Abstract
Insulinresistens er en fellesnevner for flere sykdommer, inkludert type 2 diabetes og kreft, og undersøker de mekanismene som er ansvarlig for insulinsignalefall er av primær betydning. En matematisk modell av insulin signaleringsnett (ISN) er foreslått og brukt til å undersøke dose-respons kurver av komponentene i dette nettverket. Eksperimentelle data av C2C12 myoblasts med fosfatase og tensin homolog (PTEN) undertrykt og data for L6 myotubes med indusert insulinresistens har blitt analysert av modellen. Vi fokuserte spesielt på enkel og dobbel Akt fosforylering og pekte ut insulin signale endringer knyttet til insulinresistens. Videre er en ny karakterisering av den oppstrøms signalisering av pattedyr målet for rapamycin komplekset 2 (mTORC2) presentert. Som det er allment kjent at ISN proteiner har en viktig rolle også i celleproliferasjon og død ble ISN modellen bundet til en cellepopulasjonsmodell, og anvendt på data fra en cellelinje av akutt myeloid leukemi behandlet med en pattedyr mål av rapamycin-inhibitor med antitumoraktivitet. Analysen viste enkle forhold mellom konsentrasjonene av ISN proteiner og parametrene for cellepopulasjonsmodell som karakteriserer cellesyklusprogresjon og celledød
relasjon:. Bertuzzi A, Conte F, G Mingrone, Papa F, Salinari S , Sinisgalli C (2016) Insulin signale i insulinresistens States og kreft: En modellering analyse. PLoS ONE 11 (5): e0154415. doi: 10,1371 /journal.pone.0154415
Redaktør: Cong Cao, Suzhou universitet, KINA
mottatt: 14 desember 2015; Godkjent: 12 april 2016; Publisert: 05.05.2016
Copyright: © 2016 Bertuzzi et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Dataene er hentet fra litteraturen og de relaterte kilder er rapportert i papir
Finansiering:. FP ble støttet av SysBioNet, italienske veikart Research Infrastructures 2012. Federica Conte ble støttet av den Epigenomics Flagship Project (Progetto Bandiera Epigenomica), EPIGEN , finansiert av det italienske utdanningsdepartementet, universitet og forskning (MIUR), og National Research Council (CNR). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Insulinresistens resistens~~POS=HEADCOMP representerer en fellesnevner for en rekke sykdommer, inkludert fedme, type 2 diabetes (T2D), metabolsk syndrom og kreft. Det oppstår fra nedskrivning av insulin action, som induserer dermed hyper-utskillelsen av insulin. De viktigste trasé innenfor insulinsignaler nettverk (ISN) er godt etablert [1,2,3], med serin /treonin protein kinase Akt /PKB og to pattedyr target of rapamycin komplekser (mTORC1 og mTORC2) spiller en spesiell rolle. Akt er fosforylert på Thr308 av fosfoinositid-avhengig protein kinase-1 (PDK1) og på Ser473 ved mTORC2 [4], og den maksimale Akt-aktivitet oppnås når molekylet er fosforylert på begge rester, slik at translokasjon av den insulin-regulert glukosetransportører (GLUT4) i muskel og fettvev [5,6]. PDK1 og mTORC2 også svare til aktivering av insulin-lignende vekstfaktor 1 (IGF1) [3].
-kinase-kaskaden gjennom insulinreseptor (IR) opp til mTORC1, så vel som aktivering ved mTORC1 aminosyrer og energi, er tydelig vurderes [7]. I motsetning til den oppstrøms regulering av mTORC2 er ennå ikke godt karakterisert [8]. Den tuberøs sklerosekompleks 1/2 (TSC1 /TSC2) ser ut til å være nødvendig for mTORC2 aktivering [2,9]. Men dette vis ble utspurt i en studie som rapportert eksperimentelle tids kurs av flere proteiner av ISN henhold til aminosyrer og insulinstimulering [10]. Tolke dataene ved en dynamisk modell av nettet, ble det hevdet at mTORC2 aktivering reaksjonsvei kan stamme fra IR eller insulinreseptoren substrat-1 (IRS1), eventuelt via en variant av fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) [10] . Enda et annet syn fremkom fra eksperimenter i ikke-diabetiske mus både in vivo og in muskelbiopsi, og i L6-celler utsatt for et medium beriket med proteiner utskilt av tynntarmen hos diabetiske rotter og av serum insulinresistent mennesker [11]. Denne studien viste at jejunal faktor /s indusere insulinresistens og at disse faktorene aktivere mTORC2, som vist ved en lavere verdi av Ser473 Akt fosforylering, selv i fravær av insulin stimulering. Tilstedeværelsen av slike tarm faktorer er også foreslått av reduksjon av insulinresistens etter fedmekirurgi [12].
mTORC1 underlaget p70S6 kinase 1 (S6K1) er involvert i reguleringen av proteinsyntesen og veksten av cellen størrelse, og aktiv S6K1 hemmer IRS1 i en negativ tilbakekoplingssløyfe [3]. Videre er Akt substratet gaffelhodeboks protein O1 (FoxO1) som er involvert i regulering av proliferasjon og apoptose, slik at insulinsignaleringsnettverket har en vesentlig rolle ikke bare i fedme og diabetes, men også i kreft [3,13,14].
Etter forutgående papirene til Wanant og Quon [15] og av Sedaghat et al. [16], har flere studier undersøkt oppførselen til ISN indusert ved insulin stimulus ved å utvikle matematiske modeller og å analysere de eksperimentelle data. Noen studier fokusert på respons på en trinnvis økning av ekstracellulære insulinkonsentrasjonen [15,16,17,18,19,20]. Spesielt, den matematiske modellen er foreslått av Kiselyov et al. [17] utgjorde både høy og lav affinitet i de to monomerene til insulinreseptoren. Brännmark et al. [18] har studert mulige ordninger som forklarer den spesielle oppførsel observert i fosforylering av insulinreseptoren og insulinreseptoren substratet. Mer komplett dynamiske modeller, som støttes av analyse av tids løpet av proteinkonsentrasjoner etter insulin stimulering, ble utviklet og undersøkt [10,19,20]. Komplekse dynamiske modeller ble foreslått for å representere signaleringen gjennom den ErbB-reseptorer opp til PI3K og Akt, med sikte på å utforske respons på en anticancer medikamentet [21], og å modellere den insulin-indusert igangsetting av eukaryotisk oversettelse [22].
doseresponskurver, dvs. steady state-konsentrasjon på gitte insulinnivået, ble vurdert i andre studier. Giri et al. [23] og Wang [24] undersøkt oppførselen av doseresponskurver for deler av ISN versus den ekstracellulære insulinkonsentrasjonen, for å bestemme de forhold som produserer en hysterese i kurvene som et resultat av interaksjoner mellom negative og positive tilbakekoblingssløyfer til stede i systemet. Selv om den eksperimentelle tidsforløpet av proteinkonsentrasjonen ved konstant insulin stimulering viser at noen proteiner ikke kan oppnå en tydelig steady state inntil 2 timer [10], dose-responskurvene er i stor grad brukt i litteraturen for å vurdere oppførselen til ISN komponenter på ulike nivåer av insulin stimulering og å evaluere responsen på forstyrrende midler og narkotika.
Målet med denne studien er å undersøke hvilke faktorer som påvirker basalproteinkonsentrasjoner og dose-responskurver for ISN. Bruke Michaelis-Menten ordningen med kjemiske reaksjoner, har vi utviklet en matematisk modell av nettverket ved steady state, som fokuserer på enkle og doble Akt fosforylering og oppstrøms signalisering av mTORC2. Basert på litteraturdata av skjelettmuskellinjer, viser vi hvordan modellen kan representere effekten av genet demping. De faktorer som induserer insulinresistens er modellert i henhold til resultatene i [11]. Forbedret modellering av Akt og mTOR-komplekser er også brukt her for å simulere ISN responsen i forhold som TSC2 null og langtidsbehandling rapamycin. I lys av det nære forholdet mellom insulinresistens og kreft, hovedsakelig på grunn av Akt og mTOR signalering, kombinert vi insulinet aliserte modell med en cellepopulasjonsmodell for å undersøke effektene av mTOR-inhibitorer med antitumoraktivitet på ISN proteinene og på cellepopulasjon respons.
Resultater
ordningen med vår modell i figur 1 er basert på gjeldende visning av ISN struktur [2,3,14,25]. Siden Akt kan være uavhengig fosforylert ved Ser473 av mTORC2 og Thr308 av PDK1 [8], har vi inkludert alle veier som fører til full Akt aktivering. mTORC2 er antatt å bli aktivert ved den fosfatidylinositol-3,4,5 trisphosphate (PIP3), som foreslått i [3,26], og med en faktor J ikke er avhengig av PI3K, som muligens mediert gjennom vekstfaktor-reseptorer [11 ]. Aktiveringen av mTORC1 er representert her i en ganske enkel måte, å utelate TSC hemming av Akt og påfølgende mTORC1 aktivering via Ras homolog anriket i hjernen (rheb). Ordningen inneholder også den direkte Akt substrater glykogensyntase-kinase 3 (GSK3) og gaffelhodeboks protein O1 (FoxO1). Den aktiverte S6K1 phosphorylates IRS1 og Rictor i negative tilbakemeldinger looper [25]. En positiv feedback loop fra Akt til protein tyrosin fosfatase 1B (PTP1B) er også inkludert [16]. Mens aktiveringsveien til mTORC2 gjennom TSC2 (Huang, Dibble, Matsuzaki, Manning, 2008) ikke ble vurdert i lys av resultatene i [10], har den nåværende modellen ikke inkluderer for enkelhet noen etablerte stier i nettverket, for eksempel, IR intracellulære og reseptoren resirkulering, TSC2 aktiverings fremmes av FoxO1 [27] og den S6K1 aktivering ved GSK3 [28].
aktivering av insulin (i) av insulin reseptor (IR) katalyserer tyrosin fosforylering av IRS1. Fosforylert IRS1 binder P85 regulatoriske underenhet av PI3K, aktivere P110 katalytiske subenheten. PI3K formidler fosforylering av PI (4,5) -bisphosphate (PIP2) til PI (3,4,5) -trisphoshpate (PIP3) nær plasmamembranen (PM) og fosfatase og tensin homolog (PTEN) dephosphorylates PIP3 tilbake til PIP2. PIP3 rekrutterer Akt og PDK1 til PM, der PDK1 phosphorylates Akt på Thr308 (fosfatase PP2A). mTORC2 aktiveres ved PIP3 og med faktoren J, og katalyserer Akt fosforylering på Ser473 (fosfatase PHLPP). Maksimal Akt-aktivitet oppnås når molekylet er fosforylert på begge Thr308 og Ser473-rester, slik at translokasjon av GLUT4 glukosetransportører til PM. Gsk3 og FoxO1 er direkte Akt underlag. Akt aktiverer også mTORC1, som i sin tur aktiverer S6K1. Aktivert S6K1 phosphorylates IRS1 og Rictor i negative tilbakemeldinger looper. Den positive feedback loop fra Akt til PTP1B er også inkludert. Tilbakemelding sløyfer er representert med dristige linjer.
De kjemiske reaksjoner i vår ISN modellen er stort sett representert av den klassiske Michaelis-Menten-ordningen [29,30], og er omtalt i S1 File (Tekst S1) . Flere forutsetninger tillatt oss å forenkle modellen. Intracellulær lokalisering av proteiner (cytosoliske vs. membran-assosiert), så vel som den intracellulære handelen, ble neglisjert. Protein komplekser (f.eks mTORC1 og mTORC2) ble behandlet som enkle molekylære komponenter.
De kinetiske ligninger for konsentrasjonene av proteiner, som også inneholder vilkårene for syntese og nedbrytning av underlag og enzymer, er rapportert i S1 File (Tekst S2). Som vårt formål er analysen av dose-responskurver, vi deretter utledet konsentrasjonene av kjemikaliene i likevekt. Under avgjørende forutsetning av, som foreslått i [31], som nedbrytningshastighetskonstanten av et kompleks enzym-substrat er ubetydelig sammenlignet med summen av dissosiasjon og katalytiske konstanter, likevektsligninger ta en ganske enkel form. ISN modell ligninger i normalisert form som brukes for analyse av muskelcellelinjer C2C12 og L6 er gjengitt i avsnittet modeller, ligningene (1) – (16). S1 tabell gir uttrykk for parametrene i ligning (1) – (16) i form av kinetiske parametre av ligningene i S1 File (Tekst S2)
C2C12 myoblasts
Den eksperimentelle. data i [32] viser normaliserte fosforylering nivåer i C2C12 myoblast celler av IR (Tyr1146) Akt (Ser473) og (Thr308), GSK3p (Ser9), S6K1 (Thr389), og AS160 (Thr642) ved null insulin og insulin konsentrasjoner på 1, 10, og 100 nM, pluss de normaliserte konsentrasjoner av PIP3 og GLUT4
pm på null insulin og på en tilordnet insulin verdi. Forfatterne rapporterer data for kontroll og PTEN-undertrykte celler, hvor PTEN proteinkonsentrasjonen var redusert til 10% av kontrollen. Vi brukte disse data, bortsett fra de av PIP3 og AS160 som ble benyttet for prediksjon, for å estimere ISN modellparametere. Den positive feedback loop fra Akt til PTP1B ble ikke inkludert fordi IR fosforylering data var lik i kontroll og PTEN-silenced celler (fig 2 panel A). Som gjøres i [20], den normaliserte eksperimentelle data for pakt (Ser473) ble passer med summen, gitt ved ligningene (10) og (11) i seksjonen modeller, fordi det spesifikke monoklonale antistoff er egnet til å binde Akt fosforylert på Ser473 uavhengig av tilstedeværelsen av fosforylert Thr308. Tilsvarende ble data fra Pakt (Thr308) passer med.
Data (gjennomsnitt ± SEM) plottet fra Ref [32] for kontroll (svarte firkantene) og PTEN-trykt (røde firkanter) celler. Heltrukne linjer er dose-responskurver forutsagt av modellen for kontroll (svart) og PTEN-undertrykte-celler (røde). (A) Relativ PIR (Tyr1146). (B, C) Relativ Pakt (Ser473) og Pakt (Thr308). (D) Relativ pGSK3β (Ser9). (E) Relativ pS6K1 (Thr389). (F) Relativ GLUT4 på PM på null (hvit boks) og 100 nM (grå boks) insulin.
2 viser data fra C2C12 celler, plottet fra Ref [32] og brukes for estimering av parametrene av ligningene (1) – (16), med
PTEN
n
i ligning (6) satt til én for kontroll og 0,1 for PTEN-silenced data . Figur 2 viser også optimale tilpasnings kurver beregnet av modellen og S2 Tabell rapporterer parameterestimatene (med
I
e
, 0,5 og
S
0,5 gitt i stedet for
en
0 og
en
1).
I
e
, 0,5 ble funnet lik 44,68 nM. Som de eksperimentelle data er gjen normalisert til å ha en enhet verdi ved maksimal insulinkonsentrasjon i kontrollen, beregnet vi dose-responskurvene på fig 2 i henhold til denne begrensningen.
En undergruppe av modellprediksjoner vises i S1 fig. Panel A viser prediksjon, innhentet av den estimerte modellen av pAS160 (Thr642) sammen med data som ikke ble brukt i estimeringen prosedyren. Mens profilen til pAS160 (Thr642) data ble fulgt ganske nøyaktig, modellen ikke klarte å forutsi PIP3 konsentrasjonsdata i PTEN-forstummet celler (panel B). Vi merker oss at hvis mTORC2 ble aktivert av PI3K istedenfor PIP3, modellen kunne ikke tilstrekkelig plass Pakt (Ser473) data på null og lavt insulin i PTEN-forstummet celler, og heller prediksjon av PIP3 konsentrasjonsdata ville forbedre (S1 Fig, paneler C , D). Den totale pakt () ved 100 nM insulin i kontroll er 8,61% av total Akt (S1 Fig panel F) og GLUT4 ved plasmamembranen er 48,3% av total GLUT4. Disse verdiene er enig med modell resultatene som er angitt i [16], hvor pakt er omtrent 9% av den totale Akt og overflate GLUT4 oppnår 40% av total GLUT4 etter 15 min 100 nM insulin.
S2 Fig viser følsomheten konsentrasjoner protein ved en ± 10% forstyrrelse av de estimerte parametrene på ekstracellulære insulinkonsentrasjon på 44,68 nM. Som denne konsentrasjonen tilsvarer
I
e
, 0,5, følsomheten til
S
0,5 forsvinner. Det samme skjer for overfølsomhet for
en
12 (under 10
-5), mens og har små verdier (S2 Table). De største positive følsomhet er funnet for
en
9 og
en
10, der verdier ble satt lik (se S2 tabell) som ingen data om fosforylering av PDK1 og mTORC2 var tilgjengelig. Parametere som direkte påvirker nedstrøms proteiner, som mTORC1 og S6K1, også påvirke oppstrøms proteiner, som IRS1 og PI3K, på grunn av signalnettverk gjennom negativ feedback loop. Det motsatte oppførselen til
IRS
1
Y Hotell og
IRS
1
S
er også notert.
Som forventet, forbedrer PTEN delesjon insulin respons og basalnivået øket i nesten alle proteiner, i henhold til den negative følsomhet for
en
8 av alle proteiner nedstrøms PTEN, mens
IRS
1
Y Hotell og PI3K er positivt regulert (S2 fig). Spesielt fører PTEN protein undertrykkelse en økning i basal Ser473 Akt fosforylering, som kan fosforylere og deaktivere FoxO1 med mulig forbedring av aliserte til trasé som regulerer celleproliferasjon.
L6 myotubes
Som vist i figur 3, er dataene i [11] gir den normaliserte fosforylering nivåene i L6-celler av pakt (Ser473) og (Thr308) ved null insulin og insulinkonsentrasjoner på 0,1, 1, 10 og 100 nM. pGSK3β (Ser9) er rapportert ved null og 100 nM insulin. Videre ble pakt (Ser473) og pS6K1 (Thr389) ved null insulin målt i nærvær av inhibitorene rapamycin og PP242 som er rettet mot begge mTOR-kompleks [33]. De data som ble oppnådd i kontrollmediet, beriket av proteiner utskilt av jejunal slimhinnen hos ikke-diabetiske mus, og i medium beriket av proteiner utskilt av slimhinnene i diabetiske mus (betegnet i det følgende som kondisjonert medium eller db /db-medium). Basert på eksperimenter i ikke-diabetiske mus både in vivo og in muskelbiopsi, og i L6-celler eksponert for db /db-medium og av serum insulinresistente mennesker, har det vært antatt at jejunal faktor /s indusere insulinresistens [11] . Faktoren J som aktiverer mTORC2, se ligning (8), har blitt inkludert i modellen for å representere virkningen av denne antatte faktor.
Data (gjennomsnitt ± SD) plottet fra Ref [11] bortsett panel D fra Ref [34]. Data (firkanter) og modell montering (heltrukne linjer) plottet i svart for kontroll og i blått for celler eksponert for betinget (db /db) medium. (A, B) Relativ Pakt (Ser473) og Pakt (Thr308). (C) Relativ pGSK3β (Ser9) på null (hvit boks) og 100 nM (grå boks) insulin. (D) Relativ 2-DG-opptak i rotte L6 myoblaster. (E) Relativ pakt (Ser473) ved null insulin i kontroll (sort) og celler eksponert for db /db-medium (rød), i fravær av inhibitor og i celler behandlet med rapamycin (50 nM) og PP242 (500 nM). Den røde farge indikerer at eksperimentelle verdier ikke bevarer økningen i basal pakt (Ser473) fra kontroll til db /db-medium i fravær av inhibering, og stjernene påpeke at disse dataene ikke ble brukt i modellen montering. Grønne (ingen inhibitor), gul (rapamycin), og rosa bokser (PP242) representerer modell montering. (F) Relativ pS6K1 (Thr389) ved null insulin i fravær av inhibitor og i behandlede celler (feltene representerer modell tilpasning).
tilpasse de eksperimentelle data som forutsetter at J har neglisjerbar konsentrasjon i kontrollmediet og en større konsentrasjon, som skal estimeres, i db /db-medium. For å passe data innhentet i db /db medium, hypotese vi at insulinresistens øker også på grunn av en økt IRS1 nedbrytning på grunn av forbedring av mTORC2 signale [35]. Denne negative tilbakemeldinger var representert ved passende tuning parametrene av PI3K. Figur 3 viser de eksperimentelle data for L6-celler, plottet på nytt fra [11] og [34], sammen med den optimale tilpasningskurver, og S2 tabell rapporterer parameterestimatene. Vi ser at en høy verdi av pakt (Ser473) ved null insulin, som observert i figur 3 panel A kan kun oppnås dersom mTORC2 aktiveres også gjennom en signalveien uavhengig av PI3K, og hvis Thr308 Akt fosforylering ikke er nødvendig for Ser473 fosforylering.
fosforylering data målt i forsøkene med db /db medium er passe med en verdi på
J
betydelig større sammenlignet med kontrollgruppen (0,07 vs 0.001). Pakt (Ser473) på null insulin er i stor grad økt, men dens respons på insulin er avstumpet (fig 3A). Responsen av pakt (Thr 308) og av pGSK3β (Ser9) blir også trykket (panelene B og C). De 2-DG opptaksdata rapportert i figur 3D var tilstrekkelig plass av modellen. Den forutsagte 2-DG opptak i nærvær av db /db medium (panel D) ble beregnet ved å anta at hastighetskonstantene som regulerer GLUT4 translokasjon til plasmamembranen er mindre sammenlignet med kontroll [5,6], se Tabell S2.
data målt i nærvær av Rapamycin og PP242 er vist figur 3 paneler EF. Modellen tilstrekkelig passer inhibering av basal (ingen insulin) pS6K1 (Thr389) både i kontroll og db /db-medium (panel F). S6K1 inhibering fører i sin tur, på grunn av svekket negativ tilbakekopling, til en reduksjon i, og en økning i (S2 fig, panelene A-D), og dermed forsterke insulin signalisering. I basal pakt (Ser473) data (figur 3, panel E), blir dårlig prognose for celler eksponert for db /db medium forårsaket av eksperimentell variabilitet og dataene ble ikke anvendt for modell montering. I celler behandlet med Rapamycin, svekket negative tilbakemeldinger førte til en økning av
mTORC
2
n
, og dermed forsterke Pakt. I motsetning påvirker PP242 Akt fosforylering på Ser473, så
Akt
S Hotell og
Akt
T
,
S
er sterkt redusert. En undergruppe av modellprediksjoner blir vist i figur S3, hvor panel F gir en 3D-representasjon av komponentene i pakt. Ved 100 nM insulin, er total Pakt 78,7% av total Akt i kontroll. Samlet sett ser det ut til at den nåværende modellen gir en tilstrekkelig tilpasning av L6 data.
S4 Fig viser følsomheten til proteinkonsentrasjonen til de estimerte modellparametre på ekstracellulære insulinkonsentrasjon på 9,69 nM (estimert
I
e
, 0,5). Det generelle mønster av følsomheten for L6-celler i kontroll og db /db medium er lik den som finnes for C2C12-celler, noe som bekrefter at modellen er i stand til å representere begge typer data. I tillegg overfølsomhet for og er små i henhold til de små verdier av anslag, mens, som forventet, følsomheten til faktor J økningen i celler eksponert for db /db-medium sammenlignet med kontroll. Følsomheten til
en
12 er liten i begge C2C12 og L6 celler, noe som tyder på at den negative feedback loop fra S6K1 til mTORC2 har en ubetydelig rolle i disse linjene.
L6 celle data ble også analysert i nærvær av den positive feedback, med konstant
en
P
i ligning (4) satt til en mindre verdi for cellene i db /db medium sammenlignet med kontrollen. Resultatene er imidlertid ikke ut til å forbedre seg på de som oppnås med den nåværende modellen.
Simuleringer med forbedrede modeller av Akt og mTOR komplekser
Tre mulige utvidelser av modeller av Akt og mTOR komplekser er her vurderes. sub-cellulære Akt lokalisering, mTORC1 aktivering, og mTORC2 respons på rapamycin
smugling av molekyler i cellen reguleres ved diffusjon og aktiv transport, prosesser som krever en komplisert matematisk behandling basert på delvis differensialligninger [36,37]. For å gi en forenklet modell av sub-cellulære lokalisering av Akt, har vi bare betraktet Akt fosforyleringen ved Thr308. Derfor har vi Akt molekyler i cytosol rommet (Akt
cyt og Pakt
cyt), de som ligger på PM (Akt
pm og Pakt
pm), og de som er i kjernen (Pakt
NUC). Fig 4 panel A viser en ordning av modellen.
(A) PIP3 rekrutterer PDK1 og Akt til plasmamembranen. På PM, er Akt fosforylert av PDK1 og defosforylert av PP2A. Transport av ennå ikke fosforylert Akt fra PM tilbake til cytosol er regulert av hastighetskonstanten
k
-13. Fosforylert Akt transporteres til cytosol (hastighetskonstant
k
mc
) hvor det er dephosphorylated av PP2A eller importeres inn i kjernen (
k
cn
). Eksport fra kjernen reguleres av
k
nc
. (B) Fosforylert Akt inaktiverer TSC2. Aktiv TSC2 fremmer rheb binding til BNP og TSC2 inaktive stimulerer konverteringen fra rheb /BNP til aktiv rheb /GTP, som i sin tur aktiverer mTORC1. mTORC1 er også hemmet av PRAS40. Boksen inkludert aktiv mTORC1 og prolinrikt Akt substrat av 40 kDa (PRAS40) står for reaksjon (3) i S1 File (Tekst S3). (C) PRAS knockdown (KD:
K
mTOR
tidoblet i forhold til kontroll og
φ
= 0,7, rosa bokser) og overekspresjon (OE:
K
mTOR
halvert i forhold til kontroll og
φ
= -5/6, gule bokser) og effekt på mTORC1 aktivering ved en nM insulin. (D) Normalisert konsentrasjoner rheb /GTP og T389 S6K1 på 1 nM insulin med PRAS knockdown (tidoblet
b
PRAS
nedgang, rosa bokser), PRAS overekspresjon (todelt
b
PRAS
økning, gule bokser), og med både PRAS (todelt
b
PRAS
økning) og rheb (femdoblet
b
rheb
økning) overekspresjon (oransje boksene). (E) Normaliserte proteinkonsentrasjoner i TSC2-null-celler på 1 nM insulin. (F) Response til kortsiktig og langsiktig rapamycin behandling av mTORC1 og mTORC2, og effekt på Akt fosforylering på 10 nM insulin. Kort- og langsiktige behandlinger:
K
mTOR
i ligning (14) fra S1 File (Tekst S3) satt til 0,1 av kontroll. Langsiktig behandlings: parametere og av Akt ligningene (9) – (11) satt til 0,1 av kontroll
Likningene av de Akt konsentrasjonene er gitt i S1 File (Tekst S3) og showet. at ved steady state, de tre konsentrasjoner av fosforylert Akt tendens til å være lik forutsatt at
k
nc
≅
k
cn Hotell og
k
mc
≅
K
15
PP
2
A
.
Akt
cyt
en tendens til å være lik
Akt
pm
forutsatt at lik
K
13
PDK
en og
k
-13 er mye mindre enn disse to mengdene også ved lave insulinnivåer. Videre
k
mc
må være mye større enn
K
14
PP
2
A
. Selv om vi har ingen data som sikrer at disse vilkårene er oppfylt, garanterer de at de fleste av Akt
cyt trygt når PM og er fosforylert, og at Pakt
pm vandrer hurtig fra PM til cytosol hvor den har til å fosforylere flere underlag . Under disse forholdene, Akt modell anses i S1 Fil (Text S1, Tekst S2), og ligningene (9) – (11), hvor sub-cellulær lokalisering ble sett bort fra, kan betraktes som et tilfredsstillende modell av Akt kinetikken i den stabile tilstand . Vi bemerker imidlertid at den transiente responsen av Akt konsentrasjoner til en plutselig endring i insulinkonsentrasjonen er sannsynlig å være forskjellig hvorvidt den sub-cellulær lokalisering er vurdert eller ikke.
Fig 4 panel B viser sammenhengen forbedret modell av mTORC1 aktivering. Ligningene (12) – (15) i S1 File (Tekst S3) gir normaliserte konsentrasjoner av de molekylære komponenter og litteraturdata gi informasjon om protein respons på Akt. TSC2 fosforylering nivå på T1462 har en mer enn 10 ganger økning i HEK-293 celler ved serum stimulering [38]. Økningen i PRAS40 fosforylering nivå ved T246 kan ligge i området fra omtrent 10 ganger til 20 ganger i isolert skjelettmuskel med mindre verdier i hjerte, lever og fettvev [39]. Disse data gitt begrensninger i estimering av parametrene i ligningene (12) – (15) og unikhet av estimatene ble garantert ved å sette
φ
= -0,67 (
b
PRAS
= 3
b
mTORC
1, dvs. frekvensen av PRAS syntese er tre ganger så stor som den heterotrimer mTOR, raptor, mLST8) og. For å estimere de resterende parametrene, tok vi profilene på og av
mTORC
1
n
som en funksjon av
I
e
erholdt fra modellen av L6-celler. Profilen til ble brukt som inngangsfunksjon (12) og (15) fra S1 File (Tekst S3), og parameterverdier som optimalt reproduserte
mTORC
1
n
profilen var som følger:
K
TSC
= 65,95,
K
rheb
= 6,48,
K
mTORC
1 = 7,2 · 10
-3,
K
PRAS
= 16,72.
I simuleringene er presentert i figur 4, paneler CF, vi brukte komp ISN modell av ligningene (1) – (16) med ligning (14) på
mTORC
1
n
erstattet av ligningene (12) – (15) fra S1 File (Tekst S3). Tapet av PRAS40 uttrykk var representert i modellen av en tidoblet nedgang på
b
PRAS
sammenlignet med kontrollgruppen, med påfølgende endringer i
K
mTOR
, og
φ
i (14) – (15) fra S1 File (Tekst S3). Fig 4C viser nedgang på
PRAS
40
n
og økningen av
mTORC
1
n
i denne tilstanden, sammenlignet med kontrollen. I motsetning PRAS40 overekspresjon med en dobling i
b
PRAS
hemmer mTORC1 aktivering. I figur 4D, de normaliserte konsentrasjoner av T389 S6K1 henhold PRAS knockdown og overekspresjon (rosa og gule bokser, henholdsvis) følger responsen
mTORC
1
n
vist i panel C. Under både PRAS og rheb overekspresjon (oransje boksene), mTORC1 og S6K1 er ikke lenger hemmet i forhold til kontroll fordi GTP-lastet rheb seirer over PRAS40-mediert mTORC1 hemming, som påpekt i [38] og spådd av likning (14) i S1 File (Tekst S3). Resultatene fra simuleringene i panel D synes å være enig, kvalitativt i det minste med den økte T389 S6K1 fosforylering vist ved blottene i figur 4E (HEK293E celler) og figur 5E (MEFs og HT-29 colon cancerceller) av [40] .
(A) reaksjonsskjema av modell brukt for analyse av AML-celle befolkningsdata i fravær og nærvær av AZD8055. Blokkene representerer G0 /G1, S og G2M celler, med × 2 blokk betegner binær celledeling.
λ
1 er hastighetskonstanten av G1S overgang,
T
2 og
T
3 transitt ganger i S og G2M faser og
μ
«frekvensen konstant celle tap. D
1-D
3 representerer celler tapt fra levedyktige avdelinger, men fortsatt målbar og de apoptotiske legemer og fragmenter, med
μ
» frekvensen konstant celle fragmentering. (B) Data plottes på nytt fra referanse [44], av cellefraksjoner i cellesyklusfaser i kontroll og celler behandlet med 10, 100 og 1000 nM AZD8055 (lukkede firkanter), og modellen beslaget (heltrukne linjer). Panelet viser også data og montering av LI normalisert til å kontrollere, og av totalt brøkdel av døde celler og fragmenter. (C) Sammenheng mellom dataene for akridinorange farging i A549-celler, plottet på nytt fra referanse [43], og fraksjon av døde celler. (D) Forholdet mellom nedgang på Pakt (Ser473) (firkanter) og at
λ
1 ved økende medikamentkonsentrasjoner. Montering linjen
y
= 1,03
x
/(0.18·10
-2+
x
), med
y
= Pakt (Ser473 ) og
x
=
λ
1. En lignende funksjon passer forholdet mellom GSK3p (Ser9) (trekanter) og
λ
1.
