Abstract
taxan basert kjemoterapi er standard vare behandling i kastrering resistent prostatakreft (CRPC). Det er overbevisende bevis for at taxaner påvirker androgen reseptor (AR), men de eksakte mekanismene har å bli ytterligere belyst. Våre studier identifisert c-jun som en viktig nøkkelspiller som samhandler med AR og dermed avgjør utfallet av taxaner gitt. Docetaxel (Doc) og paclitaxel (Pac) agenter viste ulike effekter på LNCaP og LNb4 dokumentert av endring i protein og mRNA nivåer av c-jun, AR og PSA. Docetaxel-indusert fosforylering av c-jun skjedde før JNK fosforylering som antyder at c-jun fosforylering er uavhengig av JNK baner i prostatakreftceller. En xenograft studie viste at mus behandlet med Pac og bikalutamid viste verre utfall støtter vår hypotese om at oppregulering av c-Jun kan fungere som en potent antiapoptotic faktor. Vi observerte i våre in vitro studier en invers regulering av PSA- og AR-mRNA nivåer i Doc behandlet LNb4 celler. Dette ble også sett for kallikrein 2 (KLK 2) som fulgte det samme mønster. Gitt det faktum at responsen på taxaner er målt ved PSA nedgang vi må vurdere at dette ikke kan være den riktige aktiviteten til AR i CRPC pasienter
Citation. Tinzl M, Chen B, Chen SY, Semenas J , Abrahamsson PA, Dizeyi N (2013) Samspill mellom c-jun og androgen Receptor bestemmer utfallet av taxaner i Kastrering resistent prostatakreft. PLoS ONE 8 (11): e79573. doi: 10,1371 /journal.pone.0079573
Redaktør: Elad Katz, AMS bioteknologi, Storbritannia
mottatt: 12. april 2013, Godkjent: 25 september 2013; Publisert: 08.11.2013
Copyright: © 2013 Tinzl et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet er finansiert av Sandbergs private midler, Percy Falk Foundation og Malmö kreft finansiering. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
De behandlingstilbud for pasienter med kastrering resistent prostatakreft (CRPC) er fortsatt begrenset. Selv om nye lovende medikamenter som CYP17A1 inhibitor arbiraterone og MDV3100 har kommet inn på markedet, er taxan basert kjemoterapi fortsatt anses verden over den viktigste hjørnesteinen i behandling når androgen deprivasjon terapi (ADT) har sviktet [1-4]. I tillegg til de klassiske taxaner, docetaxel og Paclitaxel blir Cabazitaxel anvendt som kjemoterapeutiske midler ved behandling av CRPC pasienter, den sistnevnte for det meste for å behandle pasienter med Doc resistent sykdom [5].
taxaner arrest celler i G2-M fase ved hyperstabilization av mikrotubuli spørre cellene til celledød [6]. Utenom dette godt beskrevet effekt i kreftceller er det overbevisende bevis for at taxaner også griper inn i androgen reseptor (AR) i prostatakreftceller [7-11]. Vår gruppe har identifisert c-jun som en viktig aktør nøkkel i dette samspillet mellom AR og taxaner som påvirker utfallet av behandlingen i kastrering motstandsdyktig status av prostatakreftceller.
transkripsjonsfaktoren c-Jun er en proto- onkogen og tilhører AP-en familie som består av de jun, fos og ATF-2 underfamilier [12,13]. AP-1-proteiner homo- eller heterodimerize før binding til deres DNA målområdet. AP-1-proteiner er multifunksjonelle, og er involvert i regulering av spenning svarsignaler, cellevekst og apoptose [12]. Likevel er det data som sterkt antyder at c-Jun er en vekst promoter og proto-onkogen [14,15]. Shemshedini og medarbeidere viste at, i likhet med hva observert med andre AR coactivators, kan c-jun megle AR N-til-C samhandling for å forbedre DNA bindende [16,17]. Videre er fosforylert c-jun ofte overexpressed i kreft hos mennesker [18,19] og har vært knyttet til invasive egenskaper av prostata og brystkreft [18,20,21]. Imidlertid er rollen til c-jun aktivering og mulig interaksjon med AR i cellen skjebne etter eksponering for Doc er en del av et komplekst nettverk og gjenstår å bli belyst. Denne studien ble gjennomført for å undersøke konsekvensen av samspillet mellom c-jun og AR i taxan behandling av kastreringsresistent prostatakreft celler. For å optimalisere effekten av kjemoterapi med taxaner vi trenger for å identifisere et bestemt molekyl eller bane som kan gi respons eller motstand. I denne studien søkte vi å undersøke effekten av taxaner som monoterapi eller i kombinasjon med bikalutamid på AR og dens kofaktor c-jun
in vitro Hotell og
in vivo
.
Materialer og metoder
Cellelinjer og reagenser
Den menneskelige prostata kreft cellelinjer LNCaP og PC-3 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassass, VA ). LNb4 Cellene ble samlet i vårt laboratorium fra LNCaP-celler utsatt for bikalutamid (5 uM i serum redusert til 5%). Celler ble dyrket i RPMI (LNCaP) og Hams F12-(PC-3) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (Life Technologies, Paisley, UK). Cellene ble behandlet med docetaxel (Taxotere®, Sanofi Aventis) og paclitaxel (Paclitaxel®, Actavis, Hafnarfjordeur, Island) i konsentrasjonen angitt i hver figur. Dihydrotestosteron (DHT) ble kjøpt fra Steraloids Inc. (Newport, Rhode Island) og bikalutamid fra Astrazeneca (London, UK). Alle Western blot reagenser ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) med unntak av JNK inhibitor XIV SR 3306 (Calbiochem, Darmstadt, Tyskland).
Transfeksjon og små interfererende RNA (siRNA)
Transient transfections med c-jun, c-jun mutant (c-jun Ala63 /73) og AR plasmider (alle vennlig levert av Shao-Yong Chen, Harvard Medical School) i PC-3 prostata kreft celler ble utført ved hjelp av Fugene 6 (Roche Diagnostics , Mannheim, Tyskland) som anbefalt av produsenten. Den c-jun mutant (c-jun Ala63 /73), her omtalt som Juna, som brukes i forsøkene bærer en mutasjon på serinbindingsstedet 63/73 (Ala63 /73), som er den viktigste målet for fosforylering av stress stimuli. For siRNA eksperimenter, ble PC-3 og LNCaP celler transfektert i 48 timer med 100 nM siRNA c-jun eller ikke-måls siRNA (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Transfeksjon ble utført ved hjelp av X-tremeGENE siRNA transfeksjon reagens (Roche Diagnostics) i henhold til produsenter instruksjon.
Proliferation
Celleviabilitet ble definert av trypanblått eksklusjon (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). PC-3, ble LnCap og LNb4 celler sådd ut i 24-brønners plater i en tetthet på 25.000 celler per brønn. Etter 24 og 48 timers behandling med Doc eller DMSO (Sigma-Aldrich) i de konsentrasjoner angitte flytende og festede celler ble oppsamlet ved trypsinering. Like porsjoner av cellesuspensjoner og 0,4% trypanblått ble blandet, og antallet levedyktige, trypan blått-ekskluderende celler ble tellet ved hjelp av et hemacytometer. Prosenten av levedyktige celler ble uttrykt pr 100 av de totale celler (gjennomsnitt ± SD). transfekterte PC-3 celler ble ytterligere evaluert av MTS analysen. Etter 48 timers transfeksjon ble cellene eksponert for Doc eller forble ubehandlet i ytterligere 48 timer. Etter inkubering ved 37 ° C i 5% CO
2 i 4 timer, ble antallet levende celler målt ved anvendelse av et 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2 – (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium (MTS) analyse (Celltiter 96 Aqueous One-løsning celleproliferasjonsanalyse, Promega, Madison, WI, USA) ifølge forhandlerens instruksjoner. Absorbans ble målt ved 490 nm ved anvendelse av en flerbrønn plateavleser (modell 680, Bio-Rad, Richmond, CA, USA), med brønner inneholdende bare medium tjener som tomme kontroller.
Flowcytometri for cellesyklus og apoptose analyser
Cellesyklus fordeling ble analysert ved flowcytometri. I korthet transfekterte celler ble behandlet med Doc i 48 timer og ble fiksert og farget med propidiumjodid i 40 min. De levedyktige celler ble gated, og DNA-innhold på minst 10 000-merkede celler ble kvantifisert med en fluorescens-aktivert cellesorterer. Apoptose ble bestemt ved Annexin V, konjugert med fluorescein-isotiocyanat (FITC) og 7-AAD-farging (BD Pharmingen av BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Cellene ble behandlet med Doc i 48 og 72 timer og fargede celler ble utsatt for flowcytometrisk analyse på en FACSCalibur (BD Biovitenskap, San Jose, CA, USA) instrument. Data presentert er hentet fra to uavhengige forsøk i duplikater og ble analysert ved hjelp av FCS Express-programvaren (DeNovo Software, Los Angeles, CA, USA).
Western Blot analyse og Immunoutfelling
For Western blot-analyse totalt protein ble ekstrahert ved bruk av radioimmunopresipitasjonsanalyse assay (RIPA) buffer (50 mmol /liter Tris-HCl, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, 1 % NP40, 0,1% SDS, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF og 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid) supplert med protease inhibitor cocktail Complete mini (Roche, Mannheim, Tyskland). Total proteinkonsentrasjon ble målt ved anvendelse av BCA-proteinanalyse (Pierce, Rockford, IL). Proteinprøver (20-30 ug) ble lastet på 4-12% SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran Bio-Rad analyse (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) og utsatt for elektroforetisk analyse og blotting. Membranene ble probet over natten ved 4 ° C med følgende primære antistoffer: anti-AR (441 og N-20), anti-c-jun, anti-p-cjun (Ser 63/73), og anti-β-aktin alle kjøpt fra Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, CA), anti-PSA (Dako, Glostrup, Danmark), p-JNK fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Sekundære antistoffer (IRDye 680, IRdye 800) ble oppnådd fra Li-Cor Biotechnology (Nebraska, USA) og proteiner påvist ved infrarød Odyssey® bildebehandlingssystem.
For immunoutfellingsstudier celler ble behandlet som angitt, og høstet i lyseringsbuffer. Cellelysater ble homogenisert, proteininnhold målt og 500 ug av forbehandlet protein ble inkubert med anti-AR-antistoff ved 4 ° C over natten med kontinuerlig omrøring. Like mengder av muse-IgG ble anvendt som negativ kontroll. Protein G-kuler (Pierce, Rockford, IL, USA) ble deretter tilsatt til hver prøve og inkubert ved 4 ° C i 2 timer. Prøvene ble deretter sentrifugert ved 2000 x g 2 min og Laemmli prøvebuffer (30 ul) uten β-merkaptoetanol tilsatt og blandingen ble inkubert ved 65 ° C i 15 minutter for å eluere bundne proteiner. Eluatfraksjoner ble sentrifugert ved 2000 x g, 1 ul av β-merkaptoetanol ble tilsatt, og prøvene underkastet Western blotting som beskrevet ovenfor. Proteinekspresjon ble evaluert i forhold til p-aktin-ekspresjon ved Densitometrisk analyse.
Sanntids Kvantitativ PCR analyse
Total-RNA ble isolert fra LNCaP og LNb4 celler ved anvendelse av RNeasy Mini Kit (Qiagen, West Sussex, UK) ved å følge produsentens protokoll og behandlet med RNase-fri DNase (DNase i; Amersham Pharmacia Biotech, Sollentuna, Sverige) for å fjerne eventuelle forurensninger genomiske DNA. Hver cDNA ble syntetisert ved revers transkripsjon fra 1 pg av total RNA ved hjelp av StrataScript First-Strand Synthesis System og tilfeldige heksamerprimere (Stratagene, AH diagnostics, Stockholm, Sverige). Sanntids-PCR ble utført med SYBR grønn QPCR masterblanding (iScript fra BioRad) i en MX 3000p deteksjonssystem (Stratagene) med en initiering trinn ved 95 ° C i 10 minutter etterfulgt av 40 sykluser ved 95 ° C i 30 sekunder, 56 ° C i 1 minutt og 72 ° C i 1 minutt.
De følgende primere for hvert gen ble anvendt: PSA (F5′-AGGCCTTCCCTGTACACCAA-3 «og R5′-GTCTTGGCCTGGTCATTTCC-3′), AR (F 5»-GTACCTGTCAGCCCCTGAAC-3 «og R5» GGAGAGCTGCT TTCG- CTTAG-3 «), GAPDH (5» -CGA CA-3 «og 5′-AGG GGT CTA CAT GGCAACTG-3′, c-jun CCA CTT TGT CAA GCT) (F 5»-GCATGAGGAACCGCA- TCGCTGCCTCCAAGT-3 og R5 «GCGACCAAGTCCTTCCCACTCGTGCA- CACT-3 «), NKX3.1 (F 5′- GTACCTGTCGGCCCCTGAACG-3’og R5′-GCT- GTTA TACACGGAGACCAGG-3′), c-Myc (F 5′-GGCGGGCACTTTGCACTGGA-3’and R5»- TCGCGGGAGGCTGCTGGTTT-3 «), KLK2 (F 5′-AGATGAAGACTCC-AGCCAT-3′ og 5′-R GATACCTTGAAGCACACCA -3′), β-aktin (F 5′-CGTGG- GGCGCCCCAG -3′ og R 5′-TTGGCCTTGGGGTTCAGGGGG – 3»).
mRNA beløpet ble bestemt ved hjelp av sammenlignende C
T-metoden. Prøvene ble analysert i tre paralleller, og dataene sammenlignet med ekspresjon av mRNA i ikke-behandlet kontrollgruppe som ble satt som en referanseverdi.
Dyr og tumorinokulasjon
Fire til seks uker gamle NMRI mannlig Nude mus fra Taconic Europa (Lille Skensved, Danmark) ble brukt i forsøket. Den xenograft modell ble utført i henhold til protokollen er spesielt godkjent av etikkomiteen av Lund universitet (godkjenningsnummer M 239-10). Musene ble holdt i henhold til retningslinjer gitt av Malmö-Lund Etisk Komité. LNCaP celler (2×10
6 celler) ble injisert subkutant i begge flanker som resulterer i to svulster per mus. Etter svulster har utviklet kirurgisk kastrasjon ble utført. Dyrene ble inndelt i 6 grupper: mus ble behandlet med kjøretøy, Doc, Pac eller bikalutamid som monoterapi og Doc eller Pac kombinert med bikalutamid. Legemidlene ble administrert intraperitonealt (i.p.) (20 mg /kg) i 100 ul volum gang i uken i 5 uker med unntak av bikalutamid som ble administrert to ganger i uken. På tidspunktet betegnet uke 0, ble behandlingen igangsatt, og musene ble avlivet en uke etter siste behandling. Svulster ble høstet, fast i formalin og parafin innebygd for immunhistokjemisk analyse.
Immunohistochemistry
dissekert xenografttumorer ble fiksert i 4% paraformaldehyde og deretter innstøpt i parafin. Fire mikrometer tykke seksjoner ble deparaffinized, rehydrert og mikrobølgeovn behandlet i 10 min i høy pH målet henting løsning (Dako, Glostrup, Danmark) før de behandles i automatisk Techmate 500 immunhistokjemi farging maskin (Dako) ved hjelp av antistoffer mot AR, c-jun, p -cjun, og Ki-67 (Dako). DAB (3,3′-diaminobenzidin) ble anvendt som et kromogent substrat og Glassene ble motfarget med hematoksylin. Prøvene ble betraktet med et Olympus AX 70 mikroskop ved en forstørrelse på x 10. En vilkårlig semikvantitativ anledninger ble anvendt for å evaluere de fargesignaler og avsluttet i tre kategorier; negativ farging (0), svak men påvisbar farging av noen eller alle cellene (1), moderat farging (2) eller sterk farging (3). I det minste to deler per tumor ble bestemt og resultatet var representative for minst 70% av arealet av vev analysert.
Sub-cellulær fraksjone
Cellular fraksjonering ble utført i henhold til protokollen som fulgte med NE-PER kjernefysiske og cytoplasmatiske utvinning reagenser (Pierce, Rockford, IL). LNCaP-celler ble utsatt for Doc eller Pac for 6, 24 og 48 timer, eller forble ubehandlet. Fraksjoner ble kokt med SDS-prøvebuffer, underkastet SDS-PAGE, og overført til en nitrocellulosemembran og probet som antydet med primære antistoffer mot AR, β-aktin eller lamin A, alle fra Santa Cruz, etterfulgt av sekundære antistoffer (IRDye 680, IRdye 800) som ble oppnådd fra Li-Cor Biotechnology (Nebraska, USA). Proteiner ble påvist ved infrarød Odyssey® bildebehandlingssystem.
Statistical Analysis
Resultatene ble oppnådd fra minst tre eksperimenter utført og er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Statistisk signifikans ble bestemt med uparet t-test. Verdier av p 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
c-jun overekspresjon indusert motstand mot Doc behandling
Funksjonen til c-jun som en transkripsjonsfaktor knyttet til spredning er rapportert hos prostatakreft før [22 ]. For å undersøke effekten av c-Jun på Doc behandlet prostatakreftceller, ble eksperimenter utført i LNCaP, LNb4 og PC-3 celler. Vi har observert at LNCaP-celler ble behandlet med Doc var mer resistente overfor behandling ved angitte tidspunkter i forhold til PC-3-celler (30% vs 9%, p = 0,003) (figur 1A). Selv om vi ikke påvise en statistisk signifikant forskjell mellom LNCaP og LNb4 vi kunne se en tendens til at langtidsbehandling med bikalutamid øker motstanden (figur 1A). Videre apoptose analyse ble utført ved hjelp av Annexin V /7AAD bekrefter mindre apoptose i celler eksponert for LNb4 Doc sammenlignet med foreldre LNCaP-celler
(A) Celleviabilitet undersøkt ved hjelp av trypanblått-utelukkelse i LNCaP (LN), LNb4 og PC- -3 celler. (B) Bestemmelse av apoptose ved strømningscytometri. Etter behandling av cellene med Doc, ble graden av apoptose bestemt ved annexin V /7AAD assay. (C) MTS assay i PC-3-celler transfektert som vist i figuren, og behandlet 48 timer med 5 nM Doc. (D) Grafer fra flowcytometri i celler som er nevnt i (C) demonstrerer sykling cellepopulasjon farget med propidiumjodid. Celler ble behandlet med Doc i 48 timer eller forble ubehandlet og sorteres i forskjellige stadier av mitose ved flowcytometri. (E) Western blot-analyse for å vise protein ekspresjon i transfekterte celler som er nevnt i (C). (F) Analyse av protein-protein interaksjonen bestemt ved immunoutfelling i nærvær eller fravær av Doc eller Pac i LN og LNb4 celler. Celler ble immunopresipitert med anti-AR (441) antistoff og membraner ble probet med anti-c-jun-antistoff. For kontroll ble 20 ug av cellelysatet brukes som input og lik belastning ble confimed med AR-antistoff.
(figur 1B). For å undersøke om c-Jun er involvert i respons til Doc terapi, ble PC-3 celler transfektert med c-jun, c-jun mutant (Juna) og co-transfektert med AR (AR /cjun, AR /Juna, henholdsvis) plasmider og MTS assay gjennomføres. PC-3-celler transfektert med juna viste en statistisk signifikant økning (p = 0,01, juna vs kontroll) i celleproliferasjon (figur 1C), mens transfeksjon med AR redusert cellelevedyktighet sammenlign Doc behandlede kontrollceller. Selv om det ikke var noen statistisk signifikant forskjell mellom Doc behandlede kontrollceller og c-Jun transfekterte PC-3-celler var det en klar tendens til økt levedyktighet i sistnevnte. Interessant, hadde samtidig transfeksjon av AR i PC-3 celler overekspresjon av c-Jun eller Juna ikke oppheve denne effekten på spredning (figur 1C) tyder på en rolle c-jun som en potent antiapoptotic faktor. Cellesyklusanalyse ble deretter gjennomført og vises celle arrest i G2-M fasen i Doc behandlet PC-3 celler (figur 1D). Vi har observert at PC-3-celler transfektert med AR eller juna viste en lignende trend med en markert reduksjon i prosentandelen av celler i G2-M-fase (18,6% og 19,9%, respektivt), mens S-fasen ble øket (43 , 4% og 43,5%, henholdsvis), noe som tyder på at fosforylering av c-Jun spiller en avgjørende rolle i celle-respons til Doc (figur 1D).
Vi neste undersøkte protein uttrykk i de transfekterte PC-3 celler. Western blot-analyse viste en markert økning i AR-protein i celler ko-transfektert med AR /cjun sammenlignet med celler transfektert med AR alene eller AR /juna (figur 1E). Disse resultater antyder at interaksjonen mellom AR og c-Jun er avhengig tilgjengelig fosforylering området 63/73. For ytterligere å evaluere effekten av taxan agenter på endogen c-jun og AR immunoprecipitation ble utført i LNCaP og LNb4. Vi fant en interaksjon mellom AR og c-jun i begge celletyper, som ble forsterket av Doc og Pac behandling (figur 1F). Disse funnene bekrefter at det er en fysisk interaksjon mellom c-jun og AR som regulerer virkningen av taxaner i PC-celler.
Effekter av c-jun siRNA på Doc respons
For å undersøke om c-jun downregulation kan endre PC-celle respons på Doc vi transfektert PC-3 og LNCaP celler med siRNA eller nontargeted siRNA, som tjente som en kontroll (figur 2A). Celler ble utsatt for Doc i 24 eller 48 timer og underkastet analyse MTS. c-juni var signifikant nedregulert men ikke helt redusert i begge cellelinjer (figur 2A). LNCaP celler silenced med siRNA viste en klar nedgang i levedyktighet etter 24 timer til Doc eksponering i forhold til foreldre LNCaP celler (p = 0,002). I PC-3 celler gjorde vi ikke observere en betydelig endring i celle levedyktighet på samme tidspunkt. Etter 48 timer ble effekten av c-jun demping minsket og cellene utvunnet som vist i figur 2B.
(A) Western blot-analyse som viser transfeksjonseffektivitet av siRNA c-jun i både PC-3 og LNCaP-celler. (B) Celleproliferering i LNCaP (øvre panel) og PC-3 (nedre panel) celler transfektert med c-jun siRNA eller nontargeted (kontroll) vektor. Celler ble behandlet med Doc i 24 og 48 timer. LNCaP-celler havn c-jun siRNA viste en signifikant reduksjon i proliferasjon (p = 0,002) mens PC-3-celler ikke ble påvirket.
taxan-indusert p-cjun uttrykk er uavhengig av JNK banen i PC-celler
Det har blitt rapportert at Doc kjemoterapi induserer sin effekt gjennom selektiv aktivering JNK i kreftceller [23] . Når aktivert, fosforylerer JNK og aktiverer en rekke transkripsjonsfaktorer som c-juni For å løse dette spørsmålet vi analysert hvorvidt JNK signalveien har en rolle i Doc-indusert prostata kreft celledød. PC-3 og LNCaP-celler ble behandlet med 500 nM av JNK inhibitor i 2 eller 8 timer, mens Doc og Pac behandlede celler utføres i tidspunktene 2, 4, 8 og 24 timer. Som vist i figur 3A c-Jun-fosforylering ble indusert 2 timer etter eksponering for Doc i PC-3-celler, mens JNK fosforylering først 24 timer etter eksponering i PC-3 celler (figur 3A). I LNCaP-celler eksponert for Doc no markerte endringer i JNK-fosforylering ble observert på noe tidspunkt av behandling (figur 3B). Dette tyder på at JNK aktivisering kan være en sekundær effekt av Doc behandling og c-jun fosforylering er en primære målet av Doc. Spesielt i AR uttrykke LNCaP celler, kan en direkte interaksjon med AR som forårsaker rask induksjon av c-jun fosforylering ikke utelukkes. Videre ble lignende resultater oppnådd i de tidligere nevnte celler eksponert for Pac (figur ikke vist). Det er verdt å nevne at en basalnivået av p-cjun hos ikke-behandlede celler ble uttrykt i begge cellelinjer.
Western blotting-analyse av (A) PC-3 og (B) LNCaP-celler utsatt for Doc ( 5 nM) i opptil 24 timer eller forble ubehandlet (0). PC-3 og LNCaP-celler ble sådd ut i 24-brønners plater i en tetthet på 50.000 celler per brønn og behandlet med Doc og Pac eller i kombinasjon med 500 nM av JNK inhibitor (SB) som angitt.
taxan agenter endre protein nivåer av AR og PSA
Videre forsøk ble utelukkende utført i LNCaP og LNb4 celler bare. Basert på vår over resultatet vi videre undersøkt hvordan taxaner påvirker uttrykket av AR regulerte gener som Ptil på proteinnivå. Vi observerte en samtidig økning av AR og PSA proteinnivåer i Doc behandlet LNCaP celler (p = 0,01, Doc 24 vs kontroll) (Figur 4A). Men i Pac behandlet LNCaP celler en gradvis reduksjon av AR protein ble sett samtidig med PSA-nivå etter 48 timer (Figur 4A). Interessant, økningen av AR protein nivå i LNb4 celler ble mer uttalt ved Doc behandling, mens PSA proteinnivå ble tydelig redusert etter 48 timer (p = 0,02, Doc 24 vs Doc 48). Eksponering av LNb4 celler til Pac førte til en markert nedgang i AR og PSA protein uttrykk (figur 4B). Uttrykk for p-cjun skilte seg i LNCaP og LNb4 (figur 4C, D). I LNCaP celler Doc behandling økt p-cjun uttrykk gradvis (p = 0,04, Doc 6 vs Doc 48), mens det i Pac behandlede cellene en økning på 24 timer ble sett, som ble etterfulgt av en markert nedgang på 48 timer (figur 4C) . Men i LNb4 celler Pac behandling resulterte i en tidsavhengig induksjon av p-cjun, mens Doc behandling klarte å gjøre det (figur 4D). Det ble ikke observert markerte endringer i c-jun nivåer i begge cellelinjer og under alle forhold undersøkt.
Western blotting analyse av uttrykk for AR og PSA i (A) LNCaP og (B) LNb4 celler. Celler utsatt til 5 nM av Doc, 5 nM av Pac eller 10 nM av DHT i opptil 48 timer eller forble ubehandlet. De samme lysater ble brukt til å analysere ekspresjonen av p-cjun og c-jun i (C) LNCaP og (D) LNb4 celler. Protein uttrykk nivåer ble evaluert av densitometrisk analyse (nedre paneler).
Effekt av taxan behandling på c-jun og AR mRNA uttrykk
For å undersøke RNA endringer som følge av taxan behandling, QRT-PCR ble utført i LNCaP og LNb4 celler. Celler ble behandlet som indikert i figur 5. Selv om vi har observert en første induksjon av AR- og PSA mRNA i Doc behandlede LNCaP-celler, gjorde dette ikke forekomme i Pac behandling. Interessant, LNb4 celler viste en kontinuerlig økning av AR mRNA uttrykk i en tidsavhengig måte når de ble behandlet med Doc, mens PSA mRNA ble negativt korrelert til AR mRNA uttrykk (figur 5A). Det var en statistisk signifikant forskjell i AR og PSA-mRNA-nivå ved 24 og 48 timers eksponering for Doc (p = 0,05 og p = 0,003, respektivt). Men i Pac behandlede LNb4 celler vi har observert en første induksjon av AR og PSA mRNA som ble redusert til et signifikant nivå etter 48 timer. I motsetning til dette øket c-jun mRNA-ekspresjon betydelig i Pac behandlede LNb4 celler (p = 0.03), noe som ikke kunne bli vist i Doc behandlede celler (Figur 5B). Som forventet KLK2 mRNA uttrykk viste et lignende mønster som PSA mRNA i alle celler behandlet. Ytterligere analyser på c-myc og NKX3.1 ble utført som vist i figur 5B. Resultatene viser ingen signifikant trend i c-myc mRNA-ekspresjon uavhengig av taxan som brukes og av behandlingstiden. Ikke desto mindre ble det observert en økt ekspresjon av NKX3.1 mRNA i alle Doc behandlede celler, mens dette var mindre uttalt i Pac behandlede celler (Figur 5B).
Ekspresjon av (A) AR og PSA og (B) c -jun, KLK2, NKX3.1 og c-myc mRNA nivåer i respons til Doc eller Pac ble evaluert av kvantitativ real time PCR (qPCR). Den relative midlere mRNA-ekspresjon nivået av AR-regulerte gener, ble målt ved hjelp av kvantitativ sanntids RT-PCR i triplikater.
For å oppsummere våre resultater viser en klar sammenheng mellom AR, c-jun og PSA i taxan behandlede celler. Resultatet av behandlingen er avhengig av status av AR-reseptoren og c-jun mRNA-ekspresjon og taksanet anvendes.
Animal modell
For å vurdere den terapeutiske responsen av prostatakreft cellelinje LNCaP in vivo vi etablert en dyremodell som vist i Figur 5. Mus ble behandlet med Doc eller Pac som monoterapi eller i kombinasjon med bikalutamid. En statisitically betydelig reduksjon i tumorstørrelse av mus behandlet med Doc alene ble vist (p = 0,04, Doc vs CTR) (Figur 6A). I mus behandlet med Pac en stabilisering, men ingen reduksjon i tumorvolum ble observert (figur 6A). Det var ingen signifikant forskjell observert mellom Doc behandlet mus og mus som fikk kombinert behandling med bikalutamid (figur 6C). Interessant, tumorer i mus behandlet med Pac og bikalutamid tumorer begynte å vokse etter en innledende stabilisering (figur 6C). Det var en statistisk signifikant tumorstørrelse reduksjon i Doc /bic sammenlignet med Pac /bic-behandlede mus (p = 0,003).
(A) Vekstkurve av mus behandlet med Doc eller Pac alene, Doc vs ctr (p = 0,04). (B) Tilsvarende immunhistokjemisk farging av tumorvevet. (C) Vekstkurve av mus med kombinasjonsbehandling, Doc /bikalutamid (Bic) vs Pac /Bic (p = 0,003). (D) som tilsvarer immunhistokjemisk farging av tumorvevet. Merk at p-cjun ble forskjellig uttrykt i mus behandlet med Doc og Pac. Ki67 ekspresjon var høyere i Pac forhold til Doc behandlet mus.
Vi neste undersøkt uttrykk for c-jun, p-cjun, AR og Ki67 proteiner i tumorvev høstes for å vurdere effekten av medikamentell behandling. Det var en betydelig endring i atom AR nivåer i dyr behandlet med Doc alene eller Doc /bic (figur 6B og 6D, henholdsvis). I begge behandlingsgruppene vist omtrent 60% av cellepopulasjonen en cytoplasmisk translokasjon av AR, sammenlignet med mus i kontrollgruppen (Figur 6B). I motsetning til mus behandlet med Pac eller kombinasjonsterapi det cytoplasmatiske translokasjon av AR var mindre uttalt. Imidlertid viste uttrykk for p-cjun i vev fra kontrolldyrene en intens farging, mens vi observert at atom p-cjun var mer tydelig i Pac behandlede mus sammenlignet med Doc behandlet dyr hvor også en cytoplasmisk uttrykk ble funnet (Figur 6b). Ingen betydelig endring i mønsteret av c-jun ekspresjon ble observert i kontroll og behandlede dyr. Ki67 ekspresjon var mer uttalt hos Pac behandlet mus som gjenspeiler dårlig respons av svulster på denne taxan in vivo.
For å bekrefte cytoplasma translokasjon av AR av taxaner in vitro, ble Western blotting eksperimenter utført i LNCaP celler ( Figur S1). Etter avtale med in vivo data viste vi at uavhengig av taxan brukt AR ble translocated til cytoplasma. Den trans var mer uttalt hos Doc behandlede celler (øvre panel) sammenlignet med Pac behandlede celler (nedre panel), spesielt etter 48 timers behandling.
Diskusjoner
I denne studien har vi belyst rollen til AR og dens coactivator c-jun i PC-celle respons på taxaner. Vi har vist at c-jun overekspresjon i PC-3-celler overfører en statistisk signifikant høyere motstand mot Doc behandling sammenlignet med celler ko-transfektert med AR /c-jun eller AR alene. LNCaP-celler var mer resistente mot Doc i nærvær eller fravær av bikalutamid i forhold til PC-3-celler. Transfeksjon med mutant Juna økt levedyktighet, noe som tyder på at c-jun og fosforylering nettstedet 63/73 er en viktig regulator av celle respons til taxaner i PC. Vi har vist for første gang at Doc og Pac behandling annerledes påvirker protein og mRNA nivåer av AR og PSA i foreldre LNCaP og LNb4 celler. Disse forskjellene ble reflektert i tumorvekst i musemodell. Resultatene presentert her tilveiebringe bevis for at effekten av taksan behandling er sterkt avhengig av c-jun og AR status av cellelinje som brukes, og på stoffet som brukes for behandling.
Det er kjent at AP-en transkripsjonsfaktor er multifunksjonelle, og noen ganger controversially diskutert i litteraturen [24]. c-Jun er vist å transdusere et mitogen respons, og for å fremme cellevekst som et enkelt gen eller i samarbeid med et aktivert ras-genet [25,26]. Derfor har vi funnet ut at c-jun overekspresjon (mutant Juna) gir resistens mot PC-3 celler til Doc terapi. Interessant nok Juna ble funnet å være mer potent til å hindre celledød sammenlignet med AR som tyder på at fosforylering området 63/73 er viktig for interaksjonen og stabilisering av AR og c-Jun-komplekser. Dette funnet er i tråd med tidligere rapporterte studier som indikerer at c-jun kan fungere som en antiapoptotic faktor heller enn proapoptotiske i sammenheng med eksponering for kjemoterapeutika [14,27].
