Abstract
Høy klasse hjernesvulst (World Health Organization klasse III anaplastisk astrocytom og klasse IV glioblastoma multiforme), de mest utbredte primære ondartede hjernesvulster, viser en mobil hierarki med selvfornyende, tumorigent kreftstamceller (cscs) på toppen. Mens CSC hypotesen har vært en attraktiv modell for å beskrive mange aspekter av tumor atferd, er det fortsatt kontroversielt på grunn av uløste problemer, inkludert bruk av
ex vivo
analyser med differensial vekstvilkår. En CSC befolkningen har blitt bekreftet i maligne gliomer med fortrinnsrett svulstdannelse fra celler direkte isolert fra pasientbiopsiprøver. Imidlertid, direkte sammenligning av flere tumorcellepopulasjoner med analyse av de resulterende fenotyper av hver populasjon innenfor et representativt svulst miljø er ikke blitt klart beskrevet. For å direkte teste den relative tumorigent potensialet cscs og ikke-stilk tumorceller i samme mikromiljøet, vi forhørt matchet svulstpopulasjonene renset fra en primær menneskelig svulst transplantert inn en xenograft mus modell og overvåkes konkurranse
in vivo
tumorvekst studier med serie
in vivo
intramikroskopi. Mens cscs var et lite mindretall av den første transplanterte kreftcelle befolkning, cscs, ikke de ikke-stammen tumorceller, kjørte tumordannelse og ga svulster viser en mobil hierarki. I de resulterende tumorer, en brøkdel av de opprinnelige transplanterte cscs opprettholdt ekspresjon av stamcelle og spredning markører, som var signifikant høyere sammenlignet med den ikke-stammen tumorcellepopulasjon, og vist at cscs genererte cellulær heterogenitet i tumoren. Disse head-to-head sammenligninger mellom matchet cscs og ikke-stilk tumorceller gir den første funksjonelle bevis ved hjelp av levende avbildning som i samme mikromiljøet, cscs mer enn ikke-stilk tumorceller er ansvarlig for svulst forplantning, bekrefter den funksjonelle definisjonen av en CSC
Citation. lathia JD, Gallagher J, Myers JT, Li M, Vasanji A, McLendon RE, et al. (2011) Direkte
In Vivo
Bevis for Tumor Formering med Glioblastoma kreftstamceller. PLoS ONE 6 (9): e24807. doi: 10,1371 /journal.pone.0024807
Redaktør: Ilya Ulasov, University of Chicago, USA
mottatt: 17 juni 2011; Godkjent: 22 august 2011; Publisert: 22.09.2011
Copyright: © 2011 lathia, et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Work in Rich lab støttes av Damon Runyon Cancer Research Foundation, Nasjonalt hjernesvulst Society, Goldhirsh Foundation, James S. McDonnell Foundation, og NIH tilskudd CA112958 (JNR), CA116659 (JNR), CA154130 (JNR), CA151522 (ABH), 5P50-NS-20023-26 (REM) og en National Research service Award CA142159 (JDL). REM er støttet av Pediatric hjernesvulst Foundation. JNR er en Damon Runyon-Lilly Clinical Investigator støttes av Damon Runyon Cancer Research Foundation. ABH er støttet av National hjernesvulst Society. AYH støttes av St. Baldrick stiftelse, Dana Foundation, Cancer Research Institute, og Gabrielle Angel Foundation. JDL er støttet av en amerikansk hjernesvulst Association Fellowship (sponset av Joelle Syverson Fund). AYH og JDL erkjenner pilot tilskuddsmidler fra Case Comprehensive Cancer Center (RES50-5509). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
menneske~~POS=TRUNC svulster ofte vise en heterogenitet innenfor deres neoplastisk rommet som kan være avledet fra en kombinasjon av stokastiske genetisk kopitall endringer og en epigenetisk hierarki som co-utvikle seg over tid [1]. Integrering konseptet at tumorer kan inneholde en stamcelle-lignende populasjon ansvarlig for vedlikehold og formering kan være informativt for både kreft og stamcelle feltene [2]. CSC hypotesen kan gi innsikt i terapeutisk motstand og tumorresidiv og understreker kompleksiteten av kreft. Spenningen rundt CSC hypotese er farget av uenighet med hensyn til passende eksperimentelle modellsystemer for å funksjonelt definere cscs, CSC frekvens og universelt informative immunophenotypes [3]. Normale og neoplastiske stamceller er i dag definert av funksjonelle analyser av selvfornyelse og differensiering, med den mest nøyaktige analysen hittil for cscs være svulst forplantning. Xenotransplantasjon modeller har bekreftet den forbedrede tumordannelsen kapasiteten til CSC-anrikede fraksjoner i en rekke humane tumorer, og er blitt anvendt for å beregne hyppigheten av tumorceller som forplanter [4], noe som er ganske høy noen ondartede sykdommer [3]. Som nisje der både normale og neoplastiske stamceller bor instruerer selvfornyelse og vedlikehold, levende dyr in vivo imaging teknikker har blitt brukt til noen stamcellepopulasjoner – spesielt blodkreft og leukemiske stamceller – å bestemme vekstmønstre i den opprinnelige mikro [ ,,,0],5], [6], [7], men programmet til solid vev har vært begrenset. Solid tumor cscs er blitt karakterisert i ex vivo-analyser eller som atskilte populasjoner, og disse har vært lærerikt å bestemme differensielt regulerte reaksjonsveier, men har forhindret den direkte analyse av tumorutbredelse potensial mellom forskjellige tumorcellefraksjoner. For å vurdere potensialet for cscs i direkte forhold til ikke-stem tumorceller i et representativt mikromiljøet, vi differensielt merket GBM cellefraksjoner avledet fra en human tumor og tumor overvåkes oppførsel i en xenotransplantasjon modell over tid ved hjelp av intravital mikroskopi. Til tross for et lite antall cscs på transplantasjon, ble tumorutbredelse drevet av cscs og deres etterkommere, demonstrere evne til cscs, men ikke uten stilk tumorceller, for å kjøre tumordannelse og forplante cellulær heterogenitet.
Materialer og Metoder
Transplantasjon av glioma celler
Menneskelige glioma celler ble avledet med skriftlig informert samtykke og under godkjente IRB-protokoller fra Cleveland Clinic (protokoll 2559) og Duke University (protokoll 7409). Glioma celler ble transient passert som xenotransplantater i nakne mus under godkjente Cleveland Clinic IACUC protokollen ARC 8699 og in vivo avbildning ble utført under Case Western Reserve University Protocol 2009-0109). For første svulstdannelse studier CSC, tumor prøven brukes (T4302) var en nylig diagnostisert grad III anaplastisk astrocytom i en 40 år gammel mann som ble kirurgisk fjernet ved Duke University. På tidspunktet for fjerning, ble prøven karakterisert til å ha EGFR polysomy (EGFRvIII negativ), MGMT negativ, intakt PTEN, og polysomy av kromosomer 7 og 10. For å blande cellestudier (dvs. konkurranse assay), tumorprøven som brukes (T4121) var et tilbakevendende glioblastoma multiforme (GBM) diagnostisert i en 26 år gammel mann som ble kirurgisk fjernet ved Duke University. På tidspunktet for fjerning, ble prøven karakteriseres til å ha forsterket EGFR (men EGFRvIII negativ), MGMT positiv, PTEN tap, tap av kromosom 9p21, og polysomy av kromosomer 1p36, 1p32 og 19q13. For eksperimentelle studier, ble tumorceller fjernet fra xenografter og cscs ble beriket basert på CD133 uttrykk ved flowcytometri (ved hjelp av en CD133 /2-APC antistoff, Miltenyi) så funksjonelt analysert for selvfornyelse, multi-avstamning differensiering, stamcelle markør uttrykk og tumorutbredelse som tidligere beskrevet [8]. Antatte cscs fra GBM prøven T4302 ble transduced med et lentivirus å uttrykke grønne fluorescerende protein (GFP). For svulst prøven T4121, ble antatte cscs merket med gul fluoriserende protein (YFP) eller og ikke-stilk tumorceller ble merket med en cyan fluorescerende protein (CFP, tumor prøven T4121) av lentivirus (Sigma). Merkede cscs og ikke-stammen tumorceller (avledet fra T4121) ble blandet med en 10%: 90% [eller 01:09] (CSC: ikke-stilk tumorcelle) forhold og transplantert inn i cortex av en naken mus ved en dybde 1,5 – 2 mm. Hjerne vinduer ble installert som tidligere beskrevet [9]. Imaging studier benyttet 25.000 transplanterte cellene. Alle kirurgiske prosedyrer ble gjort under en godkjent Cleveland Clinic IACUC protokollen.
multiphoton bildebehandling
intramikroskopi ble utført ved hjelp multiphoton bildebehandling som tidligere beskrevet [10] med en Leica SP5 imaging system med en 16W femto -Andre laser innstilt til 840-860 nm og fokusert gjennom en 20X nedsenking i vann objektiv (numerisk blenderåpning på 1,0). Før bildebehandling, ble musene bedøvet og intravenøst injisert med høy molekylvekt fluorescerende dekstran ( 150 kD) for å markere blodkar. Bilder ble ervervet over en 200 mikrometer utvalg i 2 mikrometer z-stabler. Maksimal intensitet projeksjoner, som representerer 200 mikrometer i dybden, ble jevnt justert i Photoshop (Adobe) før å vise. For tredimensjonale rekonstruksjoner, ble data importeres til Imaris programvare (bitplan) for overflategjengivelse og volumet ble kvantifisert for hver cellepopulasjon.
Farging og statistisk analyse
Frysesnitt ble kuttet ved hjelp av en cryostat (Leica) og farging ble gjort som tidligere beskrevet [11] med antistoffer mot Tra1-85 (R 400.000 celler. Immunfenotyping av de transplanterte cellepopulasjoner ble bekreftet ved hjelp av strømningscytometri CD133 uttrykket (CD133 /2-APC-antistoff, Miltenyi) for hver cellepopulasjon som tidligere er beskrevet [8]. Immunfarging på hver celle populasjonen in vitro ble utført ved anvendelse av antistoffer som er beskrevet ovenfor og kvantifisert basert på et minimum av 150 celler fra 10 felt. Statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av enveis ANOVA.
Automatisert bildeanalyse
Stort felt-of-view (FOV) bilder av kreft tverrsnitt ble anskaffet ved hjelp av en Leica DM4000, en 40X objektiv en Q-Imaging CCD, et Prior 8-lysbilde motorisert scenen, bilde-Pro 6.2, og YFP, CFP, Cy5 (DRAQ5 merket kjerner), og Texas Red (Sox2, Tra-1-85, eller PH3) filter kuber. Store FOV bilder (rundt 500 MB /kanal) ble importert til Bilde-Pro for analyse ved hjelp av tilpassede makroer. For hvert tverrsnitt ble Draq5 kanal importert og spektralt utvidet for å utjevne utseendet til hver kjerne. Cellekjernene ble deretter segmentert, morfologisk «utvidet» for å forlenge deres grenser inn i cytoplasma, og «vannskille» filtrert for celleseparasjon. En region av interesse (ROI) ble trukket rundt bulk svulsten og CFP, YFP, og Texas Red kanaler ble lagt i rekkefølge. Hver kanal ble spektralt filtrert og «multiplisert» av cellen masken som er beskrevet ovenfor. Segmentering via morfometriske og intensitet profiler spesifikk for hver markør /beis fulgt av bilde logiske operasjoner gitt YFP, CFP, og antistoff positive celletall. For immunfenotyping av det transplanterte befolkningen, den resulterende binære kjernefysiske maske var «multipliseres» med tilhørende PH3 /Sox2 kanal. Positivitet ble automatisk tildelt basert på gjennomsnittlig atom intensiteten PH3 eller Sox2 over en forhåndsdefinert terskel.
Resultater
maligne gliomer er solide kreftformer som cellulære hierarkier er reproduserbart definert, tillater avhør av celler som kan prospektivt beriket for CSC egenskaper, herunder selvfornyelse, differensiering potensial, stamcelle markør uttrykk, og in vivo tumorutbredelse. For å løse differensial in vivo tumorutbredelse potensial, vi utnyttet modeller som vi tidligere hadde demonstrert evnen til å anrike eller funksjonelt utarme for CSC egenskaper i ex vivo-analyser ved anvendelse av fluoriserende fargestoff celleoverflate-merking [8], [11]. Mens det er striden rundt CD133 som CSC markør, mange foreslått glioma CSC markører (inkludert L1CAM [12], A2B5 [13], og inte alpha 6 [11]) overlapper med CD133. Vi finner at CD133 beriker for cscs i GBM prøvene anvendt for studier og segregerer for tumorsphere formasjon effektivitet sammenlignet med integrin a-6 (data ikke vist). I tillegg CD133 fraksjoner effektivt forplante sekundære svulster og CD133 berikelse av cscs fra disse svulstene har nylig blitt brukt til å validere en CSC-spesifikke ikke-reseptor tyrosin kinase og nitrogenoksid syntase isoform [14], [15]. CD133 ekspresjon ble vurdert etter merking med flowcytometri med 11% av YFP-celler (avledet CSC) og 1% av CFP-celler (ikke-stammen avledet) er CD133 positiv (data ikke vist). Den viral merking prosedyren endret ikke vekstegenskaper (data ikke vist).
In vivo
observasjon av kreft stamcelle vekst inn i en svulst
Til dags dato, veksten av solide svulster cscs har ikke blitt evaluert ved enkelt celle oppløsning over en tidsmessig tidsforløp in vivo. For å observere potensialet for tumorutbredelse ved cscs alene, anvendte vi intravital mikroskopi i en ortotopisk xenotransplantasjon musemodell for å identifisere og spore veksten av små mengder cscs inn i en svulst over tid (fig. 1A). Tidlig i observasjonsperioden når begrensede mengder cscs var til stede (T4302, dager 3 til 13), ble cscs assosiert med blodårene i perivaskulær nisje (Fig. 1B, C) som beskrevet av Gilbertson og medarbeidere [16] og vokste i nærhet med blodårer (fig. 1D, E). Over tid (fra dag 13 og 20), en svulst nodul hurtig dannes og tumorceller ble observert å infiltrere de perifere områder (blå piler), en felles histologisk kjennetegn på maligne gliomer. Resultatene gir den første tumorvekst temp tidsforløpet av cscs av levende avbildning og bekrefter tumorigent potensialet i de transplanterte cscs.
Svulstdannelse i en xenotransplantasjon modellen ble observert fra GFP-merket cscs over tid som vist i eksperimentelle utforme skjematisk (A). Projeksjonsmikrografer (BD) demonstrere tumordannelse over tid og tredimensjonale rekonstruksjoner som er vist på mikrografer (E, E «) viste tumorceller var nært knyttet til blodkar (E», som er vist med hvite piler i D, E) og i perifere områder (D, E, vist i blå piler). Fluorescent dekstran (vist i rødt) ble injisert inn i sirkulasjonen for å belyse blodkar før avbildning. Scale bar representerer 50 mikrometer.
Kreft stamceller vokse uten stilk tumorceller
in vivo
En rekke studier har vist differensial svulstdannelse kapasitet mellom cscs og ikke -stem kreftceller [8], [15], [17], [18], men en head-to-head sammenligning mellom de to populasjonene i høy oppløsning eller i en tidsavhengig måte har ikke blitt utført. Denne vurderingen er avgjørende som en ondartet gliom er bygd opp av flere cellepopulasjoner, er krysstale mellom populasjonene, og hvordan de cellepopulasjoner samhandler er sannsynlig å være informativ med hensyn til tumorigen prosesser. For å vurdere oppførselen til cscs og ikke-stilk tumorceller i en identisk mikromiljø, transplantert vi differensielt merket humant cscs og ikke-stilk tumor-celler avledet fra det samme foreldre tumor inn i den samme mottaker mus og overvåkes in vivo atferd over tid ved hjelp av intravital mikroskopi (fig. 2A). Sekvensiell in vivo vurdering av den samme vert som bærer en første blanding av CSC (10%, YFP merket) og ikke-stilk tumorceller (90%, CFP-merket) viste at cscs vokste ikke-stilk tumorceller, med en 51,9 gangers volumøkning for cscs og en 0,92 ganger økning for de ikke-stilk tumorceller (fig. 2B), og det var begrenset blandet vekst hos populasjoner (fig. 2C, D). Bruke flere cellepopulasjoner fra samme svulst, disse bilde resultatene gir det første bevis for differensial tumordannelse kapasitet mellom cscs og ikke-stilk tumorceller in vivo med høy oppløsning sekvensiell bildebehandling.
fraksjonert cscs og ikke-stammen tumor cellene ble merket med ulike fluorescerende proteiner og transplantert i mus i en 10% kreft stamcelle (YFP) til 90% ikke-stilk tumorcelle (CFP) forhold som er vist i eksperimentell design skjematisk (A). Cscs vokste ikke-cscs in vivo som vist i sammendraget grafen (B), som ble beregnet på grunnlag av tredimensjonale rekonstruksjoner av projeksjonsmikrografer (B, C). I tillegg gjorde svulstpopulasjonene ikke blander in vivo (non-stammen svulst befolkningen angitt med gul oval). Fluorescent dekstran (vist i purpur) ble injisert inn i sirkulasjonen for å belyse blodkar før avbildning. Scale bar representerer 100 mikrometer.
Dannede svulster inneholdt kreftstamceller og deres etterkommere
De sekundære svulster som dannes av transplanterte cscs inneholde flere cellepopulasjoner, men tidligere studier har i stor grad fokusert på histologi av sekundære tumorer eller ekspresjon av tumor markører, men det har vært begrenset informasjon med hensyn til graden av heterogenitet i tillegg til bidraget fra flere celletyper til utvikling av heterogeniteten. Etter at musene nevrologiske tegn (som strekker seg fra 37 til 42 dager etter transplantasjon), benyttet vi histologisk undersøkelse for å bekrefte fenotypen av de transplanterte cellene i de resulterende tumorer. For å avgrense grensene for svulster, ble vev farget for et menneske spesifikt antigen, Tra-1-85. Vi fant at mens både YFP positive (CSC avledet) og CFP positive (non-stammen avledet) var synlig, var det overveldende flertallet av kreftceller avledet fra cscs; 94,5 prosent av tra-1-85-positive celler i tumoren var YFP positive (CSC avledet) som funksjon av 0,2 prosent som var CFP positive (ikke-stammen avledet, Fig. 3A, B).
Svulster fra cellen blandings eksperimenter (n = 3) ble bedømt for å bestemme deres sammensetning. Påfølgende evaluering av resulterende tumorer demonstrerer at de fleste av cellene i tumormassen var av human opprinnelse og er avledet fra CSC som bekreftet ved Tra-1-85 flekker og YFP uttrykk som er vist på representative mikrofotografier (A) og stolpediagram (B) . Perifere transplanterte kreftceller (YFP positive cscs og deres etterkommere) ble observert å ha en tilknytning til blodkar. Micrograph fra multiphoton bildebehandling og tredimensjonal rekonstruksjon (C) viser nær tilknytning av tumorceller (grønn) med tilstøtende blodkar (lilla, opplyst av fluorescerende dekstran injeksjon i omløp før bildebehandling). Histologisk undersøkelse av resulterende svulster bekrefter nære tilknytning av perifere kreftceller til blodkar ved hjelp av CD31 farging (D; CD31 i rødt, tumorceller i grønt, kjerner i lilla). Scale bar representerer 50 mikrometer. Data vises som gjennomsnittsverdier +/- S.E.M. ***, P 0,001 vurdert ved enveis variansanalyse (ANOVA)
Association mellom blodkar og kreft stamceller og deres etterkommere
Muligheten for svulst. cellene til å vokse sammen blodårene er en fenotype som ofte identifisert i human glioma kirurgiske prøver. For å vurdere om denne fenotypen ble rekapitulert i tumorer som følge av co-transplantasjon av cscs og passet ikke-stilk tumorceller, vurderte vi tumorvaskulatur ved hjelp multiphoton mikroskopi og histologisk undersøkelse av resulterende tumorer (fig. 3C, D). På dag 38 (vist i Fig. 2B), var vi i stand til å identifisere en gruppe av tumorceller i periferien av tumoren og tre-dimensjonal analyse viste at cscs og deres etterkommere (YFP celler) var i umiddelbar nærhet til blodkar (fig. 3C). Histologisk undersøkelse av resulterende tumor ved bruk av et antistoff mot CD31 å markere blodkar også bekreftet at cscs og deres etterkommere (YFP + celler) var faktisk nær vaskulaturen i regioner adskilt fra mesteparten tumormassen, et fenomen også observert i GBM-pasienter (fig. 3D).
Kreft stamceller forplante heterogenitet
in vivo
for å finne ut om de transplanterte kreftceller inneholdt stilk-lignende celler, vi evaluert uttrykk for CSC markør, Sox2 [19], og fant at 25,9 prosent av transplanterte cscs og deres etterkommere (YFP celler) ble Sox2 positive, sammenlignet med 0,1 prosent av ikke-stilk tumorceller og deres etterkommere (CFP-celler, fig. 4A, B). Vi har også vurdert spredning ved hjelp av M-fase markør fosforylert-histon H3 (PH3) og fant at 1,7 prosent av cscs og deres etterkommere (YFP celler) var aktivt i M-fase sammenlignet med mindre enn 0,01 prosent av ikke-stilk tumorceller og deres etterkommere (CFP celler, fig. 4C, D). Disse forskjellene i spredning sett i våre modell støtte kliniske rapporter som tyder prolifererende cscs (basert på CD133-positive status) karakteriserer en aggressiv klasse av GBM svulster [20].
Histologisk undersøkelse ble utført fra resulterer svulster i cellen blandings eksperimenter (n = 3) for å bestemme den fraksjon av stilk-lignende celler som vurdert ved Sox2 ekspresjon og nærværet av prolifererende celler som bekreftes av M-fase markør fosforylert histon 3 (PH3). Representative mikrografer (A) og søylediagram (B) viser Sox2 uttrykk (rød) er assosiert med kreft stamceller og deres etterkommere (grønn), men ikke med ikke-stilk tumorceller og deres etterkommere (blå). Representative mikrografer (C) og søylediagram (D) viser PH3 uttrykk (rød) er assosiert med kreft stamceller og deres etterkommere (grønn), men ikke med ikke-stilk tumorceller og deres etterkommere (blå). Scale bar representerer 50 mikrometer. Data vises som gjennomsnittsverdier +/- S.E.M. ***, P. 0,001 vurdert ved enveis variansanalyse (ANOVA), kjerner kontra med Draq5 (lilla)
For å få en forståelse for graden av heterogenitet etablert av det transplanterte cscs (YFP positive celler), vurderte vi fenotypen av cellene før transplantasjon. CSC kulturene inneholdt 74,8 prosent Sox2 positive celler (dvs. in vitro), sammenlignet med 24,9 prosent av Sox2 positive YFP-celler (avledet CSC) i tumoren (dvs. in vivo, Fig. 5A-C). Disse resultatene tyder på at in vivo miljø gir instruktive signaler for å gjenskape en likevekt av differensiering status og dermed cellulær heterogenitet. En tilsvarende reduksjon ble observert i Sox2 positive ikke-stammen tumorceller (CFP-celler) fra en opprinnelig populasjon av 7,1 prosent i kultur til 0,1 prosent i tumoren (Fig. 5A-C). Forskjeller i vekst ble også observert mellom populasjoner i kultur i forhold til innen svulsten. Ved hjelp av M-fase markør PH3 som et surrogat for spredning, observerte vi 2,1 prosent YFP positive celler (CSC avledet) og 0,2 prosent CFP-positive celler (ikke-stammen avledet) i kultur sammenlignet med 1,7 prosent YFP-positive celler og mindre enn 0,01 prosent CFP-positive celler i tumorer (figur 5A-C). Disse resultater viser at selv om ikke-stilk tumorceller fremherskende på tidlige tidspunkter på grunn av forholdene ved tidspunktet for transplantasjonen, voksende tumorer hadde et begrenset antall av celler avledet fra ikke-stammen tumorceller, hvorav noen få uttrykt stilk cellemarkører eller var aktive voksende. De resulterende tumorer besto av cscs og deres etterkommere, en fraksjon som fortsatt inneholdt stamcelle markør ekspresjon og var aktivt prolifererende.
Representative mikrofotografier (A) og stolpediagram (B) av ekspanderte celler før transplantasjon demonstrere Sox2 og PH3 uttrykket (rød) er høyere i CSC fraksjon av celler sammenlignet med de ikke-stammen tumorceller. Sammendrag Figuren viser markør ekspresjon fra in vivo og in vitro analyser (C). Scale bar representerer 50 mikrometer. Data vises som gjennomsnittsverdier +/- S.E.M. ***, P 0,001 og N.S. representerer ikke signifikant (p 0,05). vurdert ved enveis variansanalyse (ANOVA), kjerner kontra med Hoechst 33342 (blå)
Diskusjoner
svulstens mikromiljø er en kritisk regulator av tumordannelse og vedlikehold med bidrag til terapeutisk respons og fiasko. Imidlertid har mange CSC og hjernesvulst studier ikke riktig modellert mikromiljøet. Ofte CSC og ikke-stilk tumorceller dyrket i ulike forhold som inkluderer ulike medier og cscs vokst som kuler og ikke-stilk tumorceller dyrket adherently. Som disse forholdene aktivere forskjellige cellesignalveier, kan noen CSC resultatene skyldes kultur gjenstand i stedet for iboende cellulære forskjeller. Mange studier er utført med befolkningen i isolasjon, som ikke gir mulighet for å signalere mellom celler som er kritisk for cellevekst eller bedømmelsen av hver celletype bidrag til tumordannelse in vivo. Videre nisje interaksjoner med komponenter slik som blodkar eller stroma kan ikke fullt ut undersøkt med mindre studier er utført in vivo. For bedre å modellere svulsten mikromiljøet, vi ulikt merket cscs og ikke-stilk tumorceller og introduserte celler i det samme in vivo forhold. Evalueringen av vekst gir den første direkte bevis for tumor forplantning av en fast tumor CSC subpopulasjon in vivo ved hjelp av levende avbildning, og viser at en liten fraksjon av tumorceller kan forplante en heterogen svulst. Våre studier gir betydelige fordeler i forhold til ex vivo eller matchet befolkningsstudier på grunn av vår evne til å mer hensiktsmessig modell in vivo miljøet og vurdere oppførselen til flere populasjoner i sanntid ved hjelp av høy oppløsning mikroskopi.
Det er mange aspekter ved xenotransplantasjon modeller som gir potensielle fordeler, men det er fremdeles begrensninger. Konseptuelt disse transplantasjons analyser tilby en bedre in vivo miljøet på bekostning av en forståelse for tumorigene prosesser i sanntid, noe som bare kan utledes etter svulstdannelse. Imidlertid kan denne svarte boksen tilnærmingen rettes med bruk av levende avbildning som beskrevet i denne rapporten. Ved hjelp av levende avbildning, kan vanskelighetene med xenotransplantasjon modellen bli belyst og informative spådommer kan gjøres for svulst utvikling, vedlikehold, og effekten av behandlingen. Forsiktig bruk av xenotransplantasjon modeller vil gi rom for en større forståelse av samspillet mellom cscs og ikke-stilk tumorceller, samt cellulære kommunikasjonen med blodårer, en CSC nisje i flere hjernesvulster [16]. I tillegg kan disse fremgangsmåter klargjøre den nylig identifiserte fenomenet GBM CSC differensiering i vaskulære celler og klargjøre rollen denne plastisitet i tumorigen fremgangsmåter [21], [22], [23], [24]. Av notatet, hadde vi ikke observere integrering av merkede celler i karveggen (data ikke vist). Disse vaskulære interaksjoner har vidtrekkende terapeutiske implikasjoner spesielt i sammenheng med angiogenese hvor mange behandlinger er under etterforskning. I tillegg kan en større forståelse av samspillet mellom mikromiljøet og transplanterte kreftceller bidra til å forklare forsinkelsen i tumorvekst hos transplantasjons modeller. Dette er markert med våre observasjoner er vist i figur 1 hvor CSC vekst mellom dag 35 til dag 38 er ganske bemerkelsesverdig, men sammenfallende med dynamikken i tumorvekst i en transplantasjonsmodell [25], [26]. Disse forskjellene er sannsynlig å være en refleksjon av en flertrinns prosess som omfatter tumorcelleoverlevelse, tilpasning til verten miljø, etterfulgt av eksponentiell vekst, som kan ekstrapoleres til å forstå tilbakefall hos pasienter.
Våre data også påvise at en slik tilnærming kan anvendes for å bedre definere kreft cellulær heterogenitet, som vil være avgjørende for både den grunnleggende forståelse av tumorigenese og en modell for å teste mer hensiktsmessig lovende pre-kliniske behandlinger. I våre studier de resulterende tumorer som ble dannet inneholdt en heterogen populasjon, vurdert ved Sox2 ekspresjon, til tross for den betydelige representasjon av YFP-celler (avledet CSC). Denne typen in vivo avstamning sporing har vært begrenset i GBM studier og våre resultater bekrefter at cscs uttrykker en stamcelle markør kan generere celler som ikke uttrykker stamcelle markør, viser overgangen mellom stamcelle stater in vivo. Prekliniske studier stole på tumorstørrelse som en estimering av effekt. Vår demonstrasjon på at en liten brøkdel av kreftceller forplanter en tumor in vivo utgjør en komplementær måte for å evaluere effekten av en gitt behandling av avstamning sporing. Tatt inn i en klinisk sammenheng, en behandling som dreper de fleste celler og etterlater seg en liten bestand av ildfaste celler (trolig bli beriket i cscs) vises effektiv hvis tumorstørrelse er det målte resultatet. Men de resterende celler, hvorav noen er cscs, sannsynligvis vil bidra til tumorresidiv, som ofte sees hos pasienter etter behandling effektive i å redusere svulststørrelsen [27]. Derfor vurdere cellulære linjene i en tumor etter behandling i kombinasjon med svulst størrelse vurderinger og histologisk analyse er sannsynlig å gi et mer nøyaktig bilde av effekten av behandlingen. Evnen til å vurdere tumorcelle oppførsel seg i en klinisk relevant modell er verdifull. Våre data (denne rapporten og [11], [28]) og de fra andre grupper [16] viser at kreftceller har et intimt forhold til blodkar; men godkjente FDA vaskulær endotelial cellevekstfaktor (VEGF) nøytraliserende antistoffer bevacizumab (Avastin) har hatt blandet suksess klinisk, til tross for suksess i pre-kliniske modeller [29]. Resistens mot anti-VEGF-terapi er antatt å forekomme gjennom flukt eller likegyldighet og involvere modulerte angiogenese, vaskulogenese, vaskulær normalisering [30], [31]. Imidlertid er den dominerende modusen for motstand ennå ikke bestemt, og vår tilnærming ved hjelp av flere tumorcellepopulasjoner og høy oppløsning in vivo mikroskopi er egnet til å gi viktig innsikt. For større gjennomslagskraft, kan disse metodene bli kombinert med bruk av fluorescerende reportersystemer for å evaluere den transkripsjonelle aktivitet i sanntid og i korrelasjon til terapeutisk respons. Et annet område der disse bilde tilnærminger vil være nyttig er det evaluering av soniske pinnsvin (SHH) hemmere. Det er uklart om den virkningsmåte er direkte på tumorceller, tumor stroma, eller begge deler, og belysning av virkningsmekanismen er en umiddelbar prioritet som flere shh-inhibitorer er for tiden under undersøkelse når det gjelder en rekke forskjellige tumorer inkludert GBM [32] , [33].
