Abstract
Prostata Kreft er den vanligste kreftformen hos menn med få, kvantifiserbare, biomarkører. Prostatakreft biomarkører har vært hemmet på grunn av subjektive analyse av protein uttrykk i vevssnitt. En objektiv, kvantitativ immunhistokjemisk tilnærming gitt her, for diagnostisering og lagdeling av prostatakreft kan løse dette problemet. Antistoffer mot fire proteiner BTF3, Hint1, NDRG1 og ODC1 ble brukt i en prostatavevet array ( 500 individuelle vev kjerner fra 82 pasienter, 41 case-parene matchet med en pasient i hvert par hadde biokjemisk tilbakefall). Protein uttrykk, kvantifisert på en objektiv måte ved hjelp av en automatisert analyse protokollen i ImageJ programvare, ble økt i ondartet vs ikke-ondartet prostata (ved 2-2,5 ganger, p 0,0001). Operasjonelle egenskaper indikerer sensitivitet i området fra 0,68 til 0,74; Kombinasjonen av markører i en logistisk regresjonsmodell viser ytterligere forbedring i diagnostisk makt. Triple-merket immunfluorescens (BTF3, Hint1 og NDRG1) i vevet rekke viste en signifikant (p 0,02) endring i samlokalisering koeffisienter for BTF3 og NDRG1 co-uttrykk i biokjemisk tilbakefall vs ikke-tilbakefall kreft epitel. BTF3, Hint1, NDRG1 og ODC1 kan utvikles som epitel spesifikke biomarkører for vev basert diagnose og lagdeling av prostatakreft.
Citation: Symes AJ, Eilertsen M, Millar M, Nariculam J, Freeman A, Notara M, et al. (2013) Kvantitativ analyse av BTF3, Hint1, NDRG1 og ODC1 Protein Over-Expression i Human Prostate Cancer Tissue. PLoS ONE 8 (12): e84295. doi: 10,1371 /journal.pone.0084295
Redaktør: Domenico Coppola, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 23 august 2013; Godkjent: 13 november 2013; Publisert: 27.12.2013
Copyright: © 2013 Symes et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble finansiert av Prostate Cancer Research Centre veldedighet og Peters Trust. Forfatterne er takknemlige til Mike Millar, Sheila MacPherson og Nancy Evans fra Edinburgh University for å få hjelp med farging og Daniel Ciantar, UCL for Huygens programvarebruk. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
prostata carcinoma er en sykdom i epitel, det vanligste kreft hos menn, og årsaken til betydelig sykelighet og dødelighet [1]. Hvert år blir over 30 000 menn diagnostisert med prostatakreft og over 10 000 dør av sykdommen i Storbritannia. I 2010 ble 217,730 nye tilfeller av prostatakreft diagnostisert i USA, med 32,050 amerikanske menn dør av sykdommen [2].
Diagnose og prognose av prostatakreft er basert på vev morfologi fra biopsier (~ 1 million prosedyrer i USA og ~ 70.000 i Storbritannia /år). Første gang biopsier identifisere kreft i 38% av tilfellene, mens tvetydig diagnose eller falske negative utgjør ~ 25-30% av tilfellene [3]. Beskrivelsene av aggressivitet (f.eks Gleason grade) fastslå kreft ledelse og terapi, men har betydelige ulemper og høy varians, særlig for lav karakter kreft. Immunhistokjemi (IHC) anvendes for å løse tvetydig diagnose, imidlertid har de fleste IHC biomarkører blitt identifisert ved hjelp av subjektive (score) analyse å innføre store variabilitet [4]. For organ begrenset sykdom prostata biopsi forblir et kritisk klinisk verktøy, men det er behov for å løse falske negativer og avgrense diagnose. Ved å identifisere kreftformer som har god prognose over-behandling kan bli redusert, men det er ingen kvantitative proteinmarkører for å forbedre kvaliteten på diagnosen. En reproduserbar, kvantitativ tilnærming kan i stor grad forenkle denne prosessen.
Funn av IHC markører, i stor grad, og deres analyse er utført av semi kvantitative tilnærminger (f.eks scoring av vevssnitt farget med en kromosom eller fluorofor) med store interobservatør feil [4,5]. Scoring av intensiteten av en kromofor (eller fluorofor) omfatter visuell inspeksjon, etterfulgt av en poengsum innenfor et forutbestemt område ved experimenter. En tilnærming basert på visuell observasjon av mønstrede gjenstander som pattedyr vev, med distinkte arkitektur, eller visuell assesment av intensitet av et lyssignal som gjøres for IHC score, innebærer med alvorlige begrensninger av oppfatning av belysningsstyrke og dom, generelt [6] og for vurdering av prostatakarsinom, spesielt [7]. En ytterligere ulempe med å bruke en subjektiv scoring metode er at valg av target-proteiner som skal undersøkes graviterer mot ytterpunktene (enten sterkt uttrykt i kreft (f.eks EZH) eller fraværende i kreft (f.eks cytokeratins 5 og 6). Dette betyr at en stor rekke betydelige biologiske endringer som nødvendigvis oppstår innenfor disse ytterpunktene ikke er hentet, og kan ikke brukes for forståelsen av mekanismene for kreftutvikling eller utviklet som biomarkører for diagnose, eller lagdeling eller prognose av kreft. Kvantitativ IHC [8] kan identifisere nye biomarkører på en objektiv, reproduserbar måte, og i forbindelse med fluorescerende prober kan være nyttig for den sistnevnte. det er sannsynlig at ikke bare uttrykket men ko-lokalisering av to eller flere proteiner kan også endre seg som et resultat av sykdom eller behandling [9, 10]. En forutsetning for utviklingen av sykdommen, basert på molekyl, snarere enn morfologiske, kriterier krever også robust og reproduserbar påvisning av protein ekspresjon i IHC-seksjoner som kan følges ved å kvantifisere ko-lokalisering av forandringer i immunfluorescens [10].
I en tidligere studie har vi utviklet en semi-automatisert, kvantitativ metode for å måle uttrykket av Wnt5A i prostatavevet [8] i en prostatavevet array ( 500 vev kjerner fra 82 pasienter, 41 case-parene matchet med en pasient i hvert par hadde biokjemiske gjentakelse). Målet med denne studien var å anvende den kvantitative IHC metode for å vurdere om denne metoden kan brukes til å identifisere antatte kreftmarkører for diagnostiske formål. Vi valgte fire gener BTF3, NDRG1, Hint1 og ODC1 som er oppregulert i prostata carcinom (oncomine.org, utvelgelseskriterier: p = 0,0001, 2 ganger endring og i topp 10% av gener over-uttrykt i den samlede datasettet) i minst fire normal vs prostatakreft genekspresjonsanalyser datasett [11-14]. Vi brukte kvantitative immunhistokjemi [8] for å vise at uttrykket av BTF3, Hint1, NDRG1 og ODC1 proteiner øker i prostata kreft vev og kan tjene som mulige mål for etterforskningen av kreftutvikling eller biomarkører for sykdom. Vi benyttet en kvantitativ immunfluorescens tilnærming til stratify prostatakreft ved hjelp av samlokalisering koeffisientene BTF3, Hint1 og NDRG1.
Resultater
Kvantitativ immunhistokjemisk analyse av proteiner over-uttrykt i prostatakreft vev
Expression of BTF3, Hint1, NDRG1 og ODC1 var i stor grad epitel og økte i ondartet forhold til godartet eller ikke-maligne prostata kjerner (figur 1). Vi kvantifisert gråtoner DAB-label (Figur 1 og Figur S1), på en objektiv måte, ved hjelp av en reproduserbar, semi-automatisert partikkelanalyse (Analyser Particles) protokoll [8] med gråtonebilder av farget vev fra over 450-500 individuelle prostatavev kjerner for hver biomarkør (figur 2). Beregninger av totalt areal og område fraksjon er gitt i tabell 1. Integrering av AUC viste en økning i ekspresjon av BTF3, Hint1, NDRG1 og ODC1 i maligne kjerner, diagnostisert ved histopatologi, sammenlignet med ikke-maligne kjerner (p 0,0001, Mann Whitney U-test). Disse resultatene identifisere BTF3, Hint1, NDRG1 og ODC1 som proteiner som er over-uttrykt i prostatakreft.
(av over 500 vev kjerner farget for hvert antistoff) fra menneskelige prostata arrays. Disse er representanter for mer enn 450-500 vev kjernebilder analysert for hver biomarkør antistoff ved hjelp av automatiserte bildeanalyse-protokollen (se Materialer og metoder – Bilde partikkel analyse). Hver kjerne ble avbildes med en Leica oppreist mikroskop (10x) og lagres som en jpg fil. Hvert bilde ble brukt til å beregne protein uttrykk (DAB etikett, brun, hovedsakelig i akinærceller). Farget RGB-bilder (A-H) ble omdannet til tilsvarende gråtone bilder (I-P) for kvantifisering av DAB-signalet ved å bruke Analyse Partikkel protokollen i ImageJ programvare for å oppnå Totalareal farget, i piksel. Protein uttrykk for BTF3, Hint1, NDRG1 og ODC1 ble økt i maligne v godartede kjerner (p 0,0001).
En objektiv, automatisert protokollen ble brukt til å beregne Bruttoareal farget (i piksler) standardisert til mengden vev i hver kjerne (se Methods). TA er konvertert til området fraksjon (samlet areal delt på totalt antall piksler i bildet). Hver bin er data for et individ, ondartet (rød) eller ikke-ondartet vev (grønn) kjerne. Det er en betydelig økning i AUC for protein uttrykk i ondartet v ikke-ondartet prostatavevet (p 0,0001).
Protein
Forhold (
n
)
Bruttoareal og areal Brøk
*
dobling
BTF3Benign ( 236) 22 301 ± 16971,66 ± 0.12Malignant (228) 54 750 ± 35884,09 ± 0,27
2.5HINT1Benign (214) 28 564 ± 18822,13 ± 0.14Malignant (225) 67 173 ± 39774,93 ± 0.292.3NDRG1Benign (230) 27 752 ± 18752,07 ± 0.14Malignant ( 223) 72 297 ± 43805,4 ± 0.332.6ODC1Benign (261) 38 621 ± 41842,80 ± 0.31Malignant (243) 65428 ± 53894,88 ± 0.41.8Table 1. kvantifisering av protein uttrykk i maligne og ikke-maligne menneskelige prostata vev arryas hjelp ImageJ programvare.
DAB etikett, som representerer protein uttrykk for BTF3, Hint1, NDRG1 og ODC1 ble kvantifisert på en objektiv måte, ved hjelp av en reproduserbar, semi-automatisert partikkelanalyse (Analyser partikler) protokoll med ImageJ programvare. Over 500 individuelle prostata vev kjerner (se metoder) RGB-bilder ble omgjort til 16 bit gråtoner. Resultatene er gjennomsnitt ± SE for de beregnede parametre av totalareal og areal fraksjon. Disse dataene er standardisert for mengden av vev på hver kjerne ved hjelp av den inverse protokollen på ImageJ (se metoder). Fold økning i ekspresjon av proteinet i ondartet sammenlignet med ikke-ondartet (godartet) kjerner ble bekreftet ved AUC-beregninger av data fra figur 2. (n) = antall brukbare kjerner med i analysen.
*
Statistisk analyse: uttrykk, for alle proteiner, er vesentlig forskjellig i ondartet sammenlignet med ikke-ondartet prostata på P 0,0001 anvendelse av Mann Whitney U testen. CSV Last ned CSV
For å undersøke nytten av proteiner som mulige biomarkører for prostatakreft diagnose, beregnet vi den sanne positive rate (følsomhet) og falsk positiv rate (1-spesifisitet) ved ROC kurve (figur 3). Området fraksjons data ble forvandlet til probit og utstyrt til en Gaussisk funksjon. AUC-verdier på 1,0 for en ROC-kurve representerer høy selektivitet og følsomhet, mens 0,5 tyder på at den testede markøren ikke kan skille mellom ikke-maligne og maligne kategorier. Dot plott av de transformerte data er gitt i figur S2. Følsomhet og 1-spesifisitet ble beregnet for området fraksjons verdier for NDRG1, BTF3, Hint1 og ODC1 (tabell S1). Fast terskel (kriterier ) verdier for mulige biomarkører for diagnose varierer mellom 0,68 og 0,74 (tabell S1), som indikerer høy følsomhet for NDRG1, BTF3 og Hint1, som diagnostiske markører for å identifisere prostatakreft i vev kjerner av objektiv, kvantitativ immunhistokjemi. Positive sannsynlighetsforhold (LR +) for hver biomarkør ved de angitte kriteriene (tabell S1) varierte 1,7 til 2,4. En sannsynlighet forhold som er større enn en indikerer at resultatet er forbundet med nærværet av sykdommen [15]. NDRG1, BTF3 og Hint1 viste også LR + av 10 på ulike kriterier avskåret poeng; LR + s over 10, for en diagnostisk test, anses å gi sterke bevis for å herske i sykdom [15,16]. Den diagnostiske makt ble ytterligere forbedret ved å inkludere data fra to biomarkører i en logistisk regresjonsmodell (tabell 2). Gleason karakterene 4 + 3 og 3 + 4 består 80% av maligne vevsprøver oppstilt på vevet matrise (mellom 221-241 vev kjerner, se Tabell S2). Det var ingen signifikant forskjell i ekspresjonen av de fire biomarkører når segregerte for analyse basert på Gleason grad. (4 + 3 og 3 + 4, figur S3)
ROC-kurven viser den diskriminerende ytelsen av proteinet uttrykket i differensiering mellom maligne og ikke-maligne vev kjerner bruker området fraksjonen (probit) data for BTF3, Hint1, NDRG1 og ODC1. Drifts karakteristiske verdier er gitt i tabell S1. Den heltrukne linje representerer det ROC område på 0,5.
Protein kombinasjon
% tilfeller riktig identfied *
BTF 3 og HINT172BTF3 og NDRG178BTF3 og ODC193HINT1 og NDRG181HINT1 og ODC185NDRG1 og ODC197Table 2. Logistisk regresjonsmodell for å identifisere kombinasjon av markører som kan forbedre diagnostikk makt.
En logistisk regresjonsmodell ble ansatt bruker MedCalc programvare for å analysere forholdet mellom en dikotom avhengig variabel (ikke-ondartet v ondartet) og en eller flere uavhengige variabler (to biomarkører). Utfallet (prosent av tilfellene korrekt identifisert) antyder at innenfor kohort av prøver som brukes i denne studien, den diagnostiske makt til å identifisere ondartede tilfeller er økt med kombinasjonen av BTF3 og ODC1 og NDRG1 og ODC1. * Betydningen nivået av den samlede modellen passer for analyse for alle kombinasjoner er p 0,0001. CSV Last ned CSV
Sykdom stratifisering ved hjelp av flere markører og immunfluorescens farging
Det er anslått at rundt 30% av pasienter som gjennomgår radikal prostatektomi for klinisk lokalisert sykdom vil oppleve biokjemisk tilbakefall (definert som påviselig PSA ≥ 0,2 ng ml
-1 innen 2 år etter operasjonen). En kohort av pasientene som benyttes for vev matrisen i denne studien, hadde gjennomgått biokjemiske tilbakefall [17]. Vi antok at ikke bare en endring i ekspresjon men også ko-lokalisering av de identifiserte biomarkører endringene i prostata kreft epitel. Dette ble undersøkt av multi-merket immunfluorescens farging hjelp BTF3, Hint1 og NDRG1 antistoffer (figur 4). De 3-proteiner ble uttrykt forskjellig i ikke-ondartet (figur 4A) sammenlignet med ondartet (figur 4B) kjerner og funnet å være i stor grad i prostata epitelet, noe som bekrefter dataene fra individuelle antistoffer flekker ved bruk av 3,3-diaminobenzidin-pepperrotperoksidase ( DAB-HRP, fig S1 og figur 1). Disse resultater indikerer ikke bare at ekspresjon av disse protein biomarkører, hver for seg, er økt i prostata cancer (figur 2), men at uttrykket er stort sett epithelial og således bestemt til sykdomsprosessen (figur 4).
Samtidig uttrykk av tre proteiner BTF3 (FITC-grønn), Hint1 (Cy3- blå) og NDRG1 (Cy5-rød) i ikke-ondartet (A) og kjerner maligne prostatavevet (B); Bildene er representative vev kjerner fra vevet array med over 200 prøver. De tre antistoffer ble inkubert samtidig og merket med tre Cy5 -Red forskjellige fluorophores bruker Bond automatiserte farging system. Hele vev kjerner ble avbildes med et Leica konfokal system og 4×4 fliser på nøyaktig de samme innstillingene for sammenligning. Bilder ble zoomet 3x bruker digital zoom i ImageJ. Scale bar = 100 um
Samlokaliseringen av BTF3, Hint1 og NDRG1 var neste undersøkt i multi-merket immunofluorescence vev kjerner fra residiverende og ikke-residiverende pasienter fra kompositt fluorescerende bilder (Figur 5.; BTF3, Hint1 og NDRG1, grønn, blå og rød, henholdsvis) for å bestemme nytten av denne tilnærmingen for prostatakreft lagdeling. Det er en tydelig og målbar endring i mønsteret av farging av disse protein biomarkører i biokjemiske tilbakefall vev kjerner: BTF3 uttrykk vises mindre i tilbakefall, sammenlignet med ikke-tilbakefall prøver, mens Hint1 og NDRG1 uttrykk vises dominerende i tilbakefall vevsprøver (på vegne av vev kjerner fra biokjemiske tilbakefalls og kontrollpasienter er vist i figur 5A og B); kvantitativ colocalization analyse av høy forstørrelse deconvoluted bilder (Figur 5C og D) viste at det meste av den tilsynelatende endring i mønsteret av ekspresjon, for multi-merket vevssnitt i ikke-tilbakefall vs tilbakefall prøvene, ble på grunn av endringen i ko-ekspresjon av BTF3 (fluorescein isotiocyanat, FITC, grønn) og Hint1 (cyanin 3, Cy3, blå). Beregnede Pearson koeffisienter for colocalization for ikke-tilbakefall vs tilbakefall var 0,73 ± 0,02 vs 0,60 ± 0,07 (gjennomsnitt ± SD, n = 4, betydningen av forskjell p 0,02). Kvantitativ samlokalisering viser at multi-merking tilnærming kunne brukes til lagdelingen av prostatakreft i vev kjerner.
Samtidig uttrykk av tre proteiner BTF3 (FITC-grønn), Hint1 (Cy3- blå) og NDRG1 (Cy5 -Red) i maligne prostatavevet kjerner (A til D). Sammensatte mikrografer av immunofluorescently farget prostata vev kjerner fra pasienter med biokjemisk tilbakefall (definert som PSA ≥ 0,2 ng /ml innen 2 år etter radikal prostatektomi). Tissue kjerner fra 4 pasienter (matchet par for Gleason score og Ptil), non-tilbakefall (A) og biokjemisk tilbakefall (B) representative bilder som brukes for kvantitativ samlokalisering analyse (se metoder) er vist. Imaging ble utført ved hjelp av en Leica konfokal mikroskop; A og B er lave forstørrelse; C og D høyere forstørrelse; E er et eksempel på ekspresjonen av de tre markører i ikke-ondartet vev også ved høyere forstørrelse. Uttrykket av BTF3 (grønn), for eksempel er tydelig i ikke-tilbakefall prøvene, mens det ikke er veldig tydelig i kjerner fra tilbakefall pasienter. Imaging ble utført ved hjelp av et Olympus konfokal mikroskop (40x flislagt (A og B) eller 40x med digital zoom 3,5-4 (C, D og E). Høy forstørrelse bilder (C, D og E) ble dekonvolveres hjelp Huygens Profession programvare. 16bit tif-filer for hvert fluorophore (FITC, Cy3 og Cy5) ble importert til ImageJ og pseudo farget (FITC, grønn, Cy3, blå og Cy5, rød). Z-anslag for opp til 27 bilder er vist for hvert vev kjerne. Scale bar = 100 um for A og B og 20 pm for C og D. Kvantitativ colocalization analyse av bilder (for eksempel figur 5C og D) viste at det meste betydelig endring i mønsteret av ekspresjon, i ikke-tilbakefall vs tilbakefall prøvene, ble på grunn av endringen i co-uttrykk for BTF3 (FITC, grønn) og Hint1 (Cy3, blå) med Pearson koeffisienter for colocalization for ikke-tilbakefall vs tilbakefall = 0,73 ± 0,02 vs 0,60 ± 0,07 (gjennomsnitt ± SD, n = 4, betydningen av forskjell p 0,02).
Diskusjoner
Ved å bruke global genekspresjonsanalyse enorm fremgang har blitt gjort i identifisering av feilregulert gener i prostatakreft i løpet av det siste tiåret. Det som har manglet er en oversettelse av disse gener i klinisk nyttige biomarkører for diagnostisering og lagdeling av sykdommen. Menneskelig prostata var en av de første vev som skal undersøkes for globale endringer i gen-uttrykk i sykdom nesten et tiår siden. Forresten, godkjenning av nye markører av Food and Drug Administration, USA, spesielt protein markører, har gått ned det siste tiåret. Denne nedgangen kan tilskrives tre store problemer i identifisering og utvikling av vev basert protein biomarkører for diagnose og prognose av prostatakreft: 1. Mangel på spesifisitet, dvs. ikke epitel spesifikke (åsted for initiering av sykdommen) 2. Mang av en objektiv, automatisert, kvantitativ analyse av protein uttrykk som kan identifisere robuste, reprdoucible data for mulige biomarkører 3. mangel på kvantitative, proteomikk tilnærminger til for en molekylære grunnlaget for prostatakreft prognose.
Immunohistokjemiske markører kan være ekstremt nyttige ved primær eller bekreftende diagnose til støtte for histopatologi, men på grunn av vanskeligheter i identifikasjon eller validering [18] kun en håndfull av slike markører eksisterer. Det virker også sannsynlig at histopatologisk analyse vil være et bolverk for prostatakreft diagnose i nær til mellom fremtid. Dermed i tillegg til å fortsette søket etter identifisering av ikke-invasive biomarkører som kan bli oppdaget i kroppsvæsker, er det viktig å holde raffinering og forbedre immun vev biomarkører som kan rette diagnosen, bedre prognose og gi nyttig prediktiv lagdeling av prostatakreft. På grunn av økningen i datakraft i løpet av det siste tiåret to teknologier har modnet som kan bidra til å oppnå disse målene. Dette er diskutert nedenfor.
Morfologisk analyse blir rutinemessig brukt for å diagnostisere kreft i prostata, selv om IHC brukes til å bistå morfologisk diagnose, spesielt i tvetydige tilfeller, f.eks i vevsprøver fra nålbiopsier, transuretral reseksjon prøver og metastatiske tumorprøver [19]. En kompliserende sak hindrer oppdagelsen av nye biomarkører for diagnose og sykdom lagdeling av prostata (og andre) kreft (e) fra biopsiprøver, har vært en mangel på objektive, kvantitative metoder for å påvise signifikante endringer fra IHC eksperimenter for biomarkør identifikasjon. Det er imidlertid noen unntak fra denne tilnærmingen. Rubin og kolleger [20] utviklet en kvantitativ tilnærming for å identifisere α-methylacyl-CoA racemase (AMACR). Innledende studier viste nesten ensartet uttrykk for dette proteinet i kreftvev, men i senere analyser uttrykket ble funnet å være mindre, og med forbehold, er dette proteinet brukes som en diagnostisk markør.
For å ta opp spørsmålet om partiskhet og avhengighet av subjektiv vurdering av uttrykk for en gitt biomarkør, har vi utviklet en metode, uten forskningsforventninger, for å kvantifisere protein uttrykk i prostatakreft [8] med en fritt tilgjengelig programvare [21]. I motsetning til konvensjonelle, telling (for eksempel av DAB-farging) for å estimere ekspresjon i vev matriser, tillater vår tilnærming objektiv mengdebestemmelse av det totale DAB-signalet. Selv kvantifisere total DAB-signalet kan ikke være ideelt, ved å standardisere signal måling og eliminere vilkårlig score vi identifisert BTF3, NDRG1, Hint1 og ODC1 protein nivå til å være over-uttrykt i prostata carcinom, quantifiably og reproduserbart, bekrefter gen over-uttrykk observert fra vår foreløpige genet liste. Operasjonelle egenskaper (figur 3 og tabell S1) for BTF3, Hint1 og NDRG1 vise AUC for 0,71 til 0,76; AUC på 0,7 regnes som akseptabelt for en diagnostisk markør [22] indikerer at enkeltvis, disse er tilstrekkelige biomarkører for sykdom. Diagnose kraft kan bli ytterligere forbedret når disse markørene blir analysert for aggregerte diagnostiske effekt (tabell 2). Videre BTF3, NDRG1 og Hint1, i kvantitative samlokalisering studier (figur 5) synes i stand til å skille mellom biokjemisk tilbakefall og ikke-tilbakefall prostatakreft. Biomarkører som er identifisert her, er nye for deres anvendelse i diagnose og også i de kombinasjonene som er beskrevet for biokjemisk tilbakefall av prostatakreft. De mulige mekanismer som disse antatte prostatakarsinom biomarkører kan bidra til kreftutvikling er omtalt nedenfor.
BTF3 er et 27kDa protein som danner et stabilt kompleks med RNA-polymerase IIB og er nødvendig for transkripsjonen initiering [23] og kjent være over-uttrykt i celler fra bukspyttkjertelen ductal carcinoma både
in vitro Kjøpe og
i situ product: [24]. NDRG1 (tidligere kjent som
Cap43
), en stressrespons genet, har vært innblandet i en rekke cellulære prosesser i helse og sykdom. I motsetning til uttrykket av andre biomarkører som presenteres her, har uttrykket av NDRG1 blitt undersøkt i prostata vev, men er gjenstand for uenighet med rapporter at det er økt [25] og redusert [26] i prostatakreft. Det er viktig å merke seg imidlertid at ingen av disse studiene benyttet en objektiv kvantitativ teknikk og derfor uttrykket analyse kan være årsaken til disse avvikene.
Vi har tidligere vist at Wnt signalveien spiller en viktig rolle prostatakreft [8,27]. NDRG1 har også vist seg å påvirke Wnt signal og det er en
prima facie
sak for involvering av NDRG1 i reguleringen av Wnt signal i prostata kreft cellelinjer [28]. NDRG1 genet er også en ETS-familien fusjonspartner i ERG-uttrykke prostatakreft, men i motsetning TMPRSS2-ERG og SCL45A3-ERG fusjoner, utbredt i prostatakreft, er NDRG1-ERG fusjon tenkt å kode for et kimært protein [29]. Ingen informasjon foreligger om NDRG1 protein uttrykk i prostata kreft; om funnet å være smeltet til ERG eller ikke, kan NDRG1 være et nyttig protein biomarkør for prostatakreft.
Hint1 tilhører histidin triaden (HIT) familie og en protein kinase C samspill protein [30]. Ingen informasjon finnes på Hint1 uttrykk eller funksjon i prostata kreft selv om det kan virke som tumor suppressor i mus [31]. I en hepatomcellelinje, inhiberer aktiviteten av Hint1 Wnt /ß-catenin signalering og gentranskripsjon via TCF4 [32]. Vi har vist, tidligere, at det er en undertrykkelse av P-catenin /TCF4 mediert gentranskripsjon av TCF4 transkripsjons målene [8]. Det er fristende å spekulere i at Hint1 kan bidra til å hemme Wnt /ß-catenin signalisering i prostatakreft [8].
L-ornitindekarboksylase 1 (ODC1) er et enzym i polyaminsyntesen vei [33] en nøkkelfaktor i normal celledeling og neoplastisk vekst. ODC1 har blitt identifisert som en genetisk markør for tykktarmskreft [34] og over-uttrykk for ODC1 har vært knyttet til høy risiko neuroblastomer [35] og kolorektal og brystkreft [36]. Disse dataene korrelerer til
in vivo
eksperimenter med ODC1 knock-out mus som er utviklet færre svulster i respons på ulike kreftfremkallende arrangører i tråd med redusert genkopitallet [37].
Våre data tyder på at bruk av en objektiv, kvantitativ tilnærming for å identifisere epitel spesifikke biomarkører i kombinasjon med immunfluorescens kan vise seg nyttig i diagnostisering, lagdeling og prognose av prostata kreft.
Materialer og metoder
prostata vev rekke
Pasient utvalg, sykdomstilstand og konstruksjonsdetaljer vevsblokker er gitt andre steder [8,17]. Kort fortalt ble vevsblokker konstruert ved hjelp av arkivformalinfikserte, parafininnstøpte radikal prostatektomi prøver fra 82 pasienter med patologisk stadium pT3a eller b og preoperativ PSA stadium av 3. 41 case-parene ble matchet for følgende kategorier: patologisk stadium, Gleason grade og preoperativ prostataspesifikt antigen konsentrasjons (PSA). En pasient i hvert par hadde biokjemisk tilbakefall (definert som PSA ≥ 0,2 ng ml-1 innen 2 år etter kirurgi) og den andre forble biokjemisk fri for sykdom (definert som ikke-detekterbar PSA minst 3 år etter operasjonen). Kjernene ble diagnostisert (som godartet eller ikke-maligne og maligne) og preget av en patolog og 5-6μm seksjoner ble kuttet fra vevet arrays på belagt lysbilder. For å eliminere bias, de forskere var blind for flekker, bildebehandling og analyse, med sistnevnte blir automatisert (se nedenfor). Kliniske detaljer av vevsprøver som benyttes er gitt i Tabell S2 og [17]; patologer scoret et flertall av prøver ( 80%) som Gleason grad 4 + 3 og 3 + 4. En utvalgsstørrelse beregning ble gjort for å differensiere mellom over-uttrykk bruker DAB-IHC; prøvestørrelsen for proteinekspresjon ble beregnet før byggingen av vevet matrise (med en α og ß på 0,05 og forventet forskjell på 2,5 folder mellom hjelp av maligne og ikke-maligne prøvene å være 41 pasienter per gruppe).
etikk godkjenning
Etisk godkjenning ble gitt av Joint UCL /UCLH komiteer på etikk menneskelig forskning. Gjennomgangen brett (RB) godkjent bruk av menneskelig vev for prostatakreft forskning, i samsvar med den internasjonale komiteen på Harmonisering av Good Clinical Practice (ICH GCP). For vev rekke bygge prøvene ble anonymisert under byggingen av vev arrays [17] og brukes til ulike immunhistokjemiske studier i et prosjekt godkjent av UCL /UCLH etikkomité. RB fravikes behovet for informert samtykke, fordi prøvene brukes for vev utvalg var arkiverings patologiske prøver.
3,3-diaminobenzidin-pepperrotperoksidase (DAB-HRP) farging
All farging var utføres ved hjelp av Bond automatisert system [8] i henhold til produsentens protokoller. Detaljer om farging prosedyre for IHC bruker DAB og antistoffer (BTF3, Hint1, NDRG1 og ODC1) som brukes er gitt i Methods S1.
immunfluorescens farging bruker 3 antistoffer i prostata vev arrays
Protokollen for immunfluorescens farging var tilsvarende som beskrevet for DAB farging, ovenfor, bortsett fra at BTF3, Hint1 og NDRG1 antistoffer inkuberes samtidig og farget med henholdsvis FITC, Cy5 og Cy3, i henhold til produsentens protokoll. Bilder ble ervervet ved hjelp av en Leica 710 konfokalmikroskop med en EC Plan-Neofluar (40x) objektiv.
Bilde partikkel analyse ved hjelp ImageJ programvare
En objektiv, reproduserbar, automatisert partikkelanalysemetode [8] ble benyttet for å kvantifisere DAB-signalet på ikke-ondartet (godartet) og ondartet vev kjerner menneskelige prostata hjelp ImageJ programvare [21]. Makroer ble skrevet for å utføre følgende sekvens av hendelser for ervervet jpeg-bilder: 1. Åpne bilde 2. Konverter til 16-bits bilde 3. Sett terskelen 4. Analyser partikkel (størrelse 0,5- Infinity, sirkularitet 0,00 til 1,00) 5. Lagre bilde 6. Lagre partikkel informasjon (telle, totalt areal, gjennomsnittlig størrelse og område fraksjon) inn i et excel-regneark (rsb.info.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf). Enhetene er standard ImageJ innstilling (piksler). Standardisering for mengden av vev pr kjernen ble også kvantifisert ved å bruke den inverse funksjonen (EditInvert bilde) i ImageJ med den protokoll som er beskrevet ovenfor. Kvantifisert DAB-signal uttrykt som signal /mengden av vev i hvert vev kjerne. Et flytskjema for DAB signal kvantifisering er gitt i Figur S1. For alle antistoffene som ble testet, ble ekspresjon observert å være i stor grad epitelial og analyse ble også begrenset til den epiteliale uttrykk; innstilte terskel parametre ble valgt etter manuell analyse av vilkårlige kjerner for påfølgende kvantifisering av signalet. En sammenhengende regneark for alle brukbare kjerner (mellom 211 og 260 kjerner) for ikke-ondartet vs ondartet sammenligning, for forskjellige antistoffer ble bygget.
