Abstract
standard kjemoterapi for hjernesvulster er temozolomid (TMZ), men så mange som 50% av hjernesvulster er angivelig TMZ resistente forlate pasienter uten en kjemoterapeutisk alternativ. Vi utførte serie screening av TMZ motstandsdyktig astrocytom-cellelinjer, og som er identifisert forbindelser som er cytotoksisk for disse cellene. Den mest cytotoksiske sammensatt var en analog av tiobarbitursyre som vi refererer til som CC-I. Det er en doseavhengig cytotoksisk effekt av CC-I i TMZ motstandsdyktig astrocytom celler. Celledød ser ut til å skje via apoptose. Etter CC-I eksponering, var det en økning i astrocytom celler i S og G2 /M faser. I
in vivo
atymiske (
nu Twitter /
nu
) naken mus subkutane og intrakranielle tumormodeller, CC-jeg fullstendig hemmet tumorvekst uten lever- eller nyretoksisitet. Molekylær modellering og enzymaktivitetsanalyser indikerer at CC-I selektivt hemmer topoisomerase IIα i likhet med andre stoffer i klassen, men dets cytotoksiske effekter på celler som astrocytom er sterkere enn disse forbindelser. Den cytotoksiske effekten av CC-jeg er sterkere i celler som uttrykker unmethylated O
6-metylguanin metyltransferase (MGMT), men er fortsatt giftig for celler med denaturert MGMT. CC-Jeg kan også forsterke den toksiske effekten av TMZ på astrocytom når de to forbindelsene kombineres. Avslutningsvis har vi identifisert en forbindelse som er effektiv mot astrocytomas inkludert TMZ resistente astrocytomas i både cellekultur og
in vivo
hjernesvulst modeller. Den forbedrede cytotoksisitet av CC-I og sikkerhetsprofilen til denne familien av narkotika kan gi et interessant verktøy for bredere evaluering mot hjernesvulster
Citation. Lee SY, Slagle-Webb B, Rizk E, Patel A, Miller PA, Sung SS, et al. (2014) Karakterisering av en Novel Anti-Cancer Compound for Astrocytomas. PLoS ONE ni (9): e108166. doi: 10,1371 /journal.pone.0108166
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, Spania
mottatt: May 19, 2014; Godkjent: 19 august 2014; Publisert: 25.09.2014
Copyright: © 2014 Lee et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Dette prosjektet er finansiert delvis av en bevilgning med National Cancer Institute of National Institutes of Health i henhold Award Antall R21CA167406 til SL. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle visninger av National Institutes of Health. Denne studien også støttet delvis av Elsa U. Pardee Foundation og Tara Leah Witmer legat. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser: Connor er deleier i NuHope LLC som har en økonomisk interesse i utvikling av forbindelser for behandling hjernesvulster som var utgangspunktet screenet bruker cellelinjer som er valgt for HFE genotype. Lee har en royalty avtale med NuHope LLC. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Hjernesvulst konto for 28% av alle primære hjernen og sentralnervesystemet (CNS) svulster, og 80% av gliomer er ondartet [1]. Blant hjernesvulst, glioblastom (glioblastoma multiforme, klasse IV astrocytom, GBM) er den vanligste maligne gliomer. Dødeligheten av primær ondartet hjernen og CNS svulster er høy; ca 22,620 nye voksne tilfeller av ondartet hjernen og sentralnervesystemet kreft i 2013 [1] og 13.700 dødsfall skjedde i 2012 [2]. Median overlevelse for GBM pasienter var 14,6 måneder og to års overlevelse av pasienter med GBM var 10,4% for stråleterapi alene og bare 26,5% under kombinasjonsbehandling behandling av temozolomid (TMZ) og stråling [3].
dagens standard behandling for GBM er total reseksjon, etterfulgt av radioterapi alene eller i kombinasjon med kjemoterapi TMZ [4], [5]. TMZ er en oral alkyleringsmiddel som brukes i behandling av kreft i hjernen,
f.eks.
, GBM og oligodendrogliom [6]. Det har også blitt brukt til å behandle melanom, prostatakreft, pankreatisk karsinom, sarkom mykt vev, og nyrecellekarsinom [7] – [11]. TMZ inhiberer celle reproduksjon ved å inhibere DNA-replikasjon [12] og har unike egenskaper i forhold til andre alkyleringsmidler. For eksempel er det administreres oralt, krysser blod-hjerne-barrieren, er mindre giftig enn andre alkyleringsmidler, og ikke kjemisk kryssbinde DNA. Imidlertid, selv om TMZ er den gjeldende standard kjemoterapeutiske for behandling av hjernesvulster og andre kreftformer, så mange som 50% av hjernesvulster er resistente overfor TMZ terapi [13], [14]. I tillegg har nesten alle svulster slutt komme tilbake og det store flertallet av tilbakevendende svulster er resistent mot kjemoterapi [15], [16]. Derfor er utviklingen av nye behandlingsalternativer inkludert nye legemidler for behandling resistente hjernesvulster er stort behov for.
I tillegg til de alkylerings agenter som TMZ, topoisomerase-hemmere er en annen gruppe av anti-kreft narkotika under vurdering. Topoisomeraser er viktige kjernefysiske enzymer som regulerer topologien av DNA, vedlikeholde genomisk integritet og er avgjørende for DNA replikasjon, rekombinasjon, transkripsjon og kromosom segregering [17]. Det er seks menneske topoisomerase enzymer [18] og tre av dem, topoisomerase, topoisomerase IIα og topoisomerase IIβ, har betydelig engasjement i kreft og kreft kjemoterapi [19]. Topoisomerase I enzym hakk og rejoins en tråd av dupleks-DNA, og topoisomerase II-enzymet bryter forbigående og stenger dobbeltkjedet DNA [20]. De topoisomerase-hemmere (f.eks topotekan) har blitt brukt hos pasienter med residiverende småcellet lungekreft, tilbakevendende maligne gliomer, tilbakevendende barndommen hjernesvulster [21], [22]. Selv topoisomerase II-hemmere ble studert i glioma celler [23] – [25], de topoisomerase II-hemmere har ikke vært mye brukt hos voksne med primære hjernesvulster grunnet deres dårlige CNS pene. Derfor vil små molekyler med evne til å trenge inn i hjernen være meget ønskelig å behandle gliomas
in vivo
.
Vi har tidligere rapportert at humane neuroblastom-celler og humane astrocytom cellelinjer som uttrykker vanlig forekommende polymorfismer i HFE-genet var resistente mot cellegift og stråling [26]. Hfe genprodukt er involvert i jern homeostasis og de felles HFE polymorfismer, H63D og c282y, fører til en rekke endringer i celler slik som øket endoplasmatiske retikulum stress og økt oksidativt stress [27] – [29]. I denne studien har vi brukt astrocytom cellelinjer som vi identifiserte med HFE genvarianter og TMZ motstand til skjerm forbindelser fra DIVERSet sammensatte bibliotek fra Chembridge (San Diego, California) og funnet en rekke effektive forbindelser med en lignende chemotype. Vi identifiserte en analog av en tiobarbitursyre forbindelse som har sterk toksisk virkning på TMZ-resistente astrocytom celler. Vi rapporterer her karakterisering av ledelsen forbindelsen i
in vitro
cellekultur og
in vivo
hjernesvulst modeller.
Materialer og metoder
Materialer
Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM), føtalt bovint serum (FBS) og andre cellekultur ingredienser ble anskaffet fra Life Technologies (Grand Island, NY). Alle PCR Array ingredienser ble levert fra SABiosciences (Frederick, MD). TMZ ble kjøpt fra Oakwood Products Inc. (West Columbia, SC) og ble oppløst i cellekulturmedium eller 100% DMSO. Ledningen chemotype sammensatte-I (CC-I) ble bestilt fra Chembridge Corporation (San Diego, California). Forbindelsen ble oppløst i DMSO som en stamoppløsning og fortynnet til eksperimentet. Topoisomerase enzymer I og IIα analysesett ble bestilt fra TopoGen Inc. (Port Orange, FL). Merbarone ble oppnådd fra Calbiochem (San Diego, CA). Alle de andre kjemikalier som brukes ble kjøpt fra Sigma Co. (St. Louis, MO).
Menneskelig astrocytom cellekultur, behandling og cytotoksisitet analysen
Menneskelige astrocytom celler (SW1088-klasse III, U87-MG-klasse IV, CCF-STTG1-klasse IV, T98G-klasse IV, LN-18-klasse IV) ble bestilt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Virginia) og vedlikeholdes i DMEM (Gibco av Life Technologies, katalog 11885) supplert med 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 0,29 mg /mL L-glutamin og 10% FBS. Alle forsøkene ble utført ved 37 ° C i 5% CO celledyrkningsbetingelser
2 atmosfære. For cytotoksisitetsanalyser ble forbindelsene testet ved først å fortynne dem fra stamløsning i cellekulturmedier. Forbindelsene ble eksponert til cellene i 3-6 dager. Celle cytotoksisitet ble utført ved MTS [3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium] celleproliferasjonsanalyse (Promega, Madison, WI ) eller sulforhodamin B (SRB) analyse ved slutten av celledyrkningsperioden.
Akutt toksisitet bestemmelse
Akutt toksisitet av CC-i ble bestemt i atymiske nakne mus (stamme 088 eller 490, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) i henhold til NIH narkotika utvikling programmets akutt giftighet prosedyren med mindre endring. For å bestemme akutt toksisitet, totalt seks hunnmus (1-2 måneder gamle) ble injisert intraperitonealt med 3 forskjellige doser (for eksempel 20 mg /kg, 37,5 mg /kg, 50 mg /kg) av CC-I eller kjøretøy kontroll gang i uken og deretter observert i en periode på 7-14 dager. Musene ble observert daglig for endringer i kroppsvekt, synlig og /eller følbar dermal infeksjon, tilstedeværelse av ascites, matforbruk eller ernæringsstatus og grooming eller nedsatt bevegelighet eller død for å fastslå akutt giftighet. Ved 7-14 dager etter behandling, 0,5-1 ml blod ble oppsamlet via en kardial punktering hjerte mens mus var under anestesi (ketamin 100 mg /kg kroppsvekt /xylazin 10 mg /kg kroppsvekt, intraperitonealt) for blod toksisitet undersøkelse . Alle dyrene i studien ble plassert i bakterie-fritt miljø rom, og individuelle boble systemer. Alle dyreforsøk ble godkjent (IACUC # 2011-062) ved Pennsylvania State University Institutional Animal Care og bruk komiteer.
Subkutan tumormodell
For å teste anti-tumor effekt av CC- jeg mot humant astrocytom tumor, en-to måneder gammel kvinnelig immunodeficient (
nu Twitter /
nu
) hårløse mus (stamme 088, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) ble implantert 10 × 10
6 celler per mus subkutant med TMZ sensitive SW1088 eller TMZ resistente CCF-STTG1 astrocytom celler. Når tumoren nådde ca. 32-100 mm
3 i størrelse, mus (n = 10 eller 11) ble tilfeldig delt inn i to grupper. CC-I ble injisert intraperitonealt i en konsentrasjon på 25 mg /kg kroppsvekt i et volum på 200-300 pl i 12,5% etanol en gang i uken i 7 uker. Kontrollgruppen ble gitt fosfat-bufret saltvann (PBS) i det samme volum og regime. Tumorstørrelse ble målt ukentlig med en Vernier caliper for 7 uker med en etterforsker blindet for forsøksbetingelser. Tumor volum (V) ble beregnet i henhold til formelen V =
en
2/2 × b, der
en
og
b
er små og store akser av tumoren brennpunkter, henholdsvis. Den tumorstørrelse, helse, og overlevelse av musene var synlig overvåket daglig, og tumorstørrelsen målt ukentlig. Vi gjorde ikke ta bilder av svulster. Vi vil vurdere å ta bilder for kommende eksperimenter. For å overvåke toksisitet av forbindelsene ble dyrene avlivet med ketamin /xylazin 100/10 mg /kg kroppsvekt intraperitonealt, og målt lever og nyretoksisitet ved slutten av forsøket.
intrakranial xenograft modell
Dame immunodeficient nakne mus (stamme 088, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) som veide 20-30 g ble bedøvd ved intraperitoneal injeksjon av ketamin-xylazin 100 mg /kg-10 mg /kg kroppsvekt. Menneske U87-MG og CCF-STTG1 astrocytom cellelinjer ble implantert å skape hjernesvulst xenograft. I korte trekk, ble et innlegg holdes i horisontal stilling og 1 million astrocytom celler i et volum på 10 ul ble injisert sakte inn i caudatus putamen region ved hjelp av et lite dyr stereotaktisk apparatur. De stereotaktiske koordinater som brukes til de xenotransplantater er P = 0,5, L = 1,7, H = 3,8 mm. De astrocytom Cellene ble injisert sakte i 10 minutter for å unngå økning i det intrakraniale trykk eller oppadgående cellesuspensjon lekkasje gjennom sporet av nålen. Dyrene ble gitt buprenorfin (0,05-0,1 mg /kg kroppsvekt subkutant) for smerter under og etter operasjonen. Dette ble gitt hver 8-12 timer i 24-48 timer etter kirurgi. Dyrene ble utsatt for T1 vektet magnetisk resonans imaging (MRI) to ganger; en gang for å fastslå at en svulst er etablert i hjernen (~3 uker injeksjon av astrocytom-celler) og på slutten av eksperimentet. Dyrene ble overvåket daglig, og kroppsvekt ble målt ukentlig. Når en svulst ble observert, mus (n = 12 eller 15) ble tilfeldig delt inn i to grupper. CC-I (25 mg /kg kroppsvekt) eller PBS ble injisert en gang i uken intraperitonalt. Den totale overlevelsen av mus ble utført ved en Kaplan-Meier-overlevelseskurve. Dyrene ble avlivet etter akseptabel metode for aktiv dødshjelp som definert av American Veterinary Medical Association (AVMA) Retningslinjer for Eutanasi – Godkjent Eutanasi Metoder 2013. Når dyrene får en kropp tilstand score på mindre enn to dyrene ble avlivet med ketamin /xylazin 100/10 mg /kg kroppsvekt intraperitonealt, så vel som en sekundær metode for cervikal dislokasjon. Ved avslutning av forsøket ble plasma innsamlet for analyse av lever og nyre toksisitet etter avlives med ketamin /xylazin 100/10 mg /kg kroppsvekt intraperitonealt.
T1 veide MRI Images
T1 vektet MRI-kontrast ble anvendt for å visualisere svulstvekst ved hjelp av 7T MRI-system (Bruker, Biospec GmbH, Ettlingen, Tyskland). Imaging parametere for T1 skanningen er TR /TE = 540 ms /11 ms, 8 gjennomsnitt, 192 × 192, 0,5 mm skive tykkelse og 3,2 cm
2 FOV. Musene ble bedøvet ved inhalasjon av 1-2% isofluran og plassert i en posisjon med hjerne plassert i sentrum av spolen. Intrakraniell tumorvolumet ble beregnet ved hjelp av gadolinium forbedret T1 veide Multispiral aksial rask spin ekko bilder. Fra disse bildene størrelsen på svulsten ble beregnet ved hjelp av Region-of-interesse verktøyet tilgjengelig på Paravision programvare (Bruker Biospec, Ettlingen, Tyskland).
Lever og nyretoksisitet
Leveren og nyretoksisitet (total bilirubin, blod urea nitrogen (BUN), kreatin, aspartataminotransferase (AST), alaninaminotransferase (ALAT) og alkalisk fosfatase) ble vurdert for både subkutan tumormodell og intrakranielle xenograft modell ved hjelp av en automatisert kjemi analysator (Roche Cobase MIRA) og kits produsert av Thermo Electron (Louisville, CO). Blodet ble innhentet fra kontroll eller CC-I injisert mus med astrocytom celler ved avslutning av forsøket.
apoptose analysen
For apoptose analysen, 3 × 10
6 av CCF-STTG1 celler ble dyrket i 48 timer med flere konsentrasjoner (~36 uM) for CC-i eller actinomycin D (~80 nM) som en positiv kontroll. Cellene ble høstet etter trypsin-EDTA-eksponering og vasket i kald PBS. Deretter ble 100 ul av cellesuspensjonen (~ 1 x 10
6-celler) ble inkubert med 1 pl 100 pg /ml rød-fluorescerende propidiumjodid nukleinsyrebindende fargestoff og 5 ul Annexin V-FITC (Molecular Probes, Carlsbad, CA) i 15 minutter ved romtemperatur i mørke. Cellene ble analysert ved flowcytometri (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) av utslipp på 530 nm (f.eks FL1) og 575 nm (f.eks FL3). Cellene som er bundet av Annexin V illustrere tidlig apoptotiske celler. Celler som er reaktive for både Annexin V og propidiumjodid- er nekrotiske celler.
genuttrykk profilering
Vi brukte apoptose PCR Array (SABiosciences, Frederick, MD) for å finne ut hvilke gener som er endret ved CC -Jeg i TMZ motstandsdyktig CCF-STTG1 celler. PCR Array ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. I korte trekk, ble total RNA ekstrahert fra kjøretøy (0,1% DMSO) behandlet eller CC-jeg behandlet CCF-STTG1 cellelinjer ved hjelp av qPCR-Grade RNA Isolation kit. Ett ug RNA ble anvendt for første tråd cDNA-syntese ved revers transkripsjon med MMLV revers transkriptase. Deretter real-time PCR ble utført med fortynnet cDNA og master mix med ROX filter. For signaldeteksjon, ble ABI Prism 7900 Sequence Detector System programmert med en innledende steriliseringstrinnet på 2 minutter ved 50 ° C, etterfulgt av 10 minutters denaturering ved 95 ° C og deretter 40 sykluser av 15 sekunder ved 95 ° C, 1 minutt ved 60 ° C og 30 s ved 72 ° C. Hver reaksjon prøve ble utført in triplo. PCR-Array-data ble beregnet ved ΔΔcycle terskel (ΔΔ
Ct
) -metoden, deretter normalisert mot flere husholdningsgener og uttrykt som midlere fold endringer i CC-I behandlede prøvene i forhold til vehikkelbehandlede kontrollprøver.
cellesyklusanalyse
for cellesyklusanalyse, ble CCF-STTG1-celler dyrket over natten ved en tetthet på 2-5 x 10
6 celler pr kolbe. Den følgende dag ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av CC-I i frisk cellekulturmedium. Etter 24-48 timer senere ble de adherente cellene høstet og split (1 x 10
6 celler pr tube) for vasking med Hanks buffer, deretter fiksert i iskald 70% etanol over natten ved -20 ° C. For DNA-farging dag ble cellene inkubert med propidiumjodid (100 ug /ml) og RNase A (20 ug /ml) i 15 min ved 4 ° C (beskytte mot lys). Prøvene ble analysert ved hjelp av BD FACS Calibur flowcytometrisystemer Analyzer.
Topoisomerase avslapping og decatenation analysen
DNA avslapping og kinetoplast DNA (kDNA) decatenation analysen ble utført ved hjelp av topoisomerase I eller II narkotika screening kit eller Topopoisomerase II analysesett (TopoGEN, Inc., Port Orange, FL) i henhold til produsentens instruksjoner [30]. Topoisomerase IIα decatenates kDNA som består av høyt catenated nettverk av sirkulært DNA i en ATP-avhengig reaksjon for å gi individuelle minicircles av DNA. I korte trekk, for topoisomerase IIα mediert kDNA decatenation analyse inneholder 20 ul reaksjonsblanding følgende komponenter; 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl
2, 0,5 mM ditiotreitol, 30 ug /ml bovint serumalbumin, 2 mM ATP, 260 ng av kDNA flere konsentrasjoner av forbindelsene, og 4 U av menneskelig topoisomerase IIα. Den endelige konsentrasjon på 0,5% (v /v) DMSO ble brukt fordi denne konsentrasjonen ikke påvirker aktiviteten av topoisomerase IIα. Inkubasjonen av analyseblandingen ble utført ved 37 ° C i 30 minutter og avsluttet ved tilsetning av 4 ul stopp lasting fargestoff. De kDNA decatenation produktene fra Reaksjonsblandingen ble oppløst på en 1% agarosegel ved 100 V i 40 minutter, deretter beiset med 0,5 mikrogram /ml ethidium-bromid i TAE-buffer (4 mM Tris-base /iseddik [0,11% (v /v)] /2 mM Na
2EDTA).
molekylær modellering studie
de molekylære modelleringsstudier var basert på røntgenkrystallstrukturen av menneskelig topoisomerase IIα bundet til L-peptid på 1,50 en oppløsning (PDB identifikasjonskode: 2q5a) [31]. Stillingen av L-peptidet ble anvendt for å spesifisere dimensjonene av CC-I bindingssete for forankrings studien. Docking mellom topoisomerase IIα protein og CC-I ble utført ved hjelp av GLIDE program (Grid Basert Ligand Docking fra Energetics, fra Schrödinger, L.L.C.) [32], [33]. Den Jørgensen OPLS-2005 kraftfelt ble ansatt i GLIDE programmet. Den optimale bindings geometri for hver modell ble oppnådd med GLIDE, som er avhengig av Monte Carlo-sampling teknikker kombinert med energi minimalisering. GLIDE SP (Standard Precision-modus) ble brukt til å forankre det sammensatte CC-I fulgt av GLIDE XP (Extra Precision-modus). Schrödingers LigPrep ble brukt til å generere 3D conformations av CC-I
Statistical Analysis
Alle data ble utsatt for statistisk analyse av studenten
t
-test når man sammenligner to grupper. Vi brukte enveis ANOVA etterfulgt av Tukey-Kramer test for mer enn to gruppesammenligninger for å avgjøre om forskjellene er signifikante. For sammenligninger av tidsforløpet eller konsentrasjon data utførte vi gjentok tiltak toveis ANOVA etterfulgt av Tukey-Kramer test. Forskjeller mellom virkemidler anses ikke statistisk signifikant når
p
verdien er mindre enn 0,05. LC
50 (50% letal konsentrasjon) av forbindelsene ble bestemt ved anvendelse av statistiske software (GraphPad Prism 6) som en generell indikator for en kjemisk toksisitet. I
in vivo
hjernesvulst modell, ble tumorvolumet data oppsummeres som middelverdier med standardfeil. Musene overlevelse ble sammenlignet mellom grupper med Kaplan-Meier overlevelsesanalyse med logrank test.
Resultater
Identifisering av en cytotoksisk forbindelse mot TMZ motstandsdyktig astrocytom celler
Vår screening tilnærming identifiserte en tiobarbitursyre analog og gitt identifikasjonstagg av chemotype forbindelse-i (CC-i). Strukturen av CC-I er vist i Figur 1A. CC-jeg var cytotoksiske til både TMZ-resistente menneskelige astrocytom cellelinjer CCF-STTG1 og til TMZ-sensitive SW1088 (figur 1B). LC
50 CC-I til SW1088, U87-MG og CCF-STTG1 cellelinjer er 13,6 uM, uM 23,6 og 25,4 um respektivt.
(A) Strukturen av CC-I. (B) Cytotoksisitet av CC-I i
in vitro
. Humane astrocytom-cellelinjer ble dyrket med forskjellige doser av CC-I i 3 dager og deretter ble cytotoksisitet bestemt ved SRB-analysen. LC
50 av CC-I til SW1088 cellelinjer (13,6 mm) er vesentlig forskjellige med LC
50 av CC-I til U87-MG og CCF-STTG1 cellelinjer (23,6 mikrometer og 25,4 mm) ( p. 0,001)
Akutt toksisitet av CC-i i nakne mus
injeksjoner av CC-jeg en gang i uken på 50 eller 75 mg /kg kroppsvekt var dødelig innen 7 dager. En gang i uken injeksjon på 35 mg /kg kroppsvekt ble tolerert. Derfor brukte vi ca. 70% av den tolererte dosen (25 mg /kg kroppsvekt) av CC-I-konsentrasjon for den
in vivo
tumormodell studien.
Anti-tumoreffekten til CC -Jeg i det subkutane musetumormodell
for å etablere anti-tumor effekt av CC-i på astrocytom celler, vi brukte immunodeficient naken mus subkutan tumor modell injisert med enten TMZ sensitive SW1088 eller TMZ motstandsdyktig CCF-STTG1 cellelinjer. Den mus med svulster fra den CCF-STTG1 cellelinjen viste ingen tegn på tumorprogresjon følgende CC-I injeksjoner selv etter at injeksjoner avsluttet (figur 2A) mens det i den ubehandlede kontrollgruppen tumorvolumet økt dramatisk i løpet av 7 uker (p 0,0001) . Svulstene hos mus fra SW1088 cellelinjen også mislyktes i å utvikle seg under injeksjonen perioden, men svulsten kommet når CC-I injeksjoner ble avviklet (figur 2A). Vi gjorde ikke ta bilder av svulster. Vi vil vurdere å ta bilder for kommende eksperimenter. Kroppsvekten for kontroll eller CC-I behandlede mus ikke reduseres under forløpet av studien (figur 2B).
(A) Mus ble implantert med ti millioner celler med den SW1088 eller CCF-STTG1 celler. Starttumorstørrelse for CCF-STTG1 celler varierte 80-100 mm
3. De SW1088 cellene vokste saktere så CC-I behandlingen ble startet da svulstene nådd 30 mm
3. CC-I ble injisert intraperitonealt i en konsentrasjon på 25 mg /kg kroppsvekt en gang i uken i 7 uker (n = 7~10). Kontrollgruppen ble gitt PBS i det samme volum og behandling (n = 3-8). Svulsten sakte reoccurred i TMZ-sensitive SW1088 astrocytom injisert nakne mus, men ikke oppstår på nytt i TMZ motstandsdyktig CCF-STTG1 injisert hårløse mus når CC-jeg ble avviklet (utover 7 uker). CC-I inhiberte tumorvekst og var ikke dødelig i noen av behandlingsgruppene. Noen feil barer er for små til å være synlige. (B) Gjennomsnittlig kroppsvekt av mus er vist i gram. Noen feil barer er for små til å være synlige.
Anti-tumor effekt av CC-I i intrakranielle hjernesvulst modell
Etter å etablere
in vivo
effekt og sikkerhet av CC-jeg mot både TMZ sensitive og resistente cellelinjer i det subkutane hjernesvulst modell, vi undersøkte intrakranielle xenograft hjernesvulst modell. U87-MG eller CCF-STTG1 astrocytom-celler ble injisert i musehjerne og dannet tumorer (bekreftet ved MRI) ~3 uker etter implantasjon (figur 3A). Ingen av de ubehandlede kontroll mus overlevde mer enn 30 dager, og median overlevelse var 20 dager. Hvis musene ble behandlet med CC-I, men 64% (7/11) av det U87-MG tumorbærende mus var fremdeles i live 60 dager og 89% (8/9) av CCF-STTG1 tumorbærende musene fortsatt lever 60 dager (p 0,0001) (figur 3B) og ingen svulst var synlig på MR (figur 3A). Fem mus i U87-MG tumor gruppe og seks i den CCF-STTG1 tumor gruppen som fikk CC-I injeksjoner var i live 200 dager etter tumor injeksjon (137 dager etter den siste CC-I injeksjon). Som med den systemiske tumormodell, var det ingen indikasjon på lever- eller nyretoksisitet fra CC-I i intrakraniale xenograft mus (figur 3C). Kroppsvekten til dyrene ikke avta i de dyrene som fikk CC-I (figur 3D).
(A) Representative MRI-bilder tatt med T1-vektede MR-kontrast (7T MR-avbildningssystem) etter intrakranial tumordannelse (ett til tre uker etter implantasjon av astrocytom celler) eller etter tumordannelse, etterfulgt av injeksjon av CC-i (25 mg /kg kroppsvekt) i 7 uker. CC-jeg fullstendig hemmet tumorvekst i begge astrocytom cellelinjer. (B) Kaplan-Meier overlevelses graf av intrakranielle hjernesvulst mus etter administrering av CC-I. CC-I forlenger overlevelsen av mus i forhold til ubehandlede mus (n = 9 eller 11) (P 0,0001). Ingen av musene som fikk PBS (kontroll) overlevde etter 30 dager, og median overlevelse av alle disse dyrene var 20 dager (n = 3 eller 4). (C) Lever og nyre toksisitet av CC-I. Den lever og nyre toksisitet (total bilirubin, blod urea nitrogen (BUN), kreatin, aspartataminotransferase (AST), alaninaminotransferase (ALAT) og alkalisk fosfatase) ble bestemt ved hjelp av en automatisert kjemi analysator maskin (Roche Cobase MIRA) og kits produsert av Thermo Electron. Disse data indikerer ingen lever- eller nyretoksisitet av CC-I i nakne mus. Toksisitetsdata vises som middel ± SEM. (D) Mean kroppsvekt av mus i gram.
apoptose av CC-I i TMZ motstandsdyktig astrocytom celler
Neste vi spurte om celledød ved CC-I til TMZ motstandsdyktig CCF-STTG1 astrocytom celler blir mediert gjennom en apoptotisk reaksjonsvei. CC-I-indusert apoptose i en doseavhengig måte i CCF-STTG1 cellelinjer (figur 4A). Mengden av CCF-STTG1 apoptotisk celledød ved 36 mikrometer var sammenlignbar med den positive kontrollen apoptose indus, actinomycin D. Det er dokumentert av nekrotisk celledød i CCF-STTG1 etter eksponering for CC-I, men færre celler ble merket og betydning var ikke oppnås inntil to ganger den konsentrasjon ved hvilken apoptose først ble observert (figur 4B).
Celledød ble overvåket med apoptotiske og nekrotiske cellemarkører etter 48 timer CC-i eksponering i CCF-STTG1 celler. Celledød ble bestemt med det rekombinante annexin V konjugert til fluorescein, etterfulgt av strømningscytometrisk analyse. Apoptotisk celledød er vist i panel A. Panel B er nekrotisk celledød. Actinomycin D ble anvendt som en positiv kontroll for å indusere apoptotisk celledød. Prosentandelen av apoptotiske celler etter CC-I behandlingen ble øket på en doseavhengig måte i CCF-STTG1 celler. Det var ikke en markert doseavhengig økning i nekrotisk celledød i CCF-STTG1 celler til høyere konsentrasjon. Data vurderes ved hjelp av Student
t
test og vises som middel ± SEM. Noen feil barer er for små til å være synlige. Symbolene angir en signifikant forskjell sammenlignet med kontrollen. (*** P 0,001)
apoptose genet array i CC-jeg behandlet TMZ motstandsdyktig CCF-STTG1 celler
For å finne ut hvilke apoptotiske sti ble aktivert ved CC-I behandling. utførte vi genuttrykk profiler ved hjelp av målrettede arrays for apoptose. The Human Apoptose Microarray avdekket at tumornekrosefaktor (TNF) pathway gener har de største endringene i genuttrykk i CC-jeg behandlet celler i forhold til bilens behandlede celler. CC-I (36 mM) øket TNF-superfamilien elementet 1, 2, 5, 6, og 9 så vel som TNF-reseptor superfamilien 5, 9, 10a 30-700 ganger. Blant caspase pathway gener, bare caspase 10 og caspase 14 ble indusert. Fold forholdet mellom endrede gener er oppsummert i tabell 1.
Effekt av CC-jeg på cellesyklus av TMZ motstandsdyktig astrocytom celler
For å bedre forstå den cytotoksiske effekten av CC -Jeg utførte vi en cellesyklusanalyse i CCF-STTG1 celler etter CC-i behandling. CC-I behandling av CCF-STTG1-celler resulterte i en betydelig reduksjon i G0 /G1 fase, og en økning i S og G2 /M fase sammenlignet med ubehandlede celler (figur 5A og amp; B).
de CCF-STTG1-celler ble behandlet med 18 eller 36 uM av CC-i i 24 eller 48 timer. Cellene ble farget med propidiumjodid og deretter analysert med hensyn til cellesyklusfordeling ved hjelp av et FACScan analysator. CC-I behandling økt betydelig S og G2 /M cellepopulasjon, men redusert i G0 /G1 fase. Symbolene angir en signifikant forskjell sammenlignet med kontrollen. (* P 0,05, ** p 0,01; *** p 0,001).
Topoisomerase IIα hemming av CC-I
Vi avgjort om CC-jeg kan binde human topoisomerase IIα i en molekylær modellering studie. De molekylære modelleringsdata mellom human topoisomerase IIα og CC-I foreslo at CC-I passer inn i hulrommet i humane topoisomerase IIα hvor det kan fungere som en inhibitor (figur 6A). Derfor, utførte vi DNA avslapping og kDNA decatenation analyser for å bestemme evnen av CC-I til å inhibere topoisomerase IIα enzymaktivitet. CC-I hemmet topoisomerase IIα aktivitet på en doseavhengig måte. Ved konsentrasjoner større enn 23 mikrometer, CC-I hemmet topoisomerase IIα katalysert kDNA decatenation (figur 6B). Etoposid (VP16), en kjent topoisomerase II-giften, hemmet topoisomerase IIα ved 1 mM, men ikke i 0,1 mM konsentrasjon (figur 6B). Deretter fant vi ut om CC-I er en spesifikk hemmer av topoisomerase IIα bruke en supercoil DNA avslapping analysen. CC-jeg ikke forbedre topoisomerase I-mediert avslapping av supercoil pHOT1 DNA (figur 6C). Kamptotecin, en topoisomerase I-inhibitor, ble anvendt som en positiv kontroll for analysen og viste den forventede inhibering av topoisomerase I-DNA-mediert avslapping. I motsetning til dette, CC-I oppviste en sterk hemmende virkning på topoisomerase IIα-mediert relaksasjon av supercoil pHOT1 DNA (figur 6D). Den effektive konsentrasjon av CC-I på topoisomerase IIα mediert DNA avslapping ble først sett på 11 mikrometer.
(A) Oppbygging av CC-I dokket inn topoisomerase IIα (PDB kode 1ZXM). Topoisomerase er vist som den brunfarget bånd med rester på bindingssetet.
