Abstract
epigenetiske forandringer, inkludert avvikende DNA metylering, føre til endrede genet uttrykk og spiller en viktig rolle i kreftutvikling. Fytokjemikalier som sulforaphane (SFN) og 3,3′-diindolylmethane (DIM) er lovende chemopreventive midler for behandling av prostatakreft. Begge har vist seg å indusere re-ekspresjon av gener, inkludert tumorsuppressorgener dempede i kreftceller, via modulering av epigenetiske merker, inkludert DNA-metylering. Det var imidlertid uklart effektene SFN og DIM på DNA metylering ved en genomisk skala. Målet med denne studien var å fastslå genom-wide effekter av SFN og DIM på arrangøren metylering i normale prostata epitelceller og prostata kreft celler. Både SFN og DIM behandling redusert DNA metyltransferase uttrykk i normale prostata epitelceller (PREC), og androgen-avhengige (LNCaP) og androgen-uavhengig (PC3) prostatakreftceller. Effektene av SFN og DIM på promoter metylering profiler i normal PREC, LNCaP og PC3 prostata kreft celler ble bestemt ved hjelp av metyl-DNA immunoprecipitation fulgt av genom-wide DNA metylering array. Vi viste store forandringer i promoter metylering mønster, inkludert både økt og redusert metylering, i alle tre prostatacellelinjer som reaksjon på SFN eller DIM behandlinger. Spesielt SFN og DIM endret promoter metylering i forskjellige sett med gener i Prec, LNCaP og PC3 celler, men delte lignende genet mål innenfor en enkelt cellelinje. Vi viste videre at SFN og DIM reversert mange av kreft-assosiert metylering endringer, inkludert abnorme metylerte gener som er feilregulert eller er sterkt involvert i kreft progresjon. Totalt sett, våre data antydet at både SFN og DIM er epigenetiske modulatorer som har brede og komplekse effekter på DNA metylering profiler i både normale og kreft prostata epitelceller. Resultater fra vår studie kan gi ny innsikt i de epigenetiske mekanismer som SFN og DIM utøve sin kreft chemopreventive effekter
Citation. Wong CP, Hsu A, Buchanan A, Palomera-Sanchez Z, Beaver LM, Houseman EA , et al. (2014) Effekter av Sulforaphane og 3,3′-Diindolylmethane om Genome-Wide Arrangøren Metylering i Normal Prostata Epitelceller og prostata kreft celler. PLoS ONE 9 (1): e86787. doi: 10,1371 /journal.pone.0086787
Redaktør: Bernard W. Futscher, The University of Arizona, USA
mottatt: 17 august 2013; Godkjent: 13 desember 2013; Publisert: 22 januar 2014
Copyright: © 2014 Wong et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd CA90890, CA65525, CA122906, CA122959, CA80176, R01GM104977, og ved NIEHS Senter tilskuddet P30 ES00210. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epigenetiske mekanismer er viktig for å regulere og opprettholde genuttrykksmønster. Dysregulert epigenetiske prosesser, blant annet avvikende DNA-metylering, histon modifikasjon, og mikroRNA profiler, føre til endret gen-ekspresjon og funksjon, og spiller en viktig rolle i kreftutvikling. Spesielt er store forandringer i DNA-metylering mønstre observert i løpet av kreft initiering og progresjon, karakterisert ved global og sete-spesifikk DNA hypometylering, samt gen-spesifikk promoter hypermethylation [1], [2]. DNA hypometylering i kreft kan bidra til genom ustabilitet og økt ekspresjon av onkogener. På den annen side kan DNA hypermethylation føre til lyddemping av tumorsuppressorgener, transkripsjonsfaktorer, så vel som gener som er involvert i cellesyklusregulering og apoptose. Etablering og vedlikehold av DNA-metylering mønstre er mediert av DNA metyltransferaser (DNMTs) [3]. Overekspresjon av DNMTs er observert i mange kreftformer, inkludert leukemi [4], bukspyttkjertelkreft [5], magekreft [6], lungecancer [7], og prostatakreft [8], og feilregulert DNMT uttrykk sannsynligvis er en av de medvirkende faktorer som fører til avvikende DNA metylering mønstre i løpet av kreft progresjon. I motsetning til genetiske mutasjoner, epigenetiske forandringer er potensielt reversible og representerer et attraktivt og lovende mål for kreft chemoprevention strategier. Mange epigenetiske narkotika utvikles til å reversere DNA metylering og histon modifikasjons avvik i kreft er for tiden under etterforskning. I tillegg til farmakologiske midler, har et økende antall viktige mikronæringsstoffer og diett fytokjemikalier blitt vist å virke som epigenetikk modulatorer, og er attraktive kandidater for anvendelse i terapi epigenetisk [9], [10]. Evnen til kostholdsfaktorer for å utøve epigenetiske effekter understreker hvor viktig spesifikke næringsstoffer og bioaktive fytokjemikalier i epigenetiske regulering og kreft chemoprevention strategier.
Prostatakreft er den nest vanligste diagnosen kreft hos menn i USA [11 ]. Kosthold er en modifiserbar risikofaktor og kan påvirke mottakelighet for prostatakreft utvikling. Prostata kreftrisiko har vist seg å være omvendt korrelert med inntak av cruciferous grønnsaker [12], [13]. Spesielt Sulforafane (SFN) og 3,3′-diindolylmethane (DIM), har to fytokjemikalier avledet fra glukosinolater i cruciferous grønnsaker blitt vist å være effektive kjemopreventive midler mot prostatakreft [14], [15]. SFN er et isotiocyanat avledet fra hydrolyse av glucoraphanin, og DIM er en vesentlig syre kondensasjonsprodukt av indol-3-carbinol (I3C), et hydrolyseprodukt av glucobrassicin. Den anti-kreft-effekter av både SFN og DIM er mangesidig, som involverer ulike kjemopreventive mekanismer, inkludert induksjon av fase 2 enzymer, økning i apoptose, induksjon av cellesyklus-stans, og inhibering av celleproliferasjon. Flere nylig, indikerer økende bevis for at SFN og DIM kan også fungere som epigenetikk modulatorer og utøve anti-kreft egenskaper ved å målrette epigenetiske merker i prostatakreftceller. For eksempel kan SFN og DIM inhibere histon-deacetylase (HDAC) aktiviteter, forandre HDAC uttrykk, og resultere i re-ekspresjon av tumorsuppressorgener [16], [17]. Vi og andre har vist at SFN kan hemme DNMT ekspresjon og endre DNA-metylering i prostata og brystcancerceller, representerer et nytt chemoprevention mekanismen som SFN epigenetiske regulerer genekspresjon [18] – [20]. Den doble effekten av SFN på HDAC hemming og DNA metylering gjør det til et attraktivt kosttilskudd chemoprevention agent. Men lite er kjent om effekter av SFN på andre abnorme metylerte genet mål, og om SFN har forskjellige effekter på DNA metylering i normale og kreft prostata celler. I tillegg gjenstår det å bli bestemt om DIM kan tilsvar utøve dual epigenetiske effekter og modulere DNA metylering i prostatakreftceller.
Denne studien ble gjennomført for å bestemme genom-wide effekter av SFN og DIM på arrangøren metylering i normale prostata epitelceller og prostatakreftceller. Vi hypotese at både SFN og DIM er effektive kosttilskudd modulatorer av DNA metylering grunn av deres hemmende effekt på DNMT uttrykk. Vi hypotese videre at SFN og DIM kan forskjellig påvirke arrangøren metylering profiler i normale og kreft prostata epitelceller, og omvendt avvik denaturert gener i prostatakreftceller. Vår studie vil øke vår forståelse av metylering målene for SFN og DIM, og gi innsikt i epigenetiske mekanismer som SFN og DIM utøve sin kreft chemopreventive effekter.
Materialer og metoder
Cell Culture og behandling betingelser
Normale menneskelige prostata epitelceller (PREC) ble hentet fra Lonza (Allendale, NJ) og dyrket i PREC basale medier som inneholder PrEGM SingleQuot Kit kosttilskudd og vekstfaktorer (Lonza, Allendale, NJ). Humane androgen-avhengig prostata kreft epitelceller (LNCAP) og androgen-uavhengig prostatacancer epitelceller (PC3) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA), og dyrket i RPMI 1640 media supplert med 10% føtalt bovint serum. Alle celler ble dyrket i fuktig inkubator med 5% CO
2 og 37 ° C. SFN (LKT Laboratories, St. Paul, Minnesota) og DIM (Sigma, St. Louis, MO) ble oppløst i dimetylsulfoksyd (DMSO). Prec, LNCaP og PC3 cellene ble behandlet med kjøretøykontroll (0,03% DMSO), 15 mikrometer SFN, eller 15 mikrometer DIM i biologiske triplicates for bruk i DNA-metylering arrays. Behandlingen dosen ble valgt for å reflektere fysiologisk relevante konsentrasjoner av SFN og DIM [21], [22]. Celler ble samlet i 48 timer etter behandling for bruk i metylering analyser eller Chromatin Immunoutfellingsunder (chip) analyser. For genuttrykk analyser ble cellene samlet inn 72 timer etter behandling. I gruppene behandlet med DNA demethylating agent, 5-aza-2′-deoxycytidine (AZA), 5 mikrometer AZA ble brukt, og cellene ble samlet i 48 timer etter behandling.
Prøvepreparering for DNA Metylering Array
i alt 27 prøver ble sendt inn for DNA-metylering rekke analyse, inkludert prøver fra hver av de tre cellelinjene som ble behandlet med bærerkontroller (n = 3 per cellelinje), DIM (n = 3 per cellelinje), og SFN (n = 3 per cellelinje). Genomisk DNA ble isolert ved anvendelse av DNeasy Blood Biocomputing kjernefasilitet (Oregon State University, Corvallis, OR) for prøve merking, prøve hybridisering og utvalg skanning. Eksempel hybridisering og utvalg skanning ble gjort ved hjelp av NimbleGen Hybridisering System 4 (Roche) og Axon GenePix Pro 4200 A (Molecular Device, Sunnyvale, CA), henholdsvis.
DNA Metylering Array Data Analysis
NimbleGen menneskelig DNA Metylering 3 × 720 K CpG Island Plus RefSeq Arrangøren Array (Roche) basert på HG18 genomet utgivelsen ble brukt. Matrisen inneholdt 720.000 sonder på 50-75 bp i lengde med en median sonde avstand på 104 bp, som dekker 30,848 karakterutskrifter, 22,532 arrangører, og 27,728 CpG øyer. Den rå intensiteter av det skannede bildet for både Cy5 og Cy3 kanaler ble hentet med NimbleScan (Roche). De rå intensitet par filer ble importert til R statistiske programmeringsmiljøet ved hjelp av tilpassede R programvare.
Identifikasjon av sonder med betydelig skalert log
2 ratio.
Signalintensitetsforhold, ble generert ved å trekke loggen forvandlet IP kanal intensiteter fra logg forvandlet inngangskanal intensiteter. Forholdene var sentrert på en per prøve basis av Tukey-biweight funksjon. Prober med betydelig skalert log
2 ratio ble identifisert ved NimbleScan programvare ved hjelp av standardparameterne som fastsatt av produsenten.
Differensial metylering fold-endring mellom cellelinjer og /eller behandlinger.
Parvise sammenligninger ble utført gjennom re-parametriseringen å bestemme cellelinje og behandlingseffekter. Standard feil og grader-av-frihet ble trukket ut og brukes til å bygge t-statistikk og bestemmelse av betydning.
metylering array-data ble satt inn NCBI Gene Expression Omnibus, tiltredelse antall GSE47017.
En liste over sonder med betydelig log2 fold-endring (p-verdi 0,05) sammenligner mellom behandling (SFN eller DIM) versus kjøretøykontroll, eller sammenlikne mellom prostatakreftceller (kjøretøykontroll) versus normale prostata epitelceller (kjøretøykontroll) ble generert . Prober med betydelig fold-endring ble kartlagt til kommentert funksjoner i det menneskelige genom (HG18) og visualisert ved hjelp av Generic Genome Browser (GBrowse) [23]. Sonder innenfor 2 kb oppstrøms og 1 kb nedstrøms transkripsjon start hotellet (TSS) ble inkludert i analysene i denne rapporten. Hierarkiske clustering analyser ble gjort ved hjelp av MeV programvare [24]. Venn-diagrammer som sammenligner overlapping av ulike gen-listene ble generert med BioVenn [25]. Gene berikelse og funksjonelle merknads analyser ble gjort ved hjelp av Database for kommentering, visualisering og integrert Discovery v6.7 (DAVID) [26]. Funksjonell annotering clustering verktøyet ble brukt til å bestemme betydelig beriket Gene ontologi (GO) termer innenfor hvert merknads klynger. Epigenome kartlegging av vesentlig forskjellig denaturert sonder for å kode histone modifikasjon databasen ble gjort ved hjelp av EpiExplorer [27].
Validering av DNA Metylering data
Velg differentially denaturert gener som bestemmes av NimbleGen metylering utvalg ble godkjent av pyrosekvensering. Genomisk DNA ble behandlet med natriumbisulfitt ved hjelp EpiTech Bisulfite Kit (Qiagen). Pyrosekvensering PCR og sekvense primere for å velge forskjellig denaturert gener ble utformet ved hjelp PyroMark analysen Design versjon 2.0.1-programvaren (Qiagen) (tabell S1). PCR forsterkning av sulfitt-konvertert genomisk DNA ble gjort ved hjelp av PyroMark PCR kit (Qiagen) under forhold som spesifisert av produsenten. PCR produktene ble sendt til Stanford University Protein og Nucleic Acid Facility (Palo Alto, California) for pyrosekvensering. Kvantitative metylering analyser ble gjort ved hjelp av PyroMark Q23 versjon 2.0.6-programvaren (Qiagen).
genuttrykk Analyser
Total RNA fra behandlede celler ble isolert ved hjelp Trizol (Life Technologies). Total RNA ble revers transkribert til cDNA ved hjelp av Super III First-Strand Synthesis SuperMix for QRT-PCR (Life Technologies). Genekspresjon ble kvantifisert ved qPCR ved hjelp av følgende qPCR primere: human DNMT1 (forover: 5′-GTGGGGGACTGTGTCTCTGT-3 «, omvendt: 5′-TGAAAGCTGCATGTCCTCAC-3′), DNMT3A (forover: 5»-CACACAGAAGCATATCCAGGAGTG-3 «, omvendt: 5»-AGTGGACTGGGAAACCAAATACCC-3 «), DNMT3B (forover: 5′-AATGTGAATCCAGCCAGGAAAGGC-3′, omvendt: 5»-ACTGGATTACACTCCAGGAACCGT-3 «), GAPDH (forover: 5′-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3′, omvendt: 5»-TTCACACCCATGACGAACAT -3 «), CCR4 (forover: 5′-AATTGTGCACGCGGTGTTTT-3′, omvendt: 5»-TCCAGGGAGCTGAGAACCTT-3 «), CXCR4 (forover: 5′-GAACTTCCTATGCAAGGCAGTCC-3», omvendt: 5’CCATGATGTGCTGAAACTGGAAC-3 «) , CYR61 (fremover: 5»-CTTAGTCGTCACCCTTCTCCAC-3 «, omvendt: 5′-CAGGGTCTGCCCTCTGACT-3′), og TGFBR1 (forover: 5»-CCTCGAGATAGGCCGTTTGT-3 «, omvendt: 5′-ATGGTGAATGACAGTGCGGT-3»). Alle qPCR reaksjoner ble gjort ved hjelp av Fast SYBR Grønn Mastermix (Life Technologies) på 7900 HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Genekspresjon ble normalisert til GAPDH og relativ kvantifisering ble bestemt ved hjelp av ΔΔCt metoden i RQ Manager-1.2.1-programvaren (Applied Biosystems).
Chromatin Immunpresipitasjon (chip) Analyser
chip analyser ble gjort som tidligere beskrevet med mindre modifikasjoner [28]. I korthet, ble behandlede cellene fiksert i formaldehyd og kromatin ble skåret ved sonikering. Protein /DNA komplekser ble immunopresipitert med spesifikke antistoffer mot H3K4me3 (Abcam, Cambridge, MA). Negativ kontroll chip ble gjort ved hjelp av normal IgG. Etter immunoutfelling, tverrbinding reversering, og proteinase K-behandling, ble ChIP DNA renset ved hjelp av fenol-kloroform-ekstraksjon. ChIP-qPCR primere ble designet for å forsterke bestemte TGFBR1 og CYR61 promoter regioner som viste differensial metylering grunn DIM behandling (TGFBR1 frem: 5′-GGATCGGGAAGGGGTTTGAG-3 «, omvendt: 5′-CCCTTCACATGCGACTCACT-3′; CYR61 fremover: 5» CTCCCACCCCTAACCCTCTA-3 «, omvendt: 5′-GGCCCTTAGTGCTAATGCTGA-3»). Spon qPCR reaksjoner ble utført i triplikat, og kvantifisering av immunopresipitert DNA-prøver ble utført ved anvendelse av en standardkurve utviklet fra seriefortynninger av renset DNA-inngang. Resultatene ble beregnet som prosent av tilført DNA (% input) og rapportert som relativ fold-endring i forhold til DMSO kjøretøy kontroll.
Statistical Analysis
Statistisk testing av EpiExplorer overlappingsverdier for å avgjøre om å velge metylering sonder lapper betydelig mer enn forventet ved en tilfeldighet (randomisert kontroll) med H3K4me3 og H3K9ac toppene i kode data base ble gjort ved hjelp av sekvensielle Monte Carlo multippel testing (MCFDR) algoritme i Genomisk HyperBrowser [29], [30]. Statistisk forskjell mellom DNA-prober assosiert med DIM-mediert øket eller redusert metylering og deres respektive overlapper med histon farge ble bestemt ved to-prøve t-test andel i SciPy (https://scipy.org). Resterende statistiske analysene ble utført ved hjelp av GraphPad Prism versjon 5.02 (GraphPad, La Jolla, CA), der data ble rapportert som gjennomsnitt ± SEM, og p-verdier ble bestemt med uparet t-test eller enveis ANOVA følge av Tukey-Krammer Multiple Comparison teste hvor hensiktsmessig. Statistisk signifikansnivå ble definert som α på 0,05.
Resultater
SFN og DIM Redusert DNMT Gene Expression og forårsaket Tydelig DNA metylering Profil Endringer Avhengig av prostatakreft cellelinje
vurderes virkningene av SFN og DIM på uttrykk for DNMT1, DNMT3A, og DNMT3B i normale prostata epitelceller (PREC), androgen-avhengige (LNCaP) og androgen-uavhengig (PC3) prostatakreftceller. LNCaP og PC3 cellene hadde signifikant høyere baseline uttrykk for DNMT1, DNMT3A, og DNMT3B forhold til PREC celler (Fig. 1a). I Prec og LNCaP celler, både SFN og DIM behandlinger redusert DNMT1 og DNMT3B genuttrykk (Fig. 1B og 1C). I PC3-celler, SFN betydelig redusert ekspresjon av alle tre DNMTs undersøkt, og DIM redusert ekspresjon av DNMT1 (Fig. 1D). Basert på dette resultatet, så vel som våre tidligere funn om at SFN kan megle promoter de-metylering i prostatakreftceller [18], utførte vi et genom-wide undersøkelse for å fastslå de globale virkningene av SFN og DIM på promoter DNA metylering i prec, LNCaP og PC3 cellene.
(A) Gene uttrykk for DNMT1, DNMT3A, og DNMT3B i ubehandlet PREC, LNCaP og PC3 celler (n = 3-5 per gruppe). Data representerer gjennomsnittlig normalisert fold-endring ± SEM forhold til prec. (B-D) Effekter av SFN og DIM på DNMT genuttrykk i PREC celler (B), LNCaP celler (C), og PC3 celler (D). Celler ble behandlet med bærerkontroll (DMSO), 15 uM SFN, eller 15 uM DIM (n = 6 pr gruppe B-D). DNMT1, DNMT3A, og DNMT3B genuttrykk ble analysert 48 timer etter behandling. Data representerer gjennomsnittlig normalisert fold-endring ± SEM forhold til DMSO. * P-verdi. 0,05
metylering status for individuelle sonder ble først identifisert i hver av de tre cellelinjer ved å sammenligne MeDIP-beriket versus inngangsprøver (skalert log2 ratio). Hierarkisk clustering analyse viste at PREC, LNCaP og PC3 fått klare metylering profiler (Fig. 2A). Deretter ble differensial metylering mellom prostatakreftceller og normale prostata epitelceller bestemt. Prober med sterk skalert log
2-forhold identifisert i LNCaP-celler og PC3-celler ble sammenlignet med de som er angitt i Prec celler via parvis sammenligning for å bestemme signifikant log2 brette forskjeller mellom prostatakreftceller og normale prostata epitelceller (LNCAP versus prec, og PC3 versus Prec). Alle påfølgende analyser av cellelinje og /eller behandlingseffekter referert til betydelige metylering endringer basert på log2 fold-change sammenligninger. LNCaP celler og PC3 cellene hadde 78,272 prober og 54,876 sonder, henholdsvis, som var vesentlig forskjellig metylert i forhold til normal PREC celler (Fig. 2B). I PC3-celler hadde 64% av probene øket metylering, sammenlignet med 49% av sondene i LNCaP-celler som hadde økt i forhold til metylering Prec. Siden metylering profilen av hvert gen ble bestemt ved en flerhet av sonder, bestemt vi det midlere nivå metylering per-genet ved å midle de betydelige log2 fold-forandring av alle probene som er tilordnet de enkelte gener. Dette representerte 10,315 og 8,013 differensielt denaturert gener i LNCaP og PC3 celler, henholdsvis i forhold til PREC celler (Fig. 2C). Vi har observert at de fleste av sonder innenfor hvert gen hadde lignende metylering endringer, hvor mer enn 92% hadde enten økes eller reduseres metylering. Kun 7,4% av sondene i LNCaP-celler og 4,2% av probene i PC3-celler hadde blandet metylering profil innenfor hver genet (data ikke vist). Log2 fold-endring per genet varierte fra -3,322 til 2,893 i LNCaP celler, og -2,411 til 2,941 i PC3 celler. Funksjonell merknad analyser viste at gener med endret metylering profil i prostatakreftceller ble beriket i gener som er feilregulert eller involvert i kreft progresjon, inkludert GO kategorier forbundet med cellemigrasjon, celle adhesjon, celle-cellesignalisering, samt transkripsjon regulering (data ikke vist). Velg gener med differensial metylering basert på NimbleGen metylering matrisen ble validert av pyrosekvensering (figur S1).
(A) Hierarkisk clustering analyse av sonder med betydelig skalert log
2 forholdet i Prec, LNCaP og PC3 celler. Grønne og røde søyler representerer individuelle sonder med betydelig redusert og øket metylering, henholdsvis, av MeDIP DNA-prøver i forhold til inngangs DNA-prøver. Data representerer topp 1000 mest betydnings sonder innenfor hver cellelinje. (B) En sammenligning av metylering endringer i LNCaP og PC3-celler i forhold til prec celler. Betydelige metylerte prober i LNCaP og PC3-celler ble sammenlignet med Prec, og fordelingen av prober med betydelig log2 brette endringene er vist. (C) Gjennomsnittlig metylering nivå i enkelte gener i LNCaP og PC3 celler i forhold til prec. Log2 fold-endring per genet ble bestemt som gjennomsnittet av log2 fold-endring av alle ulikt denaturert sonder tildelt hvert gen, og representert som boksen og whisker plott. Nummer over linjen angir antall gener i hver gruppe. Værhår representerer maksimum og minimumsverdier, og «+» representerer gjennomsnittsverdien.
Vi neste undersøkte effekten av SFN og DIM på arrangøren metylering profiler i hver prostata cellelinje. Log2 fold-endring ble sammenlignet mellom SFN eller DIM behandlinger i forhold til DMSO kjøretøy kontroll i Prec, LNCaP og PC3 celler. SFN behandlinger resulterte i betydelig log2 fold-endring i 6,154 sonder i PREC celler, 9,302 sonder i LNCaP celler, og 20,783 sonder i PC3 celler (fig. 3A), som representerer 2472, 3508, og 6,778 differensielt denaturert gener, henholdsvis (fig. 3B ). DIM behandlinger indusert betydelig log2 fold-endring i 8,970 sonder i PREC celler, 15,237 sonder i LNCaP celler, og 7,386 sonder i PC3 celler, som representerer 3224, 4404 og 2,394 differentially denaturert gener, henholdsvis (fig. 3B). Individuelle sonder innen hvert gen hadde lignende metylering endringer, hvor mer enn 95% av probene hadde enten økes eller reduseres metylering, og meget få gener hadde blandet metylering profil (mindre enn 5% av sondene i SFN-behandlede celler og mindre enn 2,5 % av sondene i DIM behandlede celler) (data ikke vist). Utvalget av fold-endring på grunn av SFN og DIM behandlinger var mellom -1,380 til 1,243, og var smalere i forhold til de som ble observert ved sammenligning av prostatakreftceller kontra normale prostata epitelceller (Fig. 2B). Fordeling av de differensielt metylerte prober innenfor promotoren ble undersøkt og viste ingen preferensiell forspenning til spesifikke promoter-regioner (data ikke vist).
(A) Effekter av SFN og DIM på metylering profilen i Prec, LnCap, og PC3 celler i forhold til kjøretøykontroll. I hver av de tre cellelinjer, ble signifikante metylerte prober i SFN eller DIM-behandlede grupper i forhold til deres respektive bærerkontrollen for å bestemme sondespesifikke log2 fold-endring. Fordelingen av sonder med betydelig log2 fold-endring er vist. (B) Gjennomsnittlig metylering nivå i enkelte gener i SFN og DIM-behandlet PREC, LNCaP og PC3 cellene i forhold til kjøretøykontroll. Log2 fold-endring per genet ble bestemt som gjennomsnittet av log2 fold-endring av alle ulikt denaturert sonder tildelt hvert gen, og representert som boksen og whisker plott. Nummer over linjen angir antall gener i hver gruppe. Værhår representerer maksimum og minimumsverdier, og «+» representerer gjennomsnittsverdien.
Venn-diagram analyser viste at SFN og DIM hvert endret metylering i forskjellige sett med gener i hver av cellelinjer. Sammenligning av settene av gener endret ved SFN eller DIM viste at bare et lite antall gener (219 og 209 gener, respektivt) ble delt mellom alle tre cellelinjer, som representerer mellom 3% til 9% av differensielt denaturert gener i hver celle linje (fig. 4A). Av dette kjerne sett av gener, det var ~ 30% overlapping mellom SFN og DIM behandlinger. I kontrast, var det en høy grad av overlapping av gener påvirkes av både SFN og DIM behandlinger innenfor PREC og LNCaP celler (1,926 gener og 2,671 gener, henholdsvis), og i mindre grad PC3 celler (1,408 gener) (Fig. 4B) . Lignende resultater ble oppnådd når vi oppdeles datasettene inn i gener med øket metylering eller redusert metylering (data ikke vist). Funksjonell annotering analyser viste ulike sett av anriket gener i normal prostata epitelceller i forhold til prostata kreftcellene, men tilsvarende sett av gener ble anriket ved sammenligning SFN og DIM behandling innen hver cellelinje (Fig. 5). I Prec celler, gener som er involvert i transkripsjon, apoptose og kromatin organisasjon /modifikasjon ble beriket med både SFN og DIM behandlinger. I LNCaP celler, ble to generelle kategorier av gener beriket. De første involverte gener assosiert med celle bevegelse, inkludert cellemigrasjon, heft, og lokalisering. Den andre involverte gener assosiert med immunrespons, inkludert betennelse og forsvar, leukocytt aktivering og immunregulering. Funksjonell merknad analyse i PC3 cellene viste beriket genet kategorier delte likhet med både PREC og LNCaP, inkludert gener involvert i transkripsjon, apoptose, cellemigrasjon, og immunrespons.
(A) Venn-diagrammer som viser antall gener som ble ulikt metylert i Prec, LNCaP og PC3 cellene ved behandling med SFN eller dim i forhold til kjøretøykontroll. (B) Venn-diagrammer som viser antall differensielt denaturert genet målene for SFN og DIM innenfor hver cellelinje.
Funksjonell merknads av ulikt denaturert genet målene for SFN og DIM i Prec, LNCaP og PC3 celler ble undersøkt og antall gener involvert i utvalgte biologiske prosesser og funksjoner ble vist. Data er uttrykt som antall gener i hvert betydelig beriket GO kategori.
SFN og DIM Reversed kreft-assosiert DNA metylering Endringer i LNCaP celler
Deretter gis mer betydelig reduksjon i DNMT1 og DNMT3B med både SFN og DIM behandling i LNCaP celler, valgte vi å fokusere på å karakterisere en undergruppe av gener som var differensielt denaturert i LNCaP celler i forhold til PREC celler, og ble reversert med SFN og /eller DIM behandlinger. Av de 10,315 gener som hadde differensial metylering i LNCaP celler (Fig. 2C), SFN og DIM behandlinger reversert metylering profiler av 1,509 (14,6%) og 2,219 (21,5%) gener, henholdsvis (fig. 6A). Disse genene tilhørte to kategorier: 1) gener som hadde økt promoter metylering i LNCaP celler i forhold til PREC celler, og reduserte metylering på SFN og /eller DIM behandling, og 2) gener som hadde redusert promoter metylering i LNCaP celler i forhold til prec celler og økt metylering ved SFN og /eller DIM behandling. Et eksempel på et gen som hører til hver kategori, C-C kjemokin reseptor type 4 (CCR4) og transformerende vekstfaktor-β1 reseptor type I (TGFBR1), som ble vist i fig. 6B. Funksjonell merknad analyser viste GO berikelse for mange gener som er kjent for å være dysregulerte eller er sterkt involvert i kreft progresjon. Dette datasettet er inkludert gener som er involvert i celleadhesjon og kjemotaksis, samt immun-relaterte gener som er involvert i inflammasjon og forsvar, cytokin-binding, og immun utvikling (Fig. 6C). Venn diagram sammenligning viste at 86% av genene i genet listen SFN (1309 av 1509) ble delt med DIM-genet listen (fig. 6D). Siden de fleste av gener som påvirkes av SFN ble inkludert i DIM genet liste, analyser påfølgende genekspresjon fokusert på utvalgte gener hvor DIM behandling reverserer den feilregulert metylering profil i LNCaP celler.
(A) Antall differensielt denaturert gener i LNCaP celler i forhold til PREC celler som ble reversert med SFN eller DIM behandlinger. Svart strek representerer gener som hadde redusert metylering i LNCaP celler som ble økt med SFN /DIM behandlinger. Hvit søyle representerer gener som hadde økt metylering i LNCaP celler som ble redusert med SFN /DIM behandlinger. (B) To genet eksempler, CCR4 og TGFBR1, med feilregulert metylering profiler i LNCaP celler som ble reversert med SFN og /eller DIM behandlinger. Fargede stolpene representerer genomisk posisjon av DNA metylering sonder som hadde redusert metylering (blå) eller øke metylering (rød) når man sammenligner sonden spesifikke log2 fold-endring i LNCaP celler versus PREC, eller DIM versus DMSO kjøretøy kontroll i LNCaP celler. TSS (blå sirkel) representerer transkripsjon start stedet av hvert gen. (C) Funksjonell annotering av ulikt denaturert genet mål i LNCaP celler som ble reversert med SFN eller DIM behandlinger. (D) Venn-diagram som viser antall gener mål med arrangøren metylering som ble feilregulert i LNCaP celler og reversert med SFN eller DIM.
Fire gener (TGFBR1, cystein-rik angiogen induser 61 (CYR61) , CCR4, og CXC kjemokin reseptor type 4 (CXCR4)) ble utvalgt for ytterligere å undersøke sammenhengen mellom endring i promotoren metylering profil og genekspresjon i LNCaP-celler. Arrangøren metylering profiler av hver av disse fire gener ble endret i LNCaP celler i forhold til PREC celler, og DIM behandling reversert kreft-assosiert metylering profiler. Ekspresjonen av hvert av de fire kandidatgener har blitt rapportert å være dysregulerte på kreft, og korreleres med progresjon av kreft.
