Abstract
Bakgrunn
ciglitazon tilhører tiazolidindioner klassen av antidiabetika familie og er en høy-affinitet ligand for peroksisomproliferator-aktivert reseptor γ (PPARy). Bortsett fra sin antidiabetiske aktivitet, viser dette molekylet antineoplastiske effektivitet i mange kreftcellelinjer.
Metodikk /hovedfunnene
Ved hjelp RT4 (avledet fra en godt differensiert grad I papillær tumor) og T24 (avledet fra en udifferensiert klasse III-karsinom) blærekreftceller, undersøkte vi muligheten av ciglitazon til å indusere apoptotisk celledød og karakteriseres de molekylære mekanismer som er involvert. I RT4 celler, legemiddelindusert G2 /M cellesyklus arrest preget av en overekspresjon av p53, p21
waf1 /CIP1 og p27
Kip1 i concomitance med en nedgang på cyclin B1. Tvert imot, i T24 celler, det utløste apoptose
via
ytre og indre trasé. Cellesyklus arrest og induksjon av apoptose skjedde ved høye konsentrasjoner gjennom PPARy aktiveringsuavhengig veier. Vi viser at
in vivo
behandling av naken mus ved ciglitazon hemmer høy klasse blærekreft xenograft utvikling. Vi identifiserte en roman mekanisme som ciglitazon dreper kreftceller. Ciglitazon oppregulert løselig og membranbundet TRAIL og la TRAIL-resistente T24 celler til å svare på sti gjennom caspaseaktivering, død receptor signalveien og Bud cleavage. Vi gitt bevis for at TRAIL-indusert apoptose er delvis drevet av ciglitazon-mediert nedregulering av c-FLIP og survivin proteinnivåer gjennom en proteasome avhengig nedbrytning mekanisme.
Konklusjon /Betydning
Derfor , ciglitazon kan være klinisk relevant som chemopreventive eller terapeutisk middel for behandling av TRAIL-ildfast høy klasse uroteliale kreft
Citation. Plissonnier ML, Fauconnet S, Bittard H, Lascombe i (2011) antidiabetika ciglitazon induserer High Grade blærekreft Cells apoptose gjennom oppregulering av TRAIL. PLoS ONE 6 (12): e28354. doi: 10,1371 /journal.pone.0028354
Redaktør: Laszlo Buday, ungarske Academy of Sciences, Ungarn
mottatt: 16 august 2011; Godkjent: 07.11.2011; Publisert: 12.12.2011
Copyright: © 2011 Plissonnier et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler fra Ligue Nationale Contre le Cancer (Comité du Doubs). M.L. Plissonnier ble støttet av et fellesskap fra Cancéropôle du Grand-Est. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
urothelial carcinoma av blæren står for ~ 5% av alle kreftdødsfall hos mennesker. Flertallet av blære svulster (75%) er ikke muskel-invasiv ved diagnose og etter lokal kirurgisk behandling, har en høy risiko for tilbakefall og en tilbøyelighet til å utvikle seg i klasse eller stadium [1]. Muscle invasive svulster (25%) har en dårligere prognose [2] siden 50% av pasientene vil få tilbakefall med metastatisk sykdom innen 2 år etter behandling. Til tross for fremskritt med kirurgi og intravesikal immun- og kjemoterapi i behandling av pasienter, og selv om nye kjemoterapeutika (tyrosinkinasehemmere, anti-angiogenic agenter …) er brukt, har ingen forbedring i overlevelse observert. Således, utvikle nye effektive kjemoterapeutiske regimer med færre bivirkninger er absolutt nødvendig for å minske sykelighet og dødelighet hos urothelial karsinom.
Tiazolidindioner (TZD), inkludert rosiglitazon, troglitazon, pioglitazon og ciglitazon er en klasse av insulin- allergifremkallende stoffer. Dessuten, rosiglitazon og pioglitazon er for tiden i klinisk bruk for behandling av type II diabetes for millioner av pasientene. Disse TZD er høy-affinitet kjemisk syntetiserte ligander for peroksisomproliferator-aktivert reseptor γ (PPARy) [3], [4]. PPARy er en ligand-aktiverte transkripsjonsfaktor av atom hormon reseptor super. I tillegg til dets kjente rolle i regulering av metabolisme og inflammasjon, og PPARy også vært implisert i karsinogenese basert på studier som viser dens evne til å modulere cellulær differensiering, proliferasjon og apoptose. Bortsett fra deres antidiabetiske aktivitet, TZD lokke fram veksthemmende effekter
in vitro
på kreftceller i ulike vev opprinnelse og
in vivo product: [5]. Noen studier indikerer at pioglitazon eller troglitazon oppviste antiproliferative eller pro-apoptotiske aktivitet overfor blærekreftcellelinjer [6] – [9] og i rotte urothelium [10]. Bare én studie rapporterte at ciglitazon utstilt hemmende effekt på celle nummer i en rekke cellelinjer modellering metastatisk overgangsordning celle carcinoma av blæren (TSU-PR1, TSU-PR1-B1 og TSU-PR1-B2) [6].
apoptose skjer
via
to separate ennå sammenkoblede signalmekanismer: extrinsic død reseptor-indusert pathway aktiveres av proapoptotiske reseptor signaler på celleoverflaten, og den iboende mitokondriene-mediert pathway aktiveres av mitokondrie signaler fra i celle [11]. De viktigste mediatorer av apoptose er caspaser, en familie av cysteinproteaser som spalter et kritisk sett av cellulære proteiner i nærheten av spesifikke asparaginsyrerester.
Blant mulige effektive antikreftbehandlinger, TRAIL (TNFa-relatert apoptose induserende ligand) er en lovende anti-neoplastiske midlet, fordi den induserer apoptose i kreftceller med bare ubetydelig effekt på normale celler [12]. TRAIL utløser caspase kaskade
via
extrinsic apoptotiske sti gjennom interaksjon med TRAIL-responsive dødsreseptorer (DR), for eksempel DR4 og DR5, som fører til dannelsen av den dødsinduserende signale kompleks (DISC), rekruttering og rask aktivering av caspase 8. i type i celler, TRAIL-R-indusert caspase-8 aktivering resulterer direkte i nedstrøms caspaseaktivering og apoptose, mens i type II celler caspase-8 aktivering er ineffektiv og signalet må forsterkes gjennom caspase- 8-spaltning av pro-apoptotiske Bid protein og aktivering av mitokondriell apoptotisk reaksjonsvei [13] via caspase 9 aktivering. Både caspaser 8 og 9 aktivere skarp caspase 3, som er den primære aktivator av apoptotisk DNA-fragmentering og fører til kreftcelle apoptose [14].
Survivin og cellulær FLICE-inhiberende protein (c-FLIP) er nedstrøms og oppstrøms anti-apoptotiske regulatorer av den apoptotiske signalkaskade, respektivt.
i likhet med andre inhibitorer av apoptose (IAP), survivin virker på nedstrømssiden av mitokondrier for å hindre behandling eller aktivering av kaspase-initiator 9, som fører til hemming av aktiviteten av effektor caspaser. Imidlertid er rollen til Survivin ikke begrenset til apoptose inhibering, men også involverer regulering av celledeling [15]. C-FLIP er den viktigste protein som hindrer caspase 8 fra aktivering av dødsreseptorer gjennom binding til Fas-forbundet død domene og caspase 8 på DISC. Selv om flere spleise isoformer av c-FLIP-mRNA er blitt beskrevet, bare to av dem, c-FLIP
S og c-FLIP
L, er betydelig studert på proteinnivået. Begge proteiner kan rekrutteres til døden-induserende signale komplekse og hemme død reseptor-mediert apoptose [16]. Både c-FLIP
L og c-FLIP
S er rask omsetning proteiner; dermed deres nivå er gjenstand for regulering av ubiquitin /proteasome-mediert degradering [17], [18].
Resultater fra prekliniske studier med rekombinant TRAIL har vist sin betydelige anti-tumor aktivitet, noe som indikerer potensial for å utnytte TRAIL som et anticancermiddel [19]. Til tross for dette proapoptotiske rolle TRAIL i de transformerte celler, mange kreftcellene utvikler resistens mot TRAIL-indusert apoptose. Således er det blitt rapportert at blærecancercellelinjer, slik som T24 og HT1376, er TRAIL-resistente [20]. Identifisering av narkotika eller midler som kan overvinne TRAIL motstand og sensitize kreft celler mot TRAIL-indusert apoptose er derfor kritisk viktig for målretting TRAIL-resistente kreftceller. Kombinasjonen av TRAIL med stråling og noen kjemoterapeutiske midler [21], [22] har gitt begrenset suksess, fordi denne kombinasjonen også resulterte i en økning i systemisk toksisitet.
Den foreliggende studien rapportert effekten av ciglitazon på RT4 (avledet fra en godt differensiert grad I papillær tumor) og T24 (avledet fra en udifferensiert klasse III karsinom) blære kreft cellelinjer. Valget av disse spesielt blærekreft cellelinjer er relevant siden i RT4 celler, er P53 villtype og mesenchymale markør N-cadherin er ikke uttrykt mens epitel markør E-cadherin er oppdaget. Omvendt, i T24-celler er p53 mutert og E-cadherin er fraværende og erstattet med N-cadherin [23]. Dermed avhengig av differensiert tilstand av cellene, viste vi at ciglitazon individuell behandling indusert G2 /M fase cellesyklus arrest men utløste apoptose bare i T24 høy klasse blærekreftceller gjennom PPARy aktiveringsuavhengige mekanismer. I tillegg, for første gang til vår kunnskap, behandling av nakne mus ved ciglitazon svekker betydelig vekst av høy klasse blære tumorxenotransplantater bekrefter våre
in vitro
resultater. Mest interessant, kombinasjonen av ciglitazon og TRAIL vises som ciglitazon la TRAIL-ildfast T24 celler til å svare på TRAIL. For første gang i blærecancerceller, vi viste at ciglitazon-mediert oppregulering av TRAIL og en markert reduksjon av c-FLIP og Survivin mediert delvis gjennom en proteosomal nedbrytningsprosessen bidrar til ciglitazon-indusert celledød og til den sensibiliserende virkning av denne TZD på TRAIL-indusert apoptose.
Resultater
ciglitazon blokker RT4 (lav karakter) og T24 (høy grad) celler i G2 /M fase, men induserer apoptose bare i T24 celler gjennom caspase aktivering
for å undersøke effekten av ciglitazon på RT4 og T24 blærekreftceller apoptose ble cellene behandlet med varierende konsentrasjoner av stoffet (5-60 mm) i 24 timer og vurderes for propidiumjodid- farget DNA innhold ved hjelp av flowcytometrisk analyse. Som vist i figur 1A, i RT4 celler, medikamentinduserte en doseavhengig økning av celler i G2 /M-fasen av cellesyklusen i forbindelse med en økning av ekspresjon nivå av p53, p21
Cip1 /Waf1 og p27
Kip1 og en nedgang på cyclin B1 proteinnivå (figur 1B). Men det var ingen signifikant økning av sub-G1 populasjon sammenlignet med ubehandlede kontrollceller (figur 1C) som indikerer at en 24 h-ciglitazon behandling ikke indusere apoptose i disse celler, selv ved en høy konsentrasjon av 60 uM medikament. Dessuten, ciglitazon fremkalte ikke spaltning av kaspase 3 og dets substrat PARP (figur 1D).
Cellene ble behandlet i 24 timer med eller uten ciglitazon ved de angitte konsentrasjoner. (A) Prosent av celler som viser cellesyklusfordelingen. (C) Hypodiploid DNA innhold (sub-G1 peak). (B), (D) Etter behandling ble cellene høstet og totale proteinekstrakter ble utsatt for immunblot for påvisning av procaspase 3, PARP, p53, p21
Cip1 /Waf1, p27
Kip1 og cyclin B1. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll lasting. Dataene som vises, er representative for 3 uavhengige eksperimenter utført in triplo.
Som observert for RT4 celler, var det en doseavhengig økning av G2 /M fraksjon av T24-celler (data ikke vist), men i motsetning til RT4 celler, analyse av nukleært DNA fordeling i T24-celler viste en doseavhengig økning av sub-populasjonen G1 med ~40% celledød fra 40 uM konsentrasjon (figur 2A). For å karakterisere celledød veien utløst av ciglitazon, spalting av caspaser 9, 8, 3 ble bestemt ved Western-blotting-analyse. Fra en 40 mM konsentrasjon av medikament, en betydelig forbedret behandling av både caspase 9 og kaspase 8 til deres aktive fragmenter ble påvist (figur 2B). Caspase 3 som representerer den klassiske nedstrøms utførelse enzym av kaspase 8 og 9 ble spaltet til den aktive formen (20/18 kDa). Aktivering av kaspase 3 ble bekreftet ved spaltning av pro-formen PARP (116 kDa) til den inaktive formen (85 kDa) (figur 2B). Som vist i figur 2C, mens p53 og Bax uttrykk nivåer var uendret, ble BCL-2 drastisk redusert, og budet ble avkortet. Disse resultatene indikerte at T24 celler kunne forsterke den apoptotiske signalet gjennom mitochondria og oppfører seg som type II celler etter eksponering ciglitazon.
Celler ble eksponert i 24 timer til kjøretøyet eller ciglitazon ved de angitte konsentrasjoner. (A) Den prosentandelen av celler som viser hypodiploid DNA-innhold (sub-G1-topp) ble evaluert ved flow cytometri-analyse. (B), (C) Spaltningen av caspaser 9, 8, 3 og PARP, så vel som ekspresjon av pro- og anti-apoptotiske proteiner ble bestemt ved Western-blotting-analyse. (D,
forlot
) Cellene ble preinkubert en time med 50 mikrometer caspase 8 (Z-IETD-FMK) eller 9 (Z-LEHD-FMK) spesifikk hemmer før behandling med 40 mikrometer ciglitazon for 12 timer og vurdering av caspases 8, 9, 3 og Bud behandling ble analysert ved western-blotting. β-aktin ble benyttet som intern kontroll lasting; (D,
høyre
) Etter angitte behandlinger, ble cellene farget med PI for DNA-fragmentering analyse ved flowcytometri. Dataene er midler ± SD av 3 uavhengige eksperimenter utført i tre paralleller. *
P
0,05, signifikante forskjeller sammenlignet med ubehandlede celler; **
P
. 0,05, signifikante forskjeller sammenlignet med ciglitazon-behandlede celler med bruk av to-tailed uparede Student
t
test
caspase kaskade aktivering~~POS=HEADCOMP er en viktig begivenhet for apoptotiske prosessen. Som forventet, inkubasjon med caspase 8 (Z-IETD-FMK) eller 9 (Z-LEHD-FMK) spesifikke hemmere blokkeres caspases 8 eller 9 behandling (figur 2D, venstre panel) og reduserte ciglitazon-indusert apoptose som dokumentert av en signifikant reduksjon av sub-G1 befolkningen (figur 2D, panel til høyre) i forbindelse med en mindre caspase 3 cleavage (figur 2D, venstre panel). Disse dataene indikerer at RT4 og T24 celler ikke har en tilsvarende reaksjon på ciglitazon behandling. Faktisk ble ciglitazon-indusert apoptose begrenset til T24-celler, selv om det blokk T24 og RT4 celler ved G2 /M-fasen av cellesyklusen. I tillegg er de to viktigste apoptotiske veier, død reseptor og mitokondrie veier, ser ut til å være aktivert på T24 celler.
ciglitazon ikke handle gjennom PPARy transkripsjonen aktivering
For å finne ut om PPARy trans var kreves for ciglitazon-promocellesyklus-stans eller apoptose, ble RT4 og T24-celler behandlet i 24 timer med 40 uM av medikament alene eller i kombinasjon med 80 uM av GW9662, en irreversibel potent hemmer av PPARy. Handlingen av ciglitazon på G2 /M cellesyklus arrest i RT4 celler ble ikke hemmet (figur 3A, venstre panel). Som forventet, økt uttrykk nivå av p27
Kip1, observert med ciglitazon, ble ikke påvirket når GW9662 var forbundet med stoffet (figur 3A, panel til høyre). Virkningen av ciglitazon på T24 celledød (figur 3B, venstre panel) og caspase 3 spalting (figur 3B, høyre panel) ble ikke reversert i nærvær av PPARy-antagonist. Således GW9662 ikke hadde noen hemmende virkning, men likevel var det effektive siden i T24-celler, det blokkerte overekspresjon av A-FABP PPARy mål på ciglitazon behandling (figur 3C) som tidligere rapportert [24]. Tatt sammen, dette sett av eksperimenter fastslått at i T24 blærekreftceller, ciglitazon apoptose gjennom PPARy-aktivering uavhengige signalveier.
RT4 og T24-celler ble behandlet i 24 timer med 40 uM av ciglitazon alene eller i kombinasjon med 80 pM av GW9662, en irreversibel potent hemmer av PPARy. (A,
venstre
) Akkumulering av RT4 celler i G2 /M-fasen av cellesyklusen ble analysert ved strømningscytometri-analyse; (A,
høyre
) Etter behandling ble helcellelysater fremstilt og 20 ug av total proteinekstrakt ble utsatt for immunblotting for deteksjon av p27
Kip1. (B,
forlot
) Prosentandelen av celler som viser hypodiploid DNA innhold (sub-G1 peak) ble evaluert ved flowcytometri analyse; (B,
høyre
) Etter behandling ble helcellelysater fremstilt og 15 ug av total proteinekstrakt ble utsatt for immunblotting for deteksjon av procaspase 3. (C) Bestemmelse av PPARy-antagonist GW9662 effektivitet på adipocytt-Fatty syrebindende protein (FABP-A), en kjent PPARy mål i T24 celler ved western-blotting-analyse. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll lasting. Dataene er midler ± SD av 3 uavhengige eksperimenter utført i tre paralleller. *
P
. 0,05, signifikante forskjeller sammenlignet med ubehandlede celler med bruk av to-tailed uparede Student
t
test
ciglitazon opp-regulerer løselig og membranbundet TRAIL i T24 celler
Vi har undersøkt hvorvidt ciglitazon kan modulere uttrykk for TRAIL i T24 og RT4 celler. Ved 40 uM ciglitazon eksponering, ble det observert en økning av TRAIL ligand nivå i T24 hele celleekstrakter som bestemt ved western-blotting, en økning av membranbundet TRAIL som vist ved strømningscytometri-analyse med spesifikk PE-konjugert TRAIL-antistoff, samt en økning på TRAIL nivå i T24 cellekondisjonerte medier bestemt av ELISA (Figur 4A). På den annen side, ciglitazon, som ikke induserer apoptose i celler RT4, ikke heve TRAIL i hele celleekstrakter, så vel som på celleoverflaten og i kondisjonert medium (figur 4B). Vi mener derfor at ciglitzone kan forårsake apoptose av høy klasse T24 blærecancerceller ved å øke TRAIL ekspresjon.
RT4 og T24-celler ble behandlet i 24 timer med ciglitazon ved 40 og /eller 60 uM. I RT4 (A) og T24 (B) celler, ble hele cellelysater analysert for TRAIL-ekspresjon ved western-blotting-analyse. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll lasting. Celler ble farget med anti-TRAIL-PE og analysert ved strømningscytometri. Etter 40 uM ciglitazon behandling i 24 timer ble kondisjonert medium oppsamlet, og konsentrasjonen av TRAIL ble målt ved hjelp av ELISA. Dataene er midler ± SD av 2 uavhengige eksperimenter utført i quadruplicates. *
P
0,05, signifikant forskjell sammenlignet med ubehandlede celler med bruk av to-tailed uparede Student
t
test. (C) Cellulære proteiner ble isolert fra T24-celler og underkastes immunblotting for deteksjon av DR4 og DR5. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll lasting. (D) T24 celler ble eksponert for 40 uM ciglitazon i 12 timer, farget med anti-DR4-PE eller anti-DR5-PE og analysert ved strømningscytometri. (E) T24 celler ble preinkubert med eller uten monoklonale antistoffer som blokkerer DR4 og DR5 reseptorer (5 mg /ml) i 1 time og stimulert i 12 timer med 40 uM ciglitazon eller 50 ng /ml TRAIL for RT4 celler (
innsats
). Prosentandelen av celler som viser hypodiploid DNA-innhold (sub-G1-topp) ble evaluert ved flow cytometri-analyse. Dataene er midler ± SD av 3 uavhengige eksperimenter utført i tre paralleller. *
P
0,05, signifikante forskjeller sammenlignet med ubehandlede celler; **
P
. 0,05, signifikante forskjeller sammenlignet med ciglitazon-behandlede celler med bruk av to-tailed uparede Student
t
test
ciglitazon gjorde ikke påvirke DR4 og DR5 uttrykk i T24 celler
i T24 celler, har vi vist en caspase 8 cleavage og økningen av TRAIL av ciglitazon. For å analysere hvorvidt ciglitazon-indusert celledød er avhengig av modifikasjon av død reseptorekspresjon ble cellene behandlet med 40 eller 60 uM medikament i 24 timer. Vi demonstrerte at ciglitazon ikke endre DR4 og DR5 uttrykksnivå som målt i helcellelysater ved western-blotting (figur 4C), så vel som deres celleoverflate-ekspresjon som vist ved strømningscytometri-analyse med spesifikke PE-konjugerte antistoffer (Figur 4D). For å undersøke om ciglitazon-utløst apoptose var en funksjon av død reseptor signalisering forsterkning, ble DR4 og DR5 stimulering blokkert av pre-inkubasjon av cellene med å blokkere anti-DR4 eller anti-DR5 antistoffer før behandling. Den inaktivering av både DR4 og DR5 betydelig redusert ciglitazon-fremmet apoptose (figur 4E). For å validere død reseptor blokkerende antistoffer effektivitet i de konsentrasjoner som brukes, utsatte vi TRAIL-sensitive RT4 celler til TRAIL som en positiv kontroll (figur 4E, innsats). Som forventet, inaktivering av hver av reseptorene fullstendig hemmet TRAIL-fremkalt apoptose. Disse dataene viser at ciglitazon aktiverer ytre apoptotiske sti gjennom DR4 og DR5.
ciglitazon hemmer blære svulst xenograft utvikling i nakne mus
For å undersøke antitumor effekt av ciglitazon
in vivo
(figur 5), T24 og RT4 celler samt ble subkutant injisert i seks uker gammelt-kvinne atymiske nakne mus. Når håndgripelig svulster ble dannet, ble musene behandlet av kjøretøy eller ciglitazon (15 mg /kg) på frekvensen av en injeksjon per uke i tre uker. Tumorvolumet ble målt to ganger per uke inntil ble musene avlivet. Svulsten Forekomsten var 100% i alle dyr. Volumet av svulstene i T24-celler podet mus økte ikke i ciglitazon-behandlede dyr i forhold til vehikkelbehandlede kontrolldyr. Det var en signifikant forskjell fra den tredje injeksjon av ciglitazon (
P
0,05) (figur 5A, venstre panel). I RT4 celler podet mus, syntes tumorvolumet for å utvikle mindre enn i kontrollmusene ved ciglitazon behandling, men dette var ikke statistisk signifikant (figur 5A, høyre panel). For å avgjøre om hemming av tumorutvikling av ciglitazon skyldes hemming av proliferasjon, apoptose, eller begge deler, evaluert vi Ki67 ekspresjon og caspase 3 aktivisering på tumor vevssnitt ved immunhistokjemisk analyse. Antallet Ki67-positive celler var lavere i T24 og RT4 celler-xenopodet tumorsnitt fra ciglitazon-behandlede dyr sammenlignet med tumorsnitt fra ubehandlede dyr. Tvert i mot var det ingen påvisbar aktivert kaspase 3 i RT4 celler-xenopodet tumorseksjoner og en sterk aktivert caspase 3 farging i T24-celler-xenopodet tumorsnitt fra ciglitazon behandlede dyr sammenlignet med tumorsnitt fra ubehandlede dyr (figur 5B). Disse resultatene indikerer, for første gang, så vidt vi vet, at den betydelige reduksjon av tumorvolumet observert i ciglitazon-behandlede mus (xenopodet med T24 blærekreftceller) krever inhibering av proliferasjon, så vel som induksjon av apoptose.
Mus ble inokulert subkutant med eksponentielt voksende T24 og RT4 blærekreftceller (5 × 10
6 celler). Når tumorstørrelsen nådde 40 mm
3 i volum, ble musene tilfeldig delt inn i kontroll- og behandlede grupper (n = 10). Intraperitoneale injeksjoner av ciglitazon ble ukentlig administrert ved en dose på 15 mg /kg i løpet av tre uker. Kontrolldyr fikk bare saltløsning kjøretøyet etter en identisk plan. (A) Den veksttumorkurver ble bestemt ved å måle tumorvolumet. *
P
0,05, signifikant forskjell sammenlignet med ubehandlede dyr med bruk av to-veis ANOVA test (evaluering av tumorvolumet utviklingen over tid); **
P
0,05, signifikante forskjeller mellom kontroll og behandlede mus ved hver post-pode tid med bruk av to-tailed uparede Student
t
test. (B) Immunhistokjemisk farging av representative parafininnstøpte deler av svulster fra ubehandlede eller ciglitazon-behandlede mus. Snittene ble fiksert og farget for Ki-67 og aktiv caspase 3. Hvert panel er representativ for 5 seksjoner for hver av ti svulster fra kontroll og ciglitazon-behandlede mus. Original forstørrelse, × 20.
ciglitazon og TRAIL kombinert behandling induserer synergistisk apoptose ved døden reseptor signalveien, caspaseaktivering og Bud cleavage
T24 celler er kjent for å være svært motstandsdyktig mot TRAIL etter eksponering for økende konsentrasjoner av eksogent oppløselig rekombinant humant TRAIL i området fra 10 til 200 ng /ml [25]. Ifølge våre resultater viser at ciglitazon opp-regulerer TRAIL uttrykk, postulerte vi at ciglitazon dreper T24 celler ved å gjenopprette deres følsomhet for TRAIL-indusert apoptose. For å validere denne hypotesen ble cellene behandlet med bil eller 40 mikrometer ciglitazon i 24 timer eller 50 ng /ml rekombinant TRAIL for de siste 12 timer alene eller i kombinasjon. Som tidligere rapportert, viste vi også at T24 celler var refraktære til TRAIL-indusert apoptose. Mer interessant, var det en betydelig økning av celledød i ciglitazon og TRAIL-cotreated celler i forhold til ciglitazon alene-behandlede celler (figur 6A, øverst). Den TRAIL-allergifremkallende virkning av ciglitazon resulterte i pro-caspase 8 og 3 behandling og PARP proteolyse men innebar også mitokondriene forsterkning løkke som indikert av caspase 9 og Bud cleavage (figur 6A, nederst). I nærvær av caspase 8 (Z-IETD-FMK) eller caspase 9 (Z-LEHD-FMK) spesifikke inhibitorer, vi har observert en hemming av enten kaspase 8 eller caspase 9 prosessering og fravær av Bid spalting også, i ciglitazon og TRAIL cotreated celler (figur 6B, nederst). Dette var forbundet med en reduksjon av celledød i nærvær av kaspaseinhibitorer som vist ved en signifikant reduksjon av DNA-fragmentering (figur 6B, øverst). For å bekrefte involvering av død reseptor aktivering, ble DR4 og DR5 stimulering hemmet av pre-inkubasjon av cellene med å blokkere anti-DR4 eller anti-DR5 antistoffer før behandling (figur 6C). Inaktivere hver av reseptorer på TRAIL og ciglitazon cotreatment effektivt blokkert celledød bekrefter at apoptose ble formidlet gjennom spesifikke interaksjoner mellom TRAIL og dets reseptorer.
T24 celler ble behandlet eller ikke med 40 mikrometer ciglitazon i 24 timer eller humant rekombinant TRAIL (50 ng /ml) i 12 timer eller cotreated med ciglitazon og TRAIL (lagt her for siste 12 timer). (A,
toppen
) Prosentandelen av celler som viser hypodiploid DNA innhold (sub-G1 peak) ble evaluert ved flowcytometri analyse. Dataene er midler ± SD av 3 uavhengige eksperimenter utført i tre paralleller. *
P
0,05, signifikante forskjeller sammenlignet med ubehandlede celler; **
P
0,05, signifikant forskjell sammenlignet med individuelle behandlings utsatt celler med bruk av to-tailed uparede Student
t
test; (A,
nederst
) Immunoblotting påvisning av caspases 8, 9 og 3, PARP og Bud. (B) Cellene ble preinkubert i 1 time med 50 uM kaspase 8 (Z-IETD-FMK) eller 9 (Z-LEHD-FMK) spesifikk inhibitor før indikerte behandling;
toppen
, prosentandelen av celler som viser hypodiploid DNA innhold ble evaluert ved flowcytometri analyse;
nederst
, caspases 8, 9, 3 og Bud spalting ble analysert ved western-blotting analyse. (C) Cellene ble preinkubert med eller uten monoklonale antistoffer som blokkerer DR4 og DR5 reseptorer i 1 time og stimulert som angitt. Prosentandelen av celler som viser hypodiploid DNA-innhold ble evaluert ved flow cytometri-analyse. (D) Immunoblotting påvisning av c-FLIP og survivin fra T24 helcellelysater. (E) Celler ble forbehandlet med 25 uM proteasominhibitor MG132 i 30 minutter og stimulert med 40 pM ciglitazon i 12 timer;
toppen
, prosentandelen av celler som viser hypodiploid DNA innhold ble evaluert ved flowcytometri analyse;
nederst
, immunoblotting påvisning av c-FLIP og Survivin. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll lasting. (B, C, E) Dataene er middelverdier ± SD fra 2 uavhengige eksperimenter utført in triplo. *
P
0,05, signifikante forskjeller sammenlignet med ubehandlede celler; **
P
. 0,05, signifikante forskjeller sammenlignet med ciglitazon og TRAIL cotreated celler med bruk av to-tailed uparede Student
t
test
ciglitazon nedregulerer c-FLIP og survivin gjennom en proteasome avhengig nedbrytning
Vi undersøkte effekten av ciglitazon og foreningen av ciglitazon med TRAIL på uttrykk for apoptose hemmere som survivin og c-FLIP kjent for å videre være involvert i reguleringen av både indre og ytre apoptotiske reaksjonsveier. Som presentert i figur 6D, ciglitazon, som individuell behandling eller i kombinasjon med TRAIL, redusert både c-FLIP
S og Survivin proteinnivåer i samme utstrekning og dramatisk ned-regulert c-FLIP
L. Tvert imot, gjorde TRAIL enkelt behandling ikke påvirke betydelig c-FLIP og survivin proteinnivåer. Disse funnene tyder på at nedregulering av c-FLIP og survivin sannsynlig bidrar til ciglitazon-utløst apoptose og til ciglitazon-mediert allergi til TRAIL-indusert apoptose.
ubiquitine-proteasome pathway spiller en sentral rolle i reguleringen av cellesykluskontroll og apoptose [26]. Flere anti-apoptotiske proteiner som c-FLIP og survivin representerer fremtredende mål for proteasome. For å avgjøre om ciglitazon-indusert nedregulering av slike apoptose negative regulatorer er mediert gjennom denne prosessen, undersøkte vi effekten av proteasominhibitor MG132. MG132 restaurert nivåene av Survivin og c-FLIP (figur 6E, nederst) som indikerer at nedregulering av begge apoptose-inhibitorer var proteasom-avhengig. Som vist i figur 6E (øverst) sub-G1 cellepopulasjonsnivå i cotreated-celler ble signifikant redusert i nærvær av MG132. Dermed ble utvinning av c-FLIP og survivin, som betydelig svekket ciglitazon og TRAIL kombinasjon-indusert apoptose, er nødvendig, men ikke tilstrekkelig til å overvinne cotreatment-forfremmet apoptose i T24 celler.
Diskusjoner
den foreliggende rapport viser at ciglitazon induserte hemming av cellevekst gjennom cellesyklus kurskontroll eller induksjon av apoptose i henhold til tumoren grad av blærekreft-avledet urotelialceller. Apoptotiske effekter forekom ved høye konsentrasjoner (40-60 pm) og uavhengig av PPARy-aktivering som allerede er rapportert i andre cellemodeller [27]. Flere potensielle PPARy-aktivering uavhengige mekanismer som kan indusere apoptose er blitt foreslått. De omfatter generering av reaktive oksygenforbindelser [28], induksjon av cellulær acidose [29], involvering av tidlig vekstrespons-en og NSAID-aktivert-gen 1 i tykktarm kreft [30].
For første gang i maligne urotelialceller presenterer vi bevis for at ciglitazon indusert G2 /M cellesyklus arrest og endringer i cellesyklus regulatorer.
