Abstract
Vi brukte genuttrykk profilering for å identifisere inflammatoriske cytokiner som korrelerer med blærekreft utvikling. Genuttrykk profiler av vevsprøver ble undersøkt ved hjelp av cDNA mikromatriser som inneholdt 103 ikke-muskel invasiv blærekreft (NMIBC), 62 muskel invasiv blærekreft (MIBC), 58 prøver av histologisk normale utseende omkringliggende vev, og 10 normale, friske personer som fungerte som kontroll-kohorten for sammenligning. Vi gruppert data-sett i henhold til biologiske karakteristikker og fokusert på immunresponsgener med minst 2-ganger forskjell ekspresjon i MIBC lignet med kontroller. Den eksperimentelle data-set identifisert 36 immunrelaterte gener som ble betydelig endret i MIBC prøver. I tillegg 10 gener ble oppregulert og 26 genene ble nedregulert i MIBC prøvene sammenlignet med normale vev. Blant de 10 oppregulert molekyler undersøkt, kapasiteten for både sårhelende migrering og invasjon ble forbedret i respons til IL-5, IL-20 og IL-28A i blærecancercellelinjer (253J og EJ celler) sammenlignet med ubehandlede celler. Uttrykket nivåer av IL-5, IL-20 og IL-28A ble øket hos pasienter med MIBC. Alle 3 cytokiner og deres reseptorer ble produsert i blærecancercellelinjer, som bestemt ved sanntids-PCR, immunoblotanalyse og konfokal immunfluorescens. Oppregulering av MMP-2 og MMP-9 ble funnet etter IL-5, IL-20 og IL-28A stimulering i begge celletyper. Videre er en EMSA analyse viste at behandling med IL-5, IL-20 og IL-28A indusert aktivering av transkripsjonsfaktorer NF-kB og AP-1 som regulerer MMP-9-promoteren. Til slutt aktivering av MAPK og Jak-Stat signalering ble observert etter tilsetningen av IL-5, IL-20 og IL-28A til blærekreftceller. Denne studien indikerer tilstedeværelse av spesifikke inflammatorisk cytokin (IL-5, IL-20 og IL-28A) -mediert krets i blærekreft utvikling. Alle 3 cytokiner kan være viktige nye molekylære mål for modulering av migrasjon og invasjon i blærekreft
Citation. Lee S-J, Lee E-J, Kim S-K, Jeong P, Cho Y-H, Yun SJ, et al. (2012) Identifisering av proinflammatoriske cytokiner Associated med blærekreft; Rollene til IL-5, IL-20 og IL-28A. PLoS ONE 7 (9): e40267. doi: 10,1371 /journal.pone.0040267
Redaktør: Nikolaos Frangogiannis, Albert Einstein College of Medicine, USA
mottatt: 26 januar 2012; Godkjent: 04.06.2012; Publisert: 04.09.2012
Copyright: © 2012 Lee et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF), finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (2010-0001736) og Korea Healthcare Technology R D Project, Ministry of Health Velferd, Republikken Korea (A100651-1011-0000200). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blærekreft er en av de mest utbredte kreftformen hos økonomisk avanserte land, og nesten alle ondartet blærekreft er overgangsordning celle carcinoma (TCC), som oppstår fra overgangs epitel [1], [2]. To typer TCC har blitt histopathologically klassifisert: ikke-muskel invasiv blærekreft (NMIBC) og muskel invasiv blærekreft (MIBC) [3], [4]. Ved initiale reaksjonen, blir 70-80% av pasientene diagnostisert med NMIBC som er begrenset til slimhinnen. Resten av tilfellene viser MIBC med invasjon av de muskulære lag av blæren. Pasientene med NMIBC kan behandles med hell, mens de fleste dødsfallene forekomme hos pasienter med hendelse MIBC [4]. Derfor har mye arbeid vært fokusert på å forstå mekanismene for MIBC utvikling for mulige terapeutiske anvendelser.
Det er nå allment akseptert at intravesikal immunterapi med Bacillus Calmette Guerin (BCG) er den mest effektive adjuvans middel for behandling av NMIBC [5] – [7]. Imidlertid gjenstår det mest nyttige terapeutisk metode for behandling av pasienter med MIBC å bli identifisert. Derfor har mange studier blitt gjort for å få mer innsikt i mekanismene for MIBC utvikling, noe som kan føre til oppdagelsen av potensiell terapeutisk behandling. Den biokjemiske og biologiske studier i forbindelse med aggressive TCC har blitt analysert for å bestemme prognostiske indikatorer, eller for å utvikle midler for diagnostisk og terapeutisk anvendelse. Flere konkrete molekylære markører har blitt identifisert av genuttrykk profiler i blærekreft, inkludert cellesyklus regulatorer, celleproliferasjon, apoptose og angiogenese faktorer [8]. Betennelse er involvert i utvikling av en rekke sykdommer, så som aterosklerose, diabetes, og tumorer, og er ledsaget av utseende av en rekke inflammatoriske biomarkører [9] – [11]. Imidlertid er den inflammatoriske-fenotype forening som regulerer blærekreft utvikling og metastase fortsatt dårlig forstått.
En enorm mengde data har vist at interleukiner utøve en rekke funksjoner ved å regulere cellevekst, celleoverlevelse, differensiering og apoptose i flere sykdommer [11]. Interleukiner kan også oppvise forskjellige virkninger på reguleringen av immunresponser og patogenesen av blærekreft [4] – [7]. Behandling med interleukin-6 (IL-6) er forbundet med anti-tumoreffekt via induksjon av apoptose i mus blærekarsinom [12]. IL-15-genet levering viste anti-tumor effekt i en mus ortotopisk blærekreft modell [13]. I motsetning til dette har IL-6 behandling funnet å bidra til cellevekst i humane blærecancerceller
in vitro product: [14]. Videre er ekspresjon av IL-8 og IL-17 vært implisert i tumorvekst og metastase i human blærekreft, [15], [16]. Selv om mange studier har analysert effekten av interleukinene på veksten av blærekreft [12] -. [16], og den nøyaktige rolle og molekylær mekanisme i prosessen for migrering og invasjon av TCC forbundet med klinisk studie ikke blitt klarlagt
i denne studien har vi benyttet en microarray basert tilnærming for å identifisere klinisk og biologisk informative uttrykk mønstre som skiller mellom pasienter med NMIBC og MIBC og kontrollprøver. Våre resultater fokusert på forskjeller mellom MIBC og kontrollprøver i uttrykket mønstre av gener som spiller en betydelig rolle i de viktigste cellulære prosesser involvert i betennelsesreaksjoner. Gener med minst to ganger differensial uttrykk i MIBC vs kontroller ble identifisert, og de nye funksjonene og signalveier i en inflammatorisk basert serie blære TCC ble belyst.
Resultater
Differensial genuttrykksmønster blant pasienter grupper
Vi har karakterisert genuttrykksmønster av 233 pasienter med blærekreft «prøver; 103 NMIBCs, 62 MIBCs og 68 normal slimhinne eller slimhinne rundt (ved siden av) kreft (Tabell 1). Vi først brukt hierarkisk clustering analyse av genuttrykk mønstre for å vurdere de molekylære egenskapene til de ulike pasientgruppene. Som forventet, hierarkisk clustering analyse av genekspresjon data fra alle vev ga 3 store grupper, en som representerer den normale blære mucosa, 1 representerer MIBC pasientgruppen, og 1 representerer NMIBC pasientgruppen (figur 1). Således er de genuttrykksmønster reflekterer den molekylære konfigurasjon var lett skjelnes mellom blæretumorer og ikke-tumorvev.
Gener med ekspresjonsvektorer for arbeidsplass som hadde et standard avvik på minst 0,7 ble valgt (4,145 gener) . De røde og grønne farger reflekterer høye og lave nivåer, henholdsvis.
siden forsøkt å identifisere genet sett som ble forskjellig uttrykt blant de 3 forskjellige grupper. Vi søkte Venn-diagram sammenligning av 2 genet lister å sammenligne genuttrykksmønster av NMIBCs og MIBCs. Først genererte vi 2 forskjellige gener lister ved å bruke en to-utvalgs t-test (figur 2A,
P
0,001). Gene liste A representerer gener som er differensielt uttrykte mellom normal slimhinne og NMIBC, og genet liste B representerer gener som er differensielt uttrykte mellom normal slimhinne og MIBC. Når man sammenligner de 2 genet listene, ble 3 forskjellige mønstre observert: S jeg ikke (1,452 gener), S og jeg (679 gener), og jeg ikke S (381 gener) (figur 2B). Gener i S ikke jeg kategori viste NMIBC-spesifikke uttrykk mønstre, mens gener i jeg ikke S kategorien vises MIBC spesifikke genuttrykk mønstre. Gener i S og jeg kategori utstilt både NMIBC og MIBC uttrykk mønstre, noe som betyr at 679 gener i S og jeg kategorien ble felles for både NMIBC og MIBC utvikling.
(A) Venn-diagram av gener valgt av en 2 sampler t-test. Den blå sirkelen (genet liste S) representerer gener differensielt uttrykt mellom normal slimhinne og NMIBCs. Den røde sirkelen (gen liste I) representerer gener differensielt uttrykt mellom normal slimhinne og MIBCs. En cut-off
P
-verdi på mindre enn 0.001 ble brukt til å velge gener med et uttrykk som var signifikant forskjellig mellom de to gruppene. (B) Expression mønstre av utvalgte gener i Venn-diagram. Dataene er presentert i matriseformat hvor p representerer enkeltgener, og kolonnene representerer hvert vev. De røde og grønne farger reflekterer høye og lave nivåer, henholdsvis.
Funksjonell Klassifisering av Gene Expression Signatur for MIBC Development
For å finne ut om våre genekspresjon signaturen ble beriket i kjente biologiske funksjoner, analyser bioinformatiske funksjonelle klassifisering av genene som ble forskjellig uttrykt mellom normal slimhinne og MIBC ble utført. Denne analysen viste en serie av MIBC utvikling forbundet med funksjonelle kategorier. Funksjonelle klassifiseringer av gense sett er illustrert i figur 3. Vi har funnet at gener som er involvert i cellesyklus, cancer, cellevekst og proliferasjon, celledød, og DNA-replikasjon og ordet -reparasjon var betydelig anriket. Vi fant også at gener involvert i smittemekanismer, immunologiske sykdommer og betennelsessykdom var også til stede i betydelig antall. Det er interessant at ble det observert et betydelig antall gener som er involvert i nyre og urologisk sykdom, mobilnettet, utvikling vev, og utviklingsforstyrrelser, som inspirerte tillit til våre resultater. Det har vært store fremskritt i blærekreft forskning på gener som bidrar til cellesyklus, celleutvikling, cellevekst eller celledeling, som var signifikante funksjoner på figur 3. For å kunne identifisere de genekspresjon nivåene i blæretumorer, vi ytterligere analysert microarray datasettene. Individuelle tumorprøver fra pasienter med blærekreft avslørte 664 gener som er differensielt uttrykt i alle de tumor vevsprøver, hvor differensial gener var enten opp- eller ned-reguleres (tabell S1, S2, S3, og S4).
Klassifisering berikelse ble bestemt ved hjelp av oppfinnsomhet Pathway Analysis (versjon 8.8). Betydningen av hver funksjon ble beregnet ved hjelp av Fishers eksakte test metode. Terskelen for statistisk signifikans var -log (
P
= 0,05).
I denne studien har vi analysert uttrykket profilen av gener involvert i cellulær proliferasjon, apoptose, celle sykluskontroll, angiogenese, sårheling, DNA-replikasjon og ordet -reparasjon, cytoskjelettet, og celle-adhesjon mellom normal slimhinne og MIBC (tabell S1 og S2). I MIBC, de mRNA uttrykk nivåer av mobiltelefonspredningsrelaterte gener VAX1, TTK, TPX2, tidløs, STIL, TBRG4, MCM7, KIF2C, HGS, DHCR7, CENPF, BRCA1, UHRF1, TRAIP, RECQL4, RACGAP1, NRAS, MKI67, KISS1R, KIF15, ING1, IMPDH1, FGF18, E2F1, DLG7, BUB1B, BUB1, BRCA2, og BLM var oppregulert sammenligne med normal slimhinne (tabell S1). Den neste klyngen var sammensatt av apoptose relaterte gener som var over-uttrykt (TOP2A, SCOTIN, MTP18, GSK3B, FANCG, BIRC5, AKT1S1, yars, TRIB3, TRAF2, SCARB1, RAD21, FAF1, ESPL1, E2F2, BCL2L12, ATF5, og AATF) i MIBC (tabell S1). Genene tilhørte en familie korrelert med cytoskjelettet og var betydelig over uttrykt i MIBC: TUBG1, SPTBN2, SPAG5, SCYL1, RCC2, RAE1, PRC1, PPP4C, NUSAP1, MYOHD1, LMNB2, KIFC1, KIF4A, KIF20A, KIF14, KIAA1688 , GTSE1, CCNB1, C9orf48, C18orf24, AZI1, AURKB, TUBA6, STMN1, klipp, SLC9A3R1, SAC3D1, ODF2, NEK2, LMNB1, KNTC1, KIF22, ITGB4BP, FAM33A, CCNB2, og ANLN (tabell S1). Vi har også oppdaget oppregulert uttrykk for celle vedheft-relaterte molekyler som TSTA3, TROAP, ADAM15, TINAG, PVR, PPFIA1, CELSR3, og ADRM1 i MIBC (tabell S1). Angiogenese relaterte molekylære gener inkludert TOP2A, POLD1, Pfs2, ORC1L, MCM7, NPR1, og FGF18 er oppregulert i MIBC (tabell S1). Imidlertid er oppregulert ekspresjon av angiogen faktor VEGF ble uventet observert i NMIBC (tabell S1). DNA replikasjon og reparasjon relaterte gener ble oppregulert i MIBC: TDP1, DNA2L, TYMS, TDG, POLQ, POLE2, POLD2, POLA2, ORC6L, MCM10, PRPF19, MGC32020, GTF2H4, EME1, RUVBL2, RAD51AP1, NUDT1, FANCB, og FANCA (tabell S1). Endelig presentere data viste over-uttrykte nivåer av cellesyklus regulerte gener som bidrar til tumorprogresjon og invasjon: UBE2C, TREX1, RCC1, PSMD8, PA2G4, LIN9, GSG2, E2F3, CDT1, CDK5RAP1, CCNF, ZWINT, PKMYT1 , CDC45L, CCNE2, CCNA2, SUV39H1, RAD54L, POLD1, HCAP-G, H2AFX, GPS1, FLJ22624, FANCD2, CHAF1A, CDCA3, ASPM, XRCC2, SPBC25, SMC4L1, SGOL1, SC65, PTTG1, POLE, PBK, MCM2, KNTC2 , KIAA1794, EXO1, CIT, CHAF1B, CEP55, CDCA8, CDCA5, CDCA2, CDCA1, C20ort172, ANAPC11, CDC2, CDC20, CDC25C, CDC7, CDC27, og CDC25A (tabell S1).
IL-5, IL-20 og IL-28A Stimulere Migrasjon og invasjon av blærekreft Cells
blærekreft er en immune- eller betennelse-relaterte sykdommer, og immunterapi som intravesikal instillasjon av Bacillus Calmette-Guérin (BCG) er Det viktigste behandlingsalternativ for NMIBC å forebygge sykdomsutvikling [5] – [7], [9]. Kumulative studier har indikert at endring i cytokinnivåer kan være en viktig hendelse i å bestemme sykdomsutviklingen av blærekreft [17] – [19]. For den neste analysen derfor valgt vi immunologiske eller inflammatoriske funksjoner fra våre funksjonelle klassifiseringsresultatene (figur 3). Fordi døden i blærekreftpasienter er sterkt knyttet til utviklingen av MIBC [4], analyserte vi genuttrykksmønster av representative immune- eller betennelse knyttet gener, sammenligner MIBC og kontrollprøver (tabell 2 og 3). Ti (10) av disse genene (IL-5, IL-26, IL-22RA1, IL-1RAPL1, IL-1F5, IL-17RB, IL-17RE, IL-20, IL-28A, og TRAF2) viste økt ekspresjon og 26 gener ble nedregulert i MIBC prøver, sammenlignet med kontrollprøver (tabell 2 og 3). Vi delte de 10 oppregulert gener i 3 typer: (1) cytokiner (IL-26, IL-5, IL-20 og IL-1F5) (2) cytokinreseptorer (IL-22RA1, IL-17RB, IL- 17RE, IL-1RAPL1, og IL-28AR1), og (3) cytokin-reseptor-adapter protein (TRAF-2). Først, for å undersøke evnen til å indusere migrasjon og invasjon, brukte vi cytokiner IL-26, IL-5, IL-20 og IL-1F5. For det andre har vi brukt cytokin IL-22, IL-17E, IL-17C, og IL-28A fordi disse cytokinene medierer celle responser gjennom sin interaksjon med sine reseptorer (IL-22 /IL-22RA1, IL-17E /IL-17RB, IL-17C /IL-17RE, IL-28A /IL28AR1) [20] – [23]. I tilfellet av IL-1RAPL1, brukte vi overekspresjon av IL-1RAPL1 cDNA-gen, fordi liganden av IL-1RAPL1 hadde ikke ennå blitt identifisert [24]. Til slutt, vi brukte også TRAF2 cDNA genet vi hadde klonet. Tidligere rapporter tydet på at MIBC utviklingen var sterkt assosiert med migrering og invasjon av kreftceller [4], [15]. For å avgjøre om oppregulert gener i MIBC indusere migrasjon og invasjon av blærekreft celler, utførte vi sårhelende analyser og invasjonsforsøk i blærekreft 253J og EJ celler ved hjelp av rekombinante proteiner eller cDNA gener. Blant de 10-molekyler undersøkt, IL-5, IL-20 og IL-28A betydelig forbedret både sårhelende migrering og invasjon av 253J-celler, sammenlignet med ubehandlede celler (figur 4A og 5A). Lignende resultater ble funnet i EJ celler (figur 4B og 5B). I tillegg ble celleformering ikke observert i noen av de 3 tilfeller av cytokin-behandlede blærekreftceller (figur S1 A og B). Men den andre 5 cytokiner og 2 gener hadde ingen effekt på migrasjon og invasjon av blærekreft celler (Figur S2, S3 og S4).
(A, B) konfluent blærecancerceller ble inkubert med serumfritt medium og behandlet med rekombinant protein IL-5, IL-20 og IL-28A i de angitte tidsrom. Breddene av skadelinjer som er gjort i celler ble deretter undersøkt ved 0 og 24 timer. Sårhelende migrasjon er representert ved de bredder på skade linjer.
(A, B) Cellene ble plassert i det øvre kammer, og de angitte konsentrasjoner av IL-5, IL-20, og IL-28A ble plassert i den lave brønn i kjemotakse kammeret. Invaderte celleantallet ble tellet etter de angitte tider. Resultatene er uttrykt som antall invaderte celler i forhold til en ubehandlet kontroll, som bestemt fra 3 uavhengige eksperimenter. **
P
. 0,01 sammenlignet med ingen behandling
IL-5, IL-20 og IL-28A Expression ble oppregulert i pasienter med MIBC
for å validere nivået av IL-5, IL-20 og IL-28A, vi Deretter ble mRNA nivåer av 62 MIBCs og 68 normale prøver ved real-time PCR. Resultatene viste at uttrykket nivåer av IL-5, IL-20 og IL-28A mRNA var vanligvis høyere i MIBC pasienter enn hos friske individer (figur 6), noe som tyder på at ekspresjon av IL-5, IL-20, og IL-28A er sterkt og signifikant assosiert med blærekreft.
Kvantitativ real-time PCR ble anvendt for å validere gen ekspresjon av IL-5, IL-20 og IL-28A i MIBC pasienter og friske enkeltpersoner. Kliniske prøver ble oppnådd fra 62 MIBC pasienter og 68 friske individer. MRNA ble isolert og brukt til å utføre sanntids-PCR for IL-5, IL-20 og IL-28A. Resultatene er representert som IL-5, IL-20 og IL-28A mRNA-ekspresjon i forhold til GAPDH-mRNA-ekspresjon. *
P
. 0,01 sammenlignet med friske individer
IL-5, IL-20, IL-28A, og deres reseptorer oppdaget av Real-time PCR, Immun og Confocal immunfluorescens Mikros i blærekreftceller
for å bestemme hvorvidt IL-5, IL-20 og IL-28A mRNA ble uttrykt i begge 253J og EJ celler, ble real-time PCR-analyse utført. Som vist i figur 7A og D, ekspresjon av IL-5, IL-20 og IL-28A mRNA ble endogent detektert i begge cellelinjer. Behandling av begge cellelinjer med 10% FBS i 24 timer viste en betydelig oppregulering av IL-5, IL-20 og IL-28A ekspresjon i mRNA-nivåer (figur 7A og D). I tillegg real-time PCR-analyse viste at ekspresjon av reseptorene på 3 cytokiner, IL-5Rα, IL-20R1, og IL-28AR1 i både 253J og EJ celler (figur 7B og E). IL-5, IL-20 og IL-28A proteiner ble observert ved immunoblot av proteinekstrakter fra begge cellelinjer (figur 7C og F). IL-5, IL-20 og IL-28A proteinekspresjon ble øket ved tilsetning av 10% FBS (figur 7C og F). Ved hjelp av immunfluorescens konfokal mikroskopi, vi neste undersøkte sub-cellulære lokalisering av IL-5, IL-20 og IL-28A protein i begge cellelinjer. Alle 3 cytokiner ble dispergert i cytoplasma og i peri-atomområder (figur 8A og B).
(A, B, D, og E) Celler ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av FBS i 24 timer , og mRNA-ekspresjonsnivåene av IL-5, IL-20, IL-28A (A, D) og deres reseptorer (B, E) ble kvantifisert ved sanntids-PCR. Resultatene ble uttrykt som IL-5, IL-20, IL-28A og deres reseptor-mRNA-ekspresjon er i forhold til GAPDH-mRNA-ekspresjon. *
P
0,01 sammenlignet med ingen behandling. (C, F) Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av FBS i 24 timer, og proteinnivåer av IL-5, IL-20 og IL-28A ble analysert ved immunblot. GAPDH ekspresjon ble anvendt som kontroll lasting.
(A, B) 253J og EJ celler, henholdsvis, ble farget med antistoffer mot QD565-konjugert IL-5, IL-20 og IL-28A (rød). Begge kjerner (anti-DAPI) og cytoplasma (anti-tubulin-Alexa488) er kontra med DAPI (blå) og tubulin-Alexa488 (grønn).
IL-5, IL-20 og IL -28A Aktiverer MMP-9 Expression via aktivering av transkripsjonsfaktorer NF-kB og AP-1 i blærekreft Cells
Tidligere rapporter vist at MMP-9 uttrykk var nært forbundet med blære tumorinvasjon og migrasjon [4], [15], [25] – [29]. Våre data viser at IL-5, IL-20 og IL-28A stimulert migrering og invasjon av blærecancerceller (figur 4 og 5). Resultatene bedt oss om å undersøke hvorvidt IL-5, IL-20 og IL-28A induserer MMP-9 uttrykk. Behandling av begge typer kreftceller med IL-5 resulterte i betydelig oppregulering av MMP-9-ekspresjon i en treringstrinnet og tidsavhengig måte, detektert ved hjelp av gelatin zymografi og immunoblotanalyse (figur 9A, 9B, 10A og 10B) . Lignende resultater ble observert etter behandling med enten IL-20 eller IL-28A, henholdsvis (figur 9A, 9B, 10A og 10B). I tillegg, ekspresjon av MMP-2, en annen matriks-metalloproteinase, ble også stimulert i IL-5, IL-20- og IL-28A-behandlede celler, så som 253J og EJ celler (figur 9A, 9B, 10A, og 10B). 5′-regulatoriske regionen av human MMP-9-promoteren inneholder flere konsensusmotiv for NF-kB, AP-1, og Sp-1 transkripsjonsfaktorer [30] – [32]. Vi antok at MMP-9-ekspresjon av IL-5, IL-20 og IL-28A kan være korrelert med økt aktivitet av NF-kB, AP-1, og Sp-1 i kjernen. For å oppnå dette, utførte vi en elektroforetisk mobilitet skift-analyse (EMSA) ved hjelp av atom ekstrakter av blærecancerceller indusert ved hjelp av IL-5, IL-20 og IL-28A. IL-5, IL-20 og IL-28A induserte signifikant økning av NF-kB og AP-1-bindende aktiviteter i 253J cellelinjer (figur 11). Det er ingen spesifikke bindingskomplekser til Sp-1 ble observert i celler behandlet med en hvilken som helst av interleukinene (figur 11). Imidlertid, i tilfelle av EJ celler, både IL-5 og IL-28A stimulert NF-kB-bindingsaktivitet (figur 12). Økt NF-kB og AP-1 bindende aktivitet ble påvist i IL-20-behandlede EJ celler (figur 12).
(A) Cellene ble dyrket til 70% konfluens i DMEM supplert med 10% FBS og mediet ble skiftet til et serum-fritt medium. Cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av IL-5, IL-20 og IL-28A i 24 timer. (B) Tidsavhengig MMP-9-ekspresjon i blærecancerceller indusert ved hjelp av IL-5, IL-20- og IL-28A. Celler i serumfritt medium ble inkubert med IL-5, IL-20- og IL-28A (100 ng /ml) i forskjellige tidsrom. Kondisjonert media fra (A) og (B) ble analysert ved zymographic MMP aktivitet. Protein ekspresjon av MMP-2, MMP-9 og GAPDH ble bestemt ved immunoblotanalyse.
(A) Sammenflytende celler ble dyrket i DMEM supplert med 10% FBS, og mediet ble skiftet til et serum -gratis medium. Cellene ble stimulert med angitte konsentrasjoner av IL-5, IL-20 og IL-28A i 24 timer. (B) induksjon av tidsavhengig MMP-9-ekspresjon i IL-5, IL-20- og IL-28A-behandlede blærekreftceller. Celler i serumfritt medium ble stimulert med IL-5, IL-20- og IL-28A (100 ng /ml) i angitte tider. Zymographic MMP-aktivitet ble analysert ved anvendelse av kondisjonert medium fra (A) og (B). Protein ekspresjon av MMP-2, MMP-9 og GAPDH ble utsatt for immunoblot-analyse.
Cellene ble dyrket med serumfritt medium inneholdende de angitte konsentrasjoner av IL-5, IL-20 og IL -28A. Etter 24 timer, ble atom ekstrakter fra cellene analysert av EMSA for aktivert NF-kB, AP-1, og Sp-en ved hjelp av radiomerkede oligonukleotidprober.
Celler ble inkubert med serum-frie medier for de angitte konsentrasjoner av IL-5, IL-20 og IL-28A i 24 timer. Deretter ble nukleære ekstrakter fra celler underkastet EMSA for å teste NF-kB, AP-1, og Sp-1-bindingsaktivitet ved bruk av radioaktivt merkede oligonukleotidprober.
Induksjon av MAPK og Jak-Stat signale pathway i blærekreft celler indusert av IL-5, IL-20 og IL-28A
Fordi system for cytokiner primært aktiverer Jak /Stat og MAPK signaltransduksjonsveier [8], vi neste undersøkt signalkaskader indusert av IL-5, IL-20 og IL-28A i blærecancerceller. Tidsforløpseksperimenter ble utført i 253J og EJ celler. IL-5 behandling induserte aktiveringen av ERK1 /2, JNK, JAK1, JAK2, STAT1, Stat2, og Stat3 i 253J celler (Figur 13A og 14A). Stimulering av EJ celler med IL-5 resulterte i aktivering av ERK1 /2, p38MAPK, JAK1, JAK3, STAT1, og Stat3 (figur 13B og 14B). I tillegg har IL-20 økte aktiveringen av ERK1 /2 i både 253J og EJ celler (Figur 13A og 13B). Aktivering av JAK2, JAK3, Stat2, og Stat5 ble påvist i IL-20-behandlede 253J celler (Figur 14A). Behandling med IL-20 stimulerte aktiveringen av JAK1, JAK2, STAT1, Stat2, og Stat5 i EJ celler (Figur 14B). Når det gjelder IL-28A, ble aktiveringen av ERK1 /2 observert i 253J celler (Figur 13A), p38MAPK aktiveringen var oppregulert i EJ celler (Figur 13B). Behandling av 253J-celler med IL-28A indusert aktivering av JAK2, JAK3, Stat3, og Stat5 (figur 14A). Videre ble aktivering av JAK2, STAT1, og Stat3 indusert av IL-28A behandling i EJ celler (Figur 14B). Imidlertid ble AKT aktivering ikke påvirkes i IL-5, IL-20- og IL-28A-behandlede blærekreftceller (figur S5a og B).
(A, B) Cellene ble inkubert i IL -5, IL-20 og IL-28A (100 ng /ml) i de angitte tidsrom, og ble deretter høstet, lysert og underkastet immunoblotanalyse for aktiverings nivåer av MAPK ved hjelp av spesifikke antistoffer.
(A, B) Celler ble behandlet med IL-5, IL-20 og IL-28A (100 ng /ml) i de angitte tidsrom, og ble deretter høstet. Aktiverings nivåer av Jak-Stat ble oppdaget av immunoblot analyse ved hjelp av spesifikke antistoffer.
Diskusjoner
Mange studier har brukt genuttrykk profilering av kreft i urinblæren ved hjelp av mikromatriser. Tidligere studier med analyse av genuttrykk profilering har fokusert på celleproliferasjon, cellesyklusregulering, DNA replikasjon og reparasjon, apoptose, signaltransduksjon, transkripsjonsfaktorer, angiogenese, celle adhesjon, sår helbredelser, og cytoskjelettet. I den foreliggende studien, uttrykk mønstre av en rekke kreftrelaterte klassiske gener (f.eks VEGF, PGF, FGF18, AKT, E2F1, ATF5) innen microarray datasettet ble oppdaget som spådd. Den hierarkiske clustering analyse antydet at mange gener kan delta i regulatoriske nettverk som involverer flere biologiske systemer som er nødvendige for blærekreft utvikling. Men lite er kjent om immunologiske eller inflammatoriske-assosiert cytokiner involvert i utviklingen av menneskelig kreft i urinblæren.
Basert på resultatene fra dagens microarray datasettet, har vi bestemt forskjellene i immun responsive genuttrykksmønster mellom normal og MIBC. Ti (10) gener (tabell 2) ble oppregulert på grunnlag av deres genuttrykksmønster i MIBC, sammenlignet med normal slimhinne prøver, noe som tyder på at disse opp-regulerte gener er nært forbundet med utvikling av blærekreft. Ved det første trinn av undersøkelsen, fra disse 10 gener har vi funnet 3 store cytokiner, IL-5, IL-20 og IL-28A, som deltar i overføringen, invasjon, og MMP ekspresjon uten å påvirke celleformering, noe som indikerer en koordinert program klynge for å tillate progresjonen av TCC som bestemmes av sårhelende migrasjon, invasjon assay, zymografi, proteinnivåer, og EMSA aktivitetsnivå. I tillegg har vi også identifisert at MAPK og Jak /Stat signalering er aktivert i blæren kreft celler etter behandling med IL-5, IL-20 og IL-28A.
IL-5 ble opprinnelig identifisert som en T -celle erstatte faktor (TRF), og ble senere funnet å regulere aktivering, proliferasjon og overlevelse av eosinofiler [33]. IL-5 har også vist seg å være en viktig regulator for differensiering av mus-B-celler [34]. IL-5-reseptoren er en heterodimer som består av a- og p-subenheter. Den α-subenhet er ligand-spesifikke (IL-5Rα), mens den β-subenheten (βc) er felles for IL-3 og IL-5 [33], [34]. Tidligere studier har vist at IL-5 aktivert Lyn [35], JAK2 /STAT1 [36], MAPK [35], Syk [37], og PI3K [38] i eosinofiler. Aktiveringen av JAK2, BTK tyrosinkinaser, PI3K, SHC, Vav, og HS1was assosiert med IL-5-indusert proliferasjon av B-celler [39]. IL-5 arrangøren inneholdt viktige transkripsjonsfaktorer inkludert SP1, E12 /E47, Oct-2, og c /EBPβ i B-celler og eosinofile [40]. Bruken av rBCG vaksiner for behandling av blære- karsinom ikke produserte TH-2-cytokiner inkludert typen IL-5-nivåene [41]. I denne studien ble både IL-5 og IL-5Rα oppdaget av RT-PCR og immunoblot i blæren kreftceller. Vi har også identifisert aktivering av ERK1 /2, p38MAPK, JNK, JAK1, JAK2, JAK3, STAT1, Stat2, og Stat3 i blæren kreftceller. Vår observasjon i dette forsøk er konsistent med en nylig rapport som viser at sirkulatoriske nivåer av IL-4, IL-5 og IL-10 var signifikant høyere i blærekreft pasientserum enn i normale prøver [19]. Således kan en økning i IL-5-nivåer i denne studien være ansvarlig for augmented utvikling av blæretumorceller og deres manglende evne til å bli gjenkjent av inflammatoriske.
IL-20, er pleiotropisk inflammatoriske cytokin, er funnet i keratinocytt og identifisert som et medlem av IL-10-familien cytokiner, som omfatter IL-10, IL-29, IL-20, IL-22, IL-24 og IL-26 [42], [43]. IL-20 stimulerer signaler gjennom 2 alternative heterodimere komplekser, som består av enten IL-20R1 og IL-20R2 eller IL-22R1 og 20R2 IL-[42], [43]. Resultater fra denne studien viste ekspresjon av IL-20 og IL-20R1 i blærecancerceller. Med hensyn til signalisering, IL-20 induserte Stat3 aktivering i keratinocytter [42]. En tidligere rapport viste aktiveringen av MAPK, slik som ERK1 /2, p38 MAPK, og JNK, i IL-20-behandlede HUVEC-celler [44]. IL-20-behandling også indusert aktivering av JAK2 /Stat3 og ERK1 /2 pathway in GBM8901 glioblastom-celler [45]. Våre resultater fra blærekreftceller tyder på at IL-20-indusert aktivering av ERK1 /2 og Jak1, JAK2, Jak3, STAT1, Stat2, og Stat5. I tillegg er IL-20 i forbindelse med flere inflammatoriske sykdommer [45], [20], inkludert psoriasis, revmatoid artritt, nyresvikt, hjerneskade, og aterosklerose.
