modell og den stokastiske modellen. For å klargjøre kontroversen, målte vi sannsynlighetene for ulike divisjon typer og overganger celler via
i situ
immunfluorescens. Basert på eksperimentdata, vi konstruert en modell som kombinerer CSC med stokastiske konsepter, som viser at det finnes både særegne CSC subpopulasjoner og stokastiske overganger fra NSCCs til cscs. Resultatene viste at de dynamiske variasjoner mellom cscs og ikke-stammen cancerceller (NSCCs) kan simuleres med modellen. Videre undersøkelser viste også at modellen kan brukes til å beskrive dynamikken i to subpopulasjoner etter strålebehandling. Enda viktigere, analyse viste at den eksperimentelle detekterbare likevekt CSC andel kan oppnås bare når de stokastiske overganger fra NSCCs til cscs forekomme, noe som indikerer at tumoren heterogenitet kan eksistere i en modell koordinere med både CSC og den stokastiske konsepter. Det matematisk modell basert på eksperimentelle parametre kan bidra til en bedre forståelse av svulsten heterogenitet, og gi referanser på dynamikken i CSC undergruppe under strålebehandling
Citation. Wang W, Quan Y, Fu Q, Liu Y, Liang Y, Wu J, et al. (2014) Dynamics mellom Cancer Cell subpopulasjoner avslører en modell Koordinere med både hierarkiske og stokastiske konsepter. PLoS ONE 9 (1): e84654. doi: 10,1371 /journal.pone.0084654
Redaktør: Toru Hosoda, Tokai University, Japan
mottatt: 29 juni 2013; Godkjent: 18 november 2013; Publisert: 09.01.2014
Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Key prosjekt National Natural Science Foundation of China (10935009), National Science Foundation for unge forskere i Kina (31000383) og Instrument Program National Grand (2012YQ030142). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Svulster er ofte heterogene der enkelte kreftceller finnes i forskjellige fenotyper med distinkte funksjonelle egenskaper [1]. Klinisk svulster fra forskjellige pasienter, enten leukemi eller fast, ofte viser betydelig heterogenitet i form av morfologi, celleoverflatemarkører, genetiske skader, celleproliferasjonsprosesser kinetikk, og effekten av behandlingen [2]. Derfor er det av grunnleggende betydning for å forstå den molekylære og cellulære basis av heterogeniteten. Foreløpig er det to kontroversielle modeller som beskriver heterogenitet i tumor, CSC-modellen og den stokastiske modellen. CSC modellen, også kjent som hierarkiet modell, tyder på at veksten og progresjon av mange kreftformer er drevet av små, men karakteristiske subpopulasjoner av cscs, og svulsten er en karikatur av normalt vev utvikling hvor stamceller opprettholde normale vev hierarkier [3] . De cscs på toppen av hierarkiske strukturen kan ikke bare opprettholde seg selv ved selvfornyelse, men også skille ut NSCCs. I motsetning til den stokastiske modellen, også kjent som klonal evolusjon modell forutsier at en svulst er biologisk homogent og virkemåten til kreftceller er tilfeldig påvirkes av uforutsette indre og /eller ytre faktorer [3].
to modellene vakte stor interesse i både eksperimentelle og teoretiske studier. I eksperimentelle undersøkelser, selv om mekanismen av svulsten heterogeniteten er fremdeles uklar, er det sterke bevis for at kreften er en cellulær hierarki med cscs ved toppunktet [2], [4] – [7], noe som indikerer at kreftterapi kan kreve fjerning av cscs [4], [8]. Disse papirene støttet CSC modell og utløste nye strategier på målretting cscs å behandle kreft [2], [4] – [7]. Men flere andre papirer viste at den fenotypiske plastisitet innenfor tumorer kan gi toveisinterkonvertering mellom cscs og NSCCs, noe som resulterer i dynamisk variasjon i den relative overflod av cscs [1], [9] – [11]. Vesuna
et al
fant at forbigående uttrykk for
Twist
kan indusere stamcelle fenotype i flere brystcellelinjer og at avtagende
Twist
uttrykk delvis reverserer stamcelle molekylær signatur [12]. Morel
et al
rapportert at bryst cscs kan genereres gjennom EMT kaskade [13]. Liang
et al
antydet at cscs er induserbar ved å øke genomisk ustabilitet i kreftceller [14]. Interessant, Chaffer
et al
rapportert at normale og neoplastiske ikke-stamceller kan spontant konvertere til en stilk lignende tilstand [9]. Enda viktigere, Iliopoulos
et al
rapportert at bryst cscs kan induseres fra NSCCs via IL6 sekresjon og de to cellepopulasjoner kan nå dynamisk likevekt [1]. Nylig, Gupta
et al
rives en modell som fenotypisk likevekt i populasjoner av kreftceller oppnås via stokastiske tilstandsoverganger [10]. Våre tidligere studier viste også
in situ
overganger og fenotype dynamisk likevekt mellom cscs og NSCCs, enten med eller uten strålebehandling [11].
I teoretiske studier, varm debatt også blitt stimulert mellom ulike papirer. Beretta
et al
analysert asymptotiske oppførselen til CSC forhold og saken når det ikke er noen overganger fra ikke-stammen til stamcelle [15], som viser stabilitet cscs prosentandel i en matematisk måte. Gupta
et al
utviklet en Markov-modell for å forklare fenomenet at et renset fenotype subpopulasjon til slutt vender tilbake til likevekts fenotypiske proporsjoner under forutsetning av at cellene transitt stokastisk blant forskjellige tilstander [10]. Denne modell forutsier at ikke-stamceller som basal og luminal har et ikke-null sannsynlighet for å bli stammelignende tilstand. Zapperi
et al
analysert typer matematiske modeller og foreslo at ufullkommen sortering kan være et alternativ forklaring på den «renset» undergruppe tilbake til likevekt proporsjoner [16].
CSC-modellen og den stokastiske modellen foreslår ulike kliniske strategier for tumorterapi. For tiden ligger det haster i hvordan du kan forbedre begge modellene for å få en bedre forståelse av svulst heterogenitet og de dynamiske variasjoner av ulike subpopulasjoner, spesielt de cscs og NSCCs i tumor. Vi bygget en matematisk modell basert på parametere målt fra eksperimenter, spesielt de typer og priser av divisjoner og overganger. Resultatene viste at de eksperimentelle dynamikk mellom CSC og NSCC subpopulasjoner kan simuleres via modellen, enten med eller uten strålebehandling. Videre analyser viste at den eksperimentelle detekterbare likevekt CSC andel kan oppnås bare når de stokastiske overganger fra NSCCs til cscs forekomme, noe som tyder på tumor heterogenitet kan eksistere i en modell koordinere med både CSC og den stokastiske konseptene.
ligningene og forutsetninger
Tidligere studier antydet at CD133-positive celler er potensialet cscs undergruppe i SW620 menneskelige kolon celler [11], [17], [18]. Ved hjelp av
i situ
immunfluorescens ble divisjon typer cscs og NSCCs gjennom overflate markør endringer analysert. For cscs ble begge symmetriske og asymmetriske divisjoner fanget. Det vil si at en CSC kan dele inn i to cscs (selvfornyelse), to NSCCs (differensiering) samt en CSC og en NSCC (asymmetrisk divisjon) (Fig. 1a). For NSCCs, ble bare den symmetriske divisjon type (spredning) fanget, det vil si, deler en NSCC i to NSCCs. Viktigere er det karakteristiske fenotype overganger fra NSCC til CSC uavhengig av celle mitose (Fig.1A).
(A). Typiske divisjon typer cscs /NSCCs og overgang fra NSCC til CSC. Scale bar lik 50 mikrometer. (A-b) Typisk
in situ
divisjon type av en NSCC (hvit pil) og overgangen fra et NSCC til et CSC (gul pil); (C-d). Typisk
in situ
symmetriske divisjoner av cscs: selvfornyelse (en CSC deler seg i to cscs) og differensiering (En CSC deler seg i to NSCCs); NSCC (hvit pil), CSC (gul pil). (E-f). Typisk
in situ
asymmetrisk fordeling av CSC (En CSC dele inn i en CSC og en NSCC); NSCC (hvit pil), CSC (gul pil). (jeg). Kinetic ligninger som tilsvarer de fenomener i a og b. (Ii) Kinetiske likninger som svarer til de fenomener i c og d. (Iii) Kinetisk ligning som tilsvarer fenomenet i e og f. (B). Scheme av modell basert på de eksperimentelle resultatene
Store forutsetninger:..
Det er cscs og NSCCs subpopulasjoner i SW620 human tykktarm kreft celler [11]
En CSC kan dele symmetrisk i to cscs (selvfornyelse) eller to NSCCs (differensiering) med sannsynlighet
P
S
eller
P
D
henholdsvis (fig. 1A) . I tillegg kan en CSC dele asymmetrisk inn en CSC og en NSCC med sannsynlighet
P
A product: (
P
A
= 1-
P
S
–
P
D
) (Fig.1A). Ulike CSC divisjon typer har samme mitose hastighet merket med
K
C
.
En NSCC kan dele inn i to NSCCs (spredning) med hastighet på
K
N product: (Fig.1A).
en NSCC kan konvertere til en CSC med hastighet på
K
T plakater (fig. 1A) [11].
NSCC har begrenset sprer potensial og kan gå gjennom senescence med levetid på
M
generasjon [19], [20].
M
th
generasjonen dør med en hastighet på
d plakater (Fig. 1B). Verdien av
d Hotell og
M
er rett og slett satt til å være 1 og 50 som foreslått tidligere [21].
skjematisk av modellen er vist i fig. 1B. Ifølge de forutsetninger som er nevnt ovenfor, kan dynamikken mellom cscs og NSCCs beskrives med ordinære differensialligninger (oder) (ligning (1)). I oder, finner vi at
P
S, P
D Hotell og
P
A
vises i visse kombinasjoner. Slik at disse tre parametrene kan bli innarbeidet i en parameter. (1)
C
angir antall cscs og
N
i
betegne antall NSCCs;
i = 1, 2, etter …,
M
.
Det er vel kjent at strålebehandling kan føre til mye skader i celler, blant annet DNA-dobbelttrådbrudd (DSB sin) er den mest giftige [22]. Her legger vi dødelighet korrelerte med DSB sin dynamikk inn i vår modell når cellene ble bestrålt. Etter bestråling, antallet DSB sin økte raskt og mettet i de bestrålte celler [23], og deretter redusert som følge av DNA-reparasjon. Derfor, basert på DSB sin «dynamikk [24], [25], kan dødeligheten beskrives som
k
betegner DSB produksjon i gjennomsnitt per enhetsdose.
D
betegner dose.
r
er reparasjon rate på DSB sin,
r
C Hotell og
r
N
representerer reparasjon rate av CSC og NSCC hhv.
m
står for dødelig mis-reparasjon rate på per DSB par. I nåværende modellen,
m
C Hotell og
m
N
representerer dødelige mis-reparasjon forekomst av henholdsvis CSC og NSCC (Detaljer kan finnes i ligningene S1 i File S1) .
Resultater
Parametere som måles via in situ eksperimenter
De sannsynlighetene for cscs «divisjon typer og andel av overgangen mellom NSCCs ble bestemt ved hjelp av
in situ
immunfluorescens (fig. 1). For å være i samsvar med resultatene fra eksperimentet av populasjonsdynamikk, vi anslått
K
T
,
K
N Hotell og
K
C
ved å beregne mengde endring av sorterte cscs og NSCCs og prosentandel av NSCCs «overgang i en dag. Fordi cscs og NSCCs «cellesykluser er begge omtrent en dag, fordeling av nyfødte NSCCs i sorterte cscs befolkningen bidrar lite til mengde endring i en dag og delingen av nye cscs i sorterte NSCCs er ikke signifikante (ligningene som brukes i estimeringen er vist i ligningene S2 i File S1). Verdiene av disse parametrene er vist i tabell 1.
etter strålebehandling, blir gjennomsnittet av DSB produksjon i en celle rapportert å være 25-35 /Gy [26]. Og
r
beregnes ut fra halveringstid på DSB eller foci og dets størrelsesorden er -10 /dag [23], [27]. Siden CSC har høyere evne til å reparere DNA-skader [28], under forutsetning av at
r
C
r
N
er gjort. Her satt vi
r
N
= 10 og
r
C
= 15. Overlevelses fraksjoner (
S
) av cscs (
S
C
) og NSCCs (
S
N
) under 2 Gy strålebehandling måles fra forsøkene. Derfor den dødelige mis-reparasjon rate på cscs (
m
C
) og NSCCs (
m
N
) kan beregnes ved følgende ligning (ligning (2)) (2)
Som vist i tabell 2, verdien av
k
, D,
r
N
,
r
C
,
S
C
,
S
N
,
m
C Hotell og
m
N
er 25, 2, 10, 15, 95,0%, 43,0%, 0,0012 og 0,0092 kroner.
Simulering av langsiktige dynamiske variasjoner mellom CSC og NSCC subpopulasjoner
Basert på parametre, analyserte vi deretter dynamikken i CSC andel (som definerer) under forskjellige startbetingelser via den matematiske modellen (simulering av celleantall variasjon er vist i tabell S1 i File S1 S1 og fig.).
Teoretisk er det vist at den CSC andelen endelig når en stabil verdi uansett hvilken utgangsstilling er (fig. 2A). Sammenligning av simuleringsresultatene med eksperimentelle data rapportert tidligere [11], er det klart at den stadige verdien beregnet ved denne modellen er i nærheten av de eksperimentelle resultatene (Fig. 2B), viser parametrene får fra
in situ
immunfluorescens kan forutsi tendensen av dynamikken mellom cscs og NSCCs undergruppe (eksperimentdata er vist i tabell S2-S3 i File S1). I tillegg rensede NSCCs og cscs sortert fra SW620 cellelinje ved FACS ble dyrket, og CSC proporsjonene på dag 26 etter vaksinasjon ble testet. Som vist på fig. 2C, CSC andeler av forskjellige innledende kulturer nå samme stabil verdi som tilsvarer CSC-andelen i usorterte SW620-celler.
(A). Diagram av forsøksprosedyrer; (B). Sammenligning mellom simuleringsresultater og resultatene fra eksperimentet; (C). Eksperimentelle resultater av langsiktig likevekts CSC proporsjoner fra første rene cscs og NSCCs.
Parameter sensitivitetsanalyse
Svarene av CSC forhold til endring av parametre ved likevekt analyseres (parametrene er vist i tabell 1). Regelmessig, er hver parameter økes eller minskes ved en prosent, og endringen av CSC forhold ved likevekt er beregnet som tidligere rapportert [29].
M
er et helt tall, slik at endring av
M
er pluss eller minus 1. Som vist på fig. S2, når
K
T
,
K
N
,
K
C Hotell og
e
er økt med 1 prosent, ville CSC andel ved likevekt øke 0,3%, reduseres 0,5%, 0,2% og øke øke henholdsvis 1,1%. Blant de parametere,
M
er en ufølsom parameter, som er satt til å være 50 som foreslått tidligere [21]. Ifølge beregningen,
M
er en ufølsom parameter i et stort spekter. Så valget av M verdi plasserer liten innflytelse på simulering av likevekt. Andre sensitive parametere inkludert
e product: (
e
=
P
S Anmeldelser –
P
D
),
K
N
,
K
T Hotell og
K
C
er alle måles i eksperimenter
Test parametere og dynamikken mellom CSC og NSCC subpopulasjoner via cellulær automat metode
For ytterligere å validere parametre og dynamikken mellom cscs og NSCCs, vi deretter studert dynamikken mellom CSC og NSCC subpopulasjoner med parametrene via cellulær automat metode. Cellular automat er basert på oppførselen til enkelte celle og samhandling mellom individer. Det er mye brukt for å modellere multi-cellulære biologiske systemer inkludert tumor. Det kan gjenspeile den diskrete eiendom svulst som er neglisjert i ODE metoden [30]. Ved å bruke celle automat metode, kan man oppnå en bedre forståelse av hvordan tumoren vokser i mikroskopisk skala [31]. Som begrepet CSC kommer ut, er cellulær automat metode som brukes for simulering av cscs [32] – [36]
Beregningen ordningen kan bli funnet i Fig.3A.. I hvert tidsskritt, avgjør A NSCC om å dø eller om å forvandle seg til en CSC. NSCCs og cscs gå opp ett trinn i sin celle sykluser hhv. En celle vil dele inn i to celler når den er ferdig en cellesyklusen. Dersom det ikke finnes noen ledig område for cellen å dele seg, ville det bli stillestående. Hvis det er plass for cellen for å dividere for en CSC, vil den bestemme divisjon typen ved en tilfeldighet; for en NSCC, ville det dele og begge dattercellene «generasjoner øke med 1.
(A). Beregning ordning for cellulær automat metode. (B). Typisk resultat av simulering med cellulær automat metode (initial tilstand er at alle cellene er NSCCs). Red: CSC; Blå: NSCC; Svart: ledig gitter. (C). Sammenligning mellom simuleringsresultatene med cellulær automat metode og eksperimentelle resultater.
Som vist i Fig.3C, med parametrene, viser simuleringen konsistens med eksperimentdata og CSC andelen fra hver gruppe også nådd jevn verdi, noe som ytterligere indikerer disse parametrene som er samlet fra forsøkene er pålitelige. I tillegg er resultatene av cellulær automat metoden gi mer detaljert informasjon om dynamikken. Under spredning, cscs og NSCCs kan for det første skjema kolonier, og deretter utvide rundt (Video S1-2). Endelig cscs og NSCCs spredt jevnt over hele området. Det er mulig at alle off-kildene i en CSC eller en NSCC er cscs og NSCCs for flere generasjoner. Hvis disse cscs eller NSCCs kontakt med andre cscs eller NSCCs henholdsvis, de blir samlinger i visse områder (Fig.3B).
Simulering av langsiktige dynamiske variasjoner mellom CSC og NSCC subpopulasjoner etter strålebehandling
De dynamiske variasjoner mellom cscs og NSCCs etter strålebehandling er simulert med flere andre parametre ble deretter utført (tabell 2) (simulering av celle nummer variasjon er vist i tabell S4 i File S1and fig. S3). Resultatene viste at modellen simuleringen gir en akseptabel prediksjon på eksperimentelle resultater som vi tidligere rapportert [11]. Som vist på fig. 4B, kan CSC andeler av alle grupper fra forskjellige innledende proporsjoner slutt nå samme jevn verdien som sakene uten stråling, noe som indikerer kortsiktig stråling kan ikke forstyrre langsiktig dynamisk likevekt mellom cscs og NSCCs. Interessant, i en blanding av 70% cscs og 30% NSCCs gruppe, viser simulering som CSC andelen øker i begynnelsen raskt og faller ned i to dager (Fig. 4C). Dette er også i samsvar med de eksperimentelle resultatene som vi tidligere har rapportert [11].
(A). Diagram av forsøksprosedyrer med strålebehandling; (B). Sammenligning mellom simulering og resultatene fra eksperimentet i 0-24 dag (stråling brukes når t er 0 dag); (C). Forsterket bildet av resultatene fra bestrålt 70% CSC gruppe (0-2d) (stråling brukes når t er 0 dag).
Imperfect sortering kan ikke forklare den dynamiske likevekt mellom NSCCs og cscs
Den dynamiske likevekt mellom cscs og NSCCs er et interessant fenomen [1], [9] – [11]. Dette fenomenet, som nylig rapportert av flere aviser, kan ha dyptgripende konsekvenser for forståelsen av svulst heterogenitet samt kliniske terapistrategier [10]. Analyse av det fenomen viste også at en stabil likevekt CSC forhold mellom 0 og 1 er lett å oppnå hvis det finnes overganger fra NSCCs til cscs (). Hvis
K
T
lik 0, eksisterer ikke-null likevekt CSC andelen bare under forutsetning av at, det er, er det netto spredning rate på cscs høyere enn for NSCCs (detaljer finner du i diskusjon S1 i File S1 og S4) fig., som også er ikke tilfelle i våre eksperimenter og andre rapporter [2], [37].
en alternativ forklaring for dynamisk likevekt foreslått av Zapperi
ET al
er at dette fenomenet kan på grunn av den ufullkomne sortering av cellene via flowcytometri stedet for overgangene fra NSCCs til cscs. Den ufullkommen sortering er uunngåelig i forsøkene, noe som resulterer i noen celler inn i feil gruppe som en minoritet (Fig.5A). Som vist i diskusjon S1 i File S1, etter
(A). Diagram av sortering feil i forsøkene; (B). Sammenligning mellom simulering (
K
T
= 0) og eksperimentere resultater.
R
er CSC andelen i hele befolkningen.
Hvis
K
T
er 0,. Under situasjonen for ufullkommen sortering,
R
er svært lav i sortert NSCCs i begynnelsen. Så nesten lik null. Så økningen av
R
vil være ubetydelig i de første dagene. Ifølge våre eksperimentdata, er større enn 0,1 i de to første dager. Hvis
R
er 0,02 i begynnelsen, bør være større enn 5. Dette er mot eksperiment poster på celleproliferasjon. Men hvis
K
T
ikke er 0, er omtrent lik
K
T
i begynnelsen. Økningen på
R
vil være mer nær våre eksperimentdata.
For å bedre illustrere denne sannsynligheten, vi analysert teoretisk i vår modell med sortering feil av cscs og NSCCs som
θ
prosent (normalt
θ
≤2 i henhold til instruksjonene fra flowcytometri). Hvis det ikke er noen overganger fra NSCCs til cscs (
K
T
= 0), modellen kan ikke passe eksperimentelle data for CSC andel dynamikk fått fra eksperimenter med
θ
. Simulert annealing algoritme brukes til å passe våre eksperimentdata hvis opprinnelige tilstand er «renset» cscs, fordi denne prosessen kan oppnås med
K
T
= 0. Da får vi 50 parameter kombinasjoner av
K
C
,
K
N Hotell og
e
. Som vist i Fig.5B, viste resultatene at, selv om minoritets cscs vil føre populasjonen til en stabil likevekt CSC proporsjon og disse parametrene passer eksperimentdata av rensede cscs presist, kan ingen av disse parameterkombinasjoner passer eksperimentdata av rensede NSCCs brønnen. Som vist i Fig.5B, forskjellene mellom simulering og eksperimentresultatene ligge i tidsrommet for å nå likevekt. Denne verdien er i stor grad avhengig av
M
. Derfor, for å få den kurve som er lik med eksperimentdata,
M
bør være rundt 5 eller mindre. Dette er åpenbart mot de eksperimentelle data [21], [38]. Derfor kan ufullkommen sortering ikke forklare den dynamiske likevekt mellom cscs og NSCCs.
Diskusjoner
Tumor heterogenitet angir viktige implikasjoner for vellykket kreftbehandling [2]. Foreløpig er det to modeller som beskriver heterogenitet i tumor, stokastiske og CSC-modeller. Den viktige forskjellen mellom dem er at hver celle eller bare noen distinkte undergruppe kreftceller har potensial til å oppføre seg som en CSC [2]. For å klargjøre de to begrepene, vi startet fra CSC konsept med sortering av CSC og NSCC subpopulasjoner og dyrking dem separat. Da målte vi sannsynlighetene for cscs «divisjon typer og overganger NSCCs via
in situ
immunfluorescens som beskrevet tidligere [11], [39], [40]. Basert på de målte parametrene fra forsøkene (fig. 1 og Tabell 1), vi har konstruert en matematisk modell koordinerende med både CSC og stokastiske konsepter. Resultatene viste at modellen kan simulere tendensen av eksperimentelle dynamikken i NSCC og CSC subpopulasjoner, enten med eller uten strålebehandling (fig.2 og fig. 4).
stokastiske modellen forutsier at en svulst er biologisk homogen og oppførselen til kreftceller er tilfeldig påvirket av uforutsette iboende og /eller ytre faktorer [3]. Men det var økende bevis støttet eksistensen av cscs de siste to tiårene [4]. Tradisjonelt stokastiske modeller vanligvis definere flere mutasjoner fenotyper i tumor og overgangs priser mellom disse fenotyper. Disse overgangene er vanligvis enveis, fra godartede typer å invasive typer [41], [42]. Men vår
in situ
eksperimentelle resultater viste at overgangene mellom cscs og NSCCs er definitivt ikke enveis (Fig.1A), derimot NSCCs kan transitt til cscs uavhengig av celle mitose og cscs kan generere NSCCs via differensiering samt asymmetrisk fordeling avhengig av celle mitose (Fig.1A). I tillegg er genetisk ustabilitet en av de viktigste reglene i stokastiske modellen. Gjennom akkumulerte genetiske eller epigenetiske forandringer, kunne utsatt fenotype blir resistente fenotype. I perspektiv av kolonien, utvikler tumor for å bli mer motstandsdyktig mot behandling [42].
Ikke desto mindre bruk av cscs avslører at cscs er motoren av tumorvekst og motstanden mot standard kjemo- og radio- terapi [5] – [7], [43], som viser en mer organisert hierarkisk struktur enn det som indikeres av stokastiske modellen. CSC Modellen antyder at veksten og utviklingen av svulster er drevet av små men karakteristiske subpopulasjoner av cscs [3]. Men flere nyere papirer og aktuelle eksperimenter viste klart eksistensen av
de novo
generasjon cscs fra NSCCs (figur 1) [1], [9] – [11]. Overgangene fra NSCCs til cscs indikerte at CSC-modellen er ikke nok til å forklare svulsten heterogenitet og, i hovedsak støttet begrepet stokastiske modellen. Teoretisk sett, hvis det ikke er noen overganger fra NSCCs til cscs (
K
T
= 0), er vår modell bare tilfelle av CSC modell. Men under den innledende tilstand rensede NSCCs, hvis overganger ikke eksisterte, CSC andelen i kulturen vil alltid være null. Dette er åpenbart ikke tilfelle observert i våre eksperimenter, samt flere andre rapporter (Fig.2B og Fig.3C) [1], [9] – [11]. Derfor CSC modellen kunne ikke forklare fenomenet observert i eksperimenter. Som vist i den delen av resultater (Fig. 5), kan ufullkommen sortering ikke gjøre opp denne feilen av CSC modell.
Det er interessant at vi startet fra CSC-modellen, men fikk resultatene med funksjoner av både CSC og stokastiske konsepter (Fig.1A), som viser eksistensen av både særegne CSC /NSCC subpopulasjoner og stokastiske overganger fra NSCCs til cscs.
Materialer og metoder
Cell kultur
menneske~~POS=TRUNC SW620 celler ble kjøpt fra Cell Resource (IBMs CAMS /PUMC Beijing, Kina,,) preget av STR Profiling Center. Celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i 5% CO
2.
Cell-farging og flowcytometri
matchede subpopulasjoner ble separert som beskrevet tidligere [39], [40]. I korte trekk ble cellene farget ved en konsentrasjon på 10
7 celler pr 100 ul buffer. Anti-CD133 /1 (AC133) -PE (MiltenyiBiotec) antistoff ble brukt for strømningscytometrisk sortering /analyse. For alle forsøkene ble prøver sortert på en BD FACS Aria II og analysert på en BD LSR II flowcytometer å bruke BD FACS Diva programvare (BD Biovitenskap). Side scatter og termin scatter profiler ble brukt til å fjerne rusk og celle dubletter.
In situ
immunfluorescens
Detaljer om
i situ
immunfluorescens av og chip utforming er vist i vårt tidligere papir [11]. I korte trekk, ble renset NSCCs og cscs farget med muse-monoklonalt antistoff mot humant CD133 antigen kombinert med R-fykoerytrin (CD133 /1 (AC133) -PE fra Miltenyi Biotec) sammen med den DNA-bindende fargestoff Hoechst 33342 respektivt. Etter avgassing av brikken, 25 ml celle (cscs eller NSCCs) suspensjon ble pipettert inn i reservoaret. Cellesuspensjonen ble strebet inn i cellekultur rommene på grunn av det negative trykket. Etter påsetting av prøven, ble cellene i reservoaret fjernes og 35 ml medium ble tilsatt, og dyrket på vanlig måte. Etter 2 timer inkubering ble cellene fotografert for første gang, slik det er beskrevet nedenfor. For immunofluroscence farging av celler ved definerte tidspunkter som for eksempel 12 timer eller 24 timer, ble mediet i reservoaret fjernes og 20 ml medium med passende konsentrasjon av CD133 /1 (AC133) -PE (Miltenyi Biotec) ble tilsatt. Etter inkubasjonen ble mediet med CD133 /1 (AC133) -PE i reservoaret fjernes og 35 ml friskt medium ble tilsatt og inkubert i mørke for vasking av cellene. Cellene ble vasket to ganger og ble umiddelbart fotografert.
simulert annealing algoritme
simulert annealing algoritmen er en Monte-Carlo algoritme som ofte brukes for optimeringsproblemer. De innledende parametrene genereres tilfeldig og kandidat parametrene er også genereres tilfeldig av visse regler. Disse parametre ble deretter anvendt for å løse ligning (1). I simulert gløding vi ta imot en dårligere kombinasjon av parametere med mulighet for å redusere risikoen for lokal optimalisering midlertidig. Som temperaturen faller ned, nær globale optimale løsninger ville være avledet [44]. I tilpasningsprosessen, er en parameter kombinasjon akseptert til slutt hvis
Σ (simulering-data)
2
er mindre enn grenseverdien.
Simulering
betegner resultatene som er beregnet av parameter kombinasjon og
data
betegner resultatene fra eksperimentet. Beregnings koden kan bli funnet i Kode i File S1.
Cellular automat metode
I cellulær automat metode, blir cellene definert som agenter med egenskaper, inkludert divisjon, overgang og død. Det finnes to typer agenter: CSC og NSCC. NSCC kan utføre atferd inkludert divisjon, overgang og død. CSC kan utføre symmetri og asymmetri divisjoner. Kommisjonærene atferd er kvantifisert av parametere som har blitt brukt i ligning (1). Hver celle middel opptar et vanlig gitter med dimensjon på 10 um x 10 um. I denne modellen ble 200 × 200 innhegninger definert. Et gitter er satt til å romme en celle på det meste på samme tid. Derfor kan en celle deler seg i to celler med mindre det er minst én ledig side i sitt nabolag (von Neumann-området) [45].
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Beregning av celle rekke forskjellige startbetingelser (t-log10 (celle nummer))
doi:. 10,1371 /journal.pone.0084654.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Parametere sensitiviteter av CSC andel i likevekt. Blå søyler representerer forandringer av CSC andel på likevekt når tilsvarende parametere er økt.
