Abstract
Formål
Heparin-bindende epidermal vekstfaktor-lignende vekstfaktor (HB-EGF) er et medlem av den epidermale vekstfaktor-familie. Den membranbundne proHB-EGF er kjent for å være en forløper for den løselige formen av HB-EGF (SHB-EGF), som fremmer celle-proliferasjon og overlevelse. Mens funksjonene til SHB-EGF har blitt grundig studert, det er ennå ikke fullt ut forstått hvis proHB-EGF er også involvert i cellulære signal hendelser. I denne studien, benyttet vi anti-HB-EGF-monoklonale antistoffer Y-142 og Y-073, som har differensial spesifisiteter mot proHB-EGF, for å belyse proHB-EGF-funksjoner i kreftceller.
Experimental design
De biologiske aktiviteter proHB-EGF ble vurdert i celleproliferasjon, caspaseaktivering, og juxtacrine aktivitetsanalyser ved hjelp av en 3D spheroid kultur NUGC-3 celler.
Resultater
Y-142 og Y-073 utstilt lignende bindende og nøytraliserende aktiviteter for SHB-EGF. Men bare Y-142 bundet til proHB-EGF. Vi kunne påvise funksjonen av endogent uttrykt proHB-EGF i et 3D sfæroide kultur. Blokkering proHB-EGF med Y-142 redusert sfæroide formasjon, undertrykkes celleproliferasjon, og økt caspaseaktivering i 3D-sfæroid kultur av NUGC-3-celler.
Konklusjoner
Våre resultater viser at proHB- EGF fungerer som en celleproliferasjon og celleoverlevelse faktor i cancerceller. Resultatene tyder på at proHB-EGF kan spille en viktig rolle i tumorprogresjon
Citation. Sato S, Kamada H, Watanabe T, Tsuji jeg, Vifte J (2013) Identifikasjon av kreftcelle spredning og overlevelse funksjoner av proHB-EGF ved å bruke en anti-HB-EGF antistoff. PLoS ONE 8 (1): e54509. doi: 10,1371 /journal.pone.0054509
Redaktør: Emilio Hirsch, Universitetet i Torino, Italia
mottatt: 29. mars 2012; Akseptert: 12. desember 2012; Publisert: 21 januar 2013
Copyright: © 2013 Sato et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser:. Alle forfatterne er /var ansatte i Takeda Pharmaceutical Company Limited eller Takeda San Francisco, Inc. og ble betalt som sådan. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
HB-EGF er et medlem av epidermal vekstfaktor (EGF) familie av vekstfaktorer [1]. Det er syntetisert som et transmembranprotein, proHB-EGF, sammensatt av et signalpeptid; en pro-peptid; og heparin-bindende EGF-lignende, juxtamembrane, transmembrane og cytoplasmatiske domener [2]. I løpet av cellulært stress, gjennomgår proHB-EGF ectodomain utstøtingen som frigjør oppløselig form, SHB-EGF, og den intracellulære C-terminale fragment (CTF) [3], [4]. SHB-EGF utøver et potent mitogen og /eller kjemotaktisk aktivitet gjennom aktivering av dets reseptorer EGFR og ErbB4 [1], [5], [6]. CTF translocates inn i kjernen og induserer genekspresjon av cyclinA og cyclinD2 ved å undertrykke funksjonen av PLZF og Bcl6, henholdsvis [7], [8].
I tillegg til å være en forløper av SHB-EGF og CTF, har proHB-EGF unike egenskaper som difteri-toksin-reseptoren [9], en celle adhesjonsmolekyl [10], og en juxtacrine faktor [11]. Difteri-toksin-binding til EGF-proHB forsterkes ved CD9 eller heparin-lignende molekyler [12], [13], og den bindende forårsaker hemming av proteinsyntese ved internalisering av difteri-toksin-proHB-EGF-komplekset. Som et celleadhesjonsmolekyl, bidrar proHB-EGF til blastocyst adhesjon til livmoren under implantering i mus [10]. Den juxtacrine aktivitet av proHB-EGF ble først nevnt i en coculture system, hvor proHB-EGF-overekspresjon celler ble sådd på EGFR-overuttrykkende celler [11]. For å isolere og vurdere signale initiert av proHB-EGF adskilt fra den igangsatt av SHB-EGF, ble proHB-EGF-overekspresjon cellene fiksert med formalin, for derved å hindre utslipp av SHB-EGF. I dette coculture systemet, proHB-EGF-overuttrykkende celler fremmes DNA-syntese og hindret apoptose i EGFR-overuttrykkende celler i noen av de studier hvor det ble brukt [11], [14], [15]. I motsetning til dette, når de intakte proHB-EGF-overekspresjon celler ikke ble fiksert med formalin, inhiberte de DNA-syntese og fremmet apoptose i EGFR-overuttrykkende celler i en modifisert tilstand coculture [16]. Funksjonene til proHB-EGF ble også vurdert ved å analysere virkningene av proHB-EGF overekspresjon på autonome cellulære hendelser. Den proHB-EGF overekspresjon undertrykt eller fremmet celleproliferasjon i forskjellige cellelinjer [17], [18]. Dermed har roller proHB-EGF ikke vært konsekvent eller tydelig klarlagt.
I denne studien har vi vurdert funksjonene proHB-EGF i kreftceller ved å bruke 2 anti-HB-EGF monoklonale antistoffer som har forskjellige særegenheter mot proHB-EGF. Våre funn tyder på at proHB-EGF spiller roller i spredning og overlevelse av kreftceller.
Materialer og metoder
Material
Den anti-HB-EGF monoklonale antistoffer Y- 073 og Y-142 og SHB-EGF ble tidligere generert [19]. I korte trekk, ble Y-142 fremstilles ved å immunisere BALB /c-mus (Japan Clea) med subkutane injeksjoner av albuskjell hemocyanin-konjugert SHB-EGF og abdominal injeksjoner av 293F-celler (Invitrogen) forbigående transfektert med en proHB-EGF ekspresjonsplasmid. Y-073 ble oppnådd ved immunisering av BALB /c-mus med subkutane injeksjoner av albuskjell hemocyanin-konjugert SHB-EGF. Begge antistoffer ble renset fra deres hybridomkultursupernatant med rProteinA Sepharose (GE Healthcare). SHB-EGF ble fremstilt fra kultursupernatanten fra 293F-celler (Invitrogen) transfektert med et SHB-EGF ekspresjonsplasmid [19]. Vi har også brukt de følgende reagenser: mus-IgG-kontroll og pepperrot peroksidase-merket (HRP-merket) anti-mus-IgG-antistoff fra Jackson Immunoresearch Laboratories; Alexa488-merket anti-muse-IgG-antistoff, HRP-merket anti-geite-IgG-antistoff, og HRP-merket anti-kanin-IgG-antistoff fra Invitrogen; anti-amfiregulin (anti-ARG) monoklonalt antistoff, anti-HB-EGF polyklonalt antistoff, anti-EGFR-polyklonalt antistoff, og biotinylert anti-EGFR-polyklonalt antistoff fra R anti-β-actin antistoff fra Cell Signaling Technology; erlotinib fra Selleck Chemicals; biotinylert anti-fosfotyrosin antistoff fra Millipore; sulfotagged streptavidin fra Meso Scale Discovery; og forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) fra Wako.
Cell Culture
NUGC-tre magekreftceller (japansk Innsamling av forsknings Bioressurser), 5637 blærekreftceller (American Type Culture samling), og BxPC-3 kreft i bukspyttkjertelen celler (American Type Culture Collection) ble holdt i RPMI 1640 medium supplert med 10% serum. EFO-27 eggstokkreft celler (DMSZ) ble opprettholdt i RPMI 1640 medium med 20% serum. Cellene ble holdt i 2D-cellekulturplater, og for 3D sfæroide kultur eksperimenter, ble de overført til et Celltight spheroid kulturplate (Sumitomo Bakelite).
flowcytometri
Cellene ble løsnet fra en kulturskål med celledissosiasjon buffer (Invitrogen) og inkubert med anti-HB-EGF monoklonalt antistoff eller anti-ARG-monoklonalt antistoff i 1 time ved 4 ° C. Etter vasking med PBS som inneholdt 1% bovint serumalbumin (BSA), ble cellene inkubert med Alexa488-merket sekundært antistoff i 1 time ved 4 ° C. Protein-ekspresjon ble målt ved anvendelse av en FACS CantoII instrument (Becton Dickinson), og dataene ble deretter analysert med FlowJo programvare (Tre stjerne). For å generere en positiv kontroll for binding av anti-ARG-antistoff, ble EFO-27-celler transfektert med et ARG ekspresjonsplasmid ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
SHB-EGF-bindingsanalysen
bindingsaktiviteten av anti-HB-EGF monoklonalt antistoff til SHB-EGF ble detektert som tidligere beskrevet [19]. SHB-EGF eller BSA ble immobilisert på 1 mg /ml på en 96-brønns plate over natten ved 4 ° C. Etter at ikke-spesifikk binding ble blokkert med PBS inneholdende 1% BSA, ble anti-HB-EGF-monoklonalt antistoff ble inkubert ved forskjellige konsentrasjoner i platen. HRP-merket anti-muse-IgG-antistoff ble deretter reagert i 1 time ved romtemperatur. TMB peroksidase EIA Substrat (Bio-Rad) ble deretter tilsatt i hver brønn. Antistoffbinding til SHB-EGF ble påvist ved å måle absorbansen ved 450 nm ved å bruke et SPECTRA MAX plateleser (Molecular Devices).
EGFR Fosforylering Assay
Den inhiberende aktivitet av anti-HB- EGF monoklonalt antistoff mot SHB-EGF-indusert fosforylering EGFR ble detektert som tidligere beskrevet [19]. NUGC-3-celler ble sådd ut i 1 x 10
4 celler /brønn i RPMI 1640 medium med 1% serum. Etter en 1-d inkubasjonsperioden ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av anti-HB-EGF-antistoff og 10 nM SHB-EGF i 15 min ved 37 ° C. Cellelysater ble fremstilt med cellelyseringsbuffer (Cell Signaling Technology) inneholdende en protease inhibitor cocktail (Roche Applied Science) og en fosfatase-inhibitor cocktail (Sigma Aldrich) og ble anvendt for analyse med en pEGFR deteksjon ELISA-sett (R Y-142, svart histogram; Y-073, grå histogram. B. Expression of amfiregulin (ARG) i kreftcellelinjer. Celler ble inkubert med anti-ARG-antistoff, fulgt av inkubering med Alexa488-merket anti-muse-IgG-antistoff. Den bindende aktivitet av anti-ARG-antistoffet ble bekreftet ved bruk av Efo-27-celler transfektert med et ARG ekspresjonsplasmid. Ingen IgG, svart linje; anti-ARG antistoff, grå histogram.
EGFR-ligander inkluderer HB-EGF, amfiregulin (ARG), tumor vekstfaktor α, neuregulin β1, EGF, og betacellulin, og vår tidligere studie viste at Y- 142 recognizesARG i tillegg til HB-EGF [21]. Begge ligander er uttrykt som membranbundne former på celleoverflaten [22]. Derfor, for å bekrefte at den Y-142-binding til cellene ble tilskrives dens gjenkjennelse av proHB-EGF, og ikke for å ARG, ARG ble undersøkt ekspresjon ved strømningscytometri, og ingen ARG ekspresjon ble påvist (Fig. 1B). For å utelukke muligheten for at anti-ARG antistoff ikke hadde bindingsaktivitet for ARG, brukte vi tilført ARG som en positiv kontroll. Dette resultatet bekreftet videre at bindingen av Y-142 til de testede cancercellelinjene var tilskrives dens gjenkjennelse av proHB-EGF. Vi har også testet EGFR ligand spesifisitet av Y-073, og Y-073 spesifikt bundet til HB-EGF (data ikke vist).
For ytterligere å undersøke egenskapene til antistoffer, testet vi deres bindingsaktivitet til SHB -EGF ved hjelp av ELISA. Interessant, Y-142 og Y-073 bundet til SHB-EGF med tilsvar EC
50 verdier på 56 pM og 110 pM, henholdsvis, og ingen av dem er bundet til den negative kontroll BSA (Fig. 2A). I tillegg testet vi deres nøytraliserende aktivitet på SHB-EGF-indusert EGFR fosforylering. Den NUGC-3 magecancercellelinje ble benyttet for å detektere EGFR fosforylering på grunn av sin høye EGFR-ekspresjon. Som vist på fig. 2B, begge antistoffene inhiberte fosforylering av EGFR i en konsentrasjonsavhengig måte med lignende IC
50-verdier (Y-142 = 3,8 nM; Y-073 = 4,1 nM). Disse funn indikerte at kun Y-142 hadde evnen til å binde til proHB-EGF, selv om begge Y-142 og Y-073 hadde lignende bindings og nøytraliserende aktivitet mot SHB-EGF.
A. Bindingsaktivitet av Y-142 og Y-073 mot SHB-EGF. Anti-HB-EGF-antistoff ble inkubert ved forskjellige konsentrasjoner i en SHB-EGF-belagte eller BSA-belagte plate. -Antistoff-binding ble påvist med et HRP-merket anti-muse-IgG-antistoff. Y-142 binding til BSA, hvit firkant; Y-073 binding til BSA, hvit sirkel; Y-142 binding til SHB-EGF, svart firkant; Y-073 binding til SHB-EGF, sort sirkel. Datapunktene representerer gjennomsnitt ± standardavvik (SD) av verdier ervervet i to eksemplarer. B. nøytraliserende aktivitet av Y-142 og Y-073 mot SHB-EGF-indusert fosforylering EGFR. Anti-HB-EGF-antistoff ble inkubert ved de angitte konsentrasjoner i nærvær av 10 nM SHB-EGF med NUGC-3-celler i 15 minutter ved 37 ° C. Cellelysatene ble inkubert med et anti-EGFR-antistoff-belagt plate, etterfulgt av inkubasjon med HRP-merket anti-fosfotyrosin-antistoff. Ingen SHB-EGF, hvit sirkel; SHB-EGF og kontroll IgG, hvit firkant; SHB-EGF og Y-142, svart firkant; SHB-EGF og Y-073, sort sirkel. Datapunktene representerer gjennomsnitt ± SD av verdier anskaffet i tre eksemplarer.
Cell Proliferation og overlevelse Funksjoner av proHB-EGF
En tidligere studie har vist at proHB-EGF er involvert i celle-cellekontakt [10]. I et 3D sfæroide kultur, kreftceller gjennomgå mer omfattende celle-celle-kontakter enn i et 2D-kultur [23]. Vi har spekulert på at celle-celle-kontakt-mediert proHB-EGF effekten kan være mer uttalt og lettere å oppdage i 3D sfæroide kulturen. For å oppnå dette, har vi etablert en 3D spheroid kultur cellebasert assay ved hjelp NUGC-3 celler. Når NUGC-3-celler ble sådd ut i en sfæroide kulturplate, dannet de en sfæroide med en liten cellemasse i senterkjernen og løst fordelte celler som omgir kjernen (mørk grå og lys grå, henholdsvis i PBS kontrollen i fig. 3A ). Interessant, under Y-142 behandling ble cellene var mer diffuse og hadde et mindre midtkjernen og et større halogen. Den morfologiske endringen skyldes spesielt av Y-142 antydet at denne endringen i spheroid morfologi var knyttet til modulering av proHB-EGF funksjoner. Vi utforsket ytterligere de proHB-EGF funksjoner ved hjelp av 3D spheroid kultur analysen. I celleproliferasjonsanalyse, Y-142 signifikant hemmet proliferasjonen av NUGC-3 på en konsentrasjonsavhengig måte (fig. 3B). Inhiberingen av celleproliferasjonen nådde 72% ved den høyeste antistoffkonsentrasjon. I motsetning til Y-073 hadde ingen virkning på proliferasjon. Lignende resultater ble oppnådd i de andre cellelinjene som ble testet, det vil si 5637 og BxPC-3 (Fig. 3B). Siden Y-073 hemmet funksjonene til SHB-EGF og hadde ingen virkning på noen av de proHB-EGF-cellelinjer i den sfæroide kulturen, ble det foreslått at funksjonen av endogene proHB-EGF var dominerende i den sfæroide kultur, i forhold til funksjon av endogen SHB-EGF. Disse resultatene indikerte at proHB-EGF fungerte som en viktig celleproliferasjon faktor i cancerceller.
sfæroide dannelse og celleproliferasjon ved proHB-EGF funksjon ble undersøkt i henhold til Y-142 behandling. Cellene ble sådd ut på en sfæroid kulturplate i nærvær av 1% serum. Etter en 1-d inkubasjonsperioden ble cellene behandlet med de angitte konsentrasjoner av anti-HB-EGF-antistoff og dyrket i 3 dager. A. spheroid dannelsen av NUGC-3 celler. Baren i hvert bilde viser 500 mikrometer. B. Hemming av proHB-EGF-avhengig celleproliferasjon av Y-142. Celleproliferasjon ble målt ved CellTiter-Glo og er vist som prosentandelen av spredning av PBS-behandlede celler. Kontroll IgG, hvit firkant; Y-142, svart firkant; Y-073, sort sirkel. Datapunktene representerer gjennomsnittet ± SD av verdier ervervet i tre eksemplarer. C. Reduksjon i HB-EGF protein ved HB-EGF siRNA. Cellelysater av siRNA-transfekterte NUGC-3-celler ble underkastet SDS-PAGE. HB-EGF ble påvist ved western blotting med β-aktin som intern kontroll. D. Bekreftelse på proHB-EGF-avhengig celleproliferasjon av HB-EGF siRNA. NUGC-3-celler ble transfektert med HB-EGF siRNA før sfæroide kultur. En dag etter den siRNA transfeksjon ble cellene sådd ut på en sfæroide kulturplate. Celleproliferasjon ble målt ved CellTiter-Glo og vist som en prosentandel av celleproliferasjon av PBS-behandlede celler. Datapunktene representerer gjennomsnitt ± SD av verdier anskaffet i tre eksemplarer.
For ytterligere å bekrefte at hemming av celleproliferasjon ble forårsaket av endringen av proHB-EGF funksjon, vurderte vi effekten av HB- EGF siRNA på celleproliferasjon i den sfæroide assay for NUGC-3-celler. Redusert ekspresjon av proHB-EGF på grunn av HB-EGF siRNA ble bekreftet ved western-blotting (fig. 3C). I samsvar med knockdown av proHB-EGF uttrykk, HB-EGF siRNA forårsaket redusert celleproliferasjon (fig. 3D). Vi fant at graden av hemming av celleproliferasjon ved HB-EGF siRNA var lik den som ble observert med Y-142. Disse resultatene er i samsvar med den oppfatningen at Y-142 hemmer proHB-EGF-funksjon, noe som kan føre til redusert celleproliferasjon.
For å utforske den molekylære mekanismen bak funksjonene proHB-EGF i celle overlevelse, målte vi caspase aktivering, en nøkkelhendelse i apoptose [24], i NUGC-3-celler. Som indikert i fig. 4, Y-142 markedsført aktiveringen av caspase-3/7 (fig. 4), mens Y-073 hadde ingen virkning. Dette resultatet indikerer at proHB-EGF har celle overlevelse aktivitet i kreftceller og at hemme proHB-EGF utløser caspase-mediert apoptose.
celle overlevelse aktivitet av proHB-EGF ble testet ved å måle caspaseaktivering. NUGC-3-celler ble sådd på en sfæroid kulturplate i nærvær av 1% serum. Etter en 1-d inkubasjonsperioden ble cellene behandlet med Y-142 og dyrket i 1 d. Caspaseaktivering ble målt ved hjelp av caspase-Glo 3/7. Kontroll IgG, hvit firkant; Y-142, svart firkant; Y-073, sort sirkel. Datapunktene representerer gjennomsnitt ± SD av verdier anskaffet i tre eksemplarer.
Hemming av proHB-EGF Juxtacrine Aktiviteter ved Y-142
I motsetning til SHB-EGF, som virker ved autokrint og paracrine mekanismer, er juxtacrine signale en mekanisme som er unik for proHB-EGF [11]. Vi antok at effekten av Y-142 kan være mediert spesielt gjennom inhibering av proHB-EGF juxtacrine signalering. Fordi juxtacrine aktiviteten ble rapportert å være EGFR-mediert [11], målte vi fosforyleringen av EGFR, så vel som av dens nedstrøms proteiner ERK1 /2 og AKT, som er involvert i celle-proliferasjon og caspase-mediert apoptose, henholdsvis i NUGC -3 celler. EGFR-inhibitor erlotinib, anvendt som en positiv kontroll, hemmet fosforylering av EGFR, ERK1 /2, og AKT (fig. 5). I likhet med virkningen av erlotinib, redusert Y-142 fosforylering av EGFR, ERK1 /2, og AKT, mens Y-073, så vel som kontroll IgG ikke gjorde det. Inhiberingen av deres fosforylering av Y-142 var signifikant ved 15 minutter etter behandlingen og varte i opp til 3 dager, noe som tyder på at det juxtacrine signalet ble konstitutivt aktivert i sfæroide. Disse data antydet at proHB-EGF juxtacrine aktivitet fører til celledeling samt celle overlevelse aktivitet.
proHB-EGF juxtacrine aktivitet ble målt ved hjelp av Y-142. NUGC-3-celler i en sfæroide kulturplate ble behandlet med 200 nM kontroll IgG, 200 nM, Y-142, 200 nM, Y-073, eller 1 nM erlotinib i de angitte tidsrom. A. Fosforylering av EGFR. B. Fosforylering av ERK1 /2. C. Fosforylering av AKT. Fosforylering ble beregnet som prosentandelen av fosforyleringen av PBS-behandlede celler. Datapunktene representerer gjennomsnittet ± SD av verdier ervervet i tre eksemplarer. Statistisk analyse ble utført ved anvendelse av uparede t-test (en-halet, sammenlignet med PBS-behandlede prøve på det tilsvarende tidspunkt). *, P 0,05; **, P 0,005; ***, P. 0,0005
Ingen effekt av Y-142 på CTF Generation
CTF, som er produsert sammen med SHB-EGF av ectodomain Shedding, driver [celleproliferasjon ,,,0],25]. For å evaluere bidraget av CTF i hemming av celleproliferasjon ved Y-142, ble den mengde CTF undersøkt i NUGC-3-celler. PMA [26] ble brukt som kontroller for å stimulere ectodomain Shedding og CTF produksjon. Som vist på fig. 6 er mengden av CTF som genereres i nærvær og fravær av Y-142 var ikke vesentlig forskjellig, noe som tyder på at Y-142 hadde ingen innvirkning på dannelsen av CTF.
Virkningen av CTF på den observerte inhibering av celleproliferasjon (fig. 3B) ble undersøkt ved å måle mengden av CTF. Cellelysater av PMA-, tak IgG, Y-142-, eller Y-073-behandlede NUGC-3-celler ble underkastet SDS-PAGE. CTF ble påvist med anti-CTF polyklonale antistoff i western blotting.
Diskusjoner
HB-EGF består av en membranbundet form (proHB-EGF), en løselig form (SHB -EGF), og et C-terminalt fragment (CTF), og hver form har en unik biologisk aktivitet. Blant disse 3 danner, har funksjonen av SHB-EGF blitt vidt undersøkt ved anvendelse av rekombinante proteiner. Til dags dato har den biologiske aktivitet til proHB-EGF blitt foreslått på grunnlag av virkningen av transfekterte proHB-EGF på proliferasjon og overlevelse av EGFR-uttrykkende celler [11], [14] – [16], eller på grunnlag av virkningen av proHB-EGF-overekspresjon på autonome celleformering [17], [18]. Imidlertid informasjon om proHB-EGF-funksjonen er sparsom og inkonsekvent, muligens på grunn av mangel på en fremgangsmåte for spesifikt å aktivere eller hemme proHB-EGF. I enkelte andre studier, uncleavable mutant proHB-EGF (uc-proHB-EGF), som har 2 aminosyreerstatninger (Leu148 og Pro149) i spaltningssetet, ble brukt til å evaluere proHB-EGF funksjon [26]. uc-proHB-EGF har vist seg å besitte juxtacrine aktivitet i formalinfikserte EGFR-uttrykkende celler [27]. Hvis uc-proHB-EGF representerer fullt villtype-EGF-proHB funksjon, selv i levende celler, kan dette mutant være nyttig for å identifisere proHB-EGF-funksjoner i sfæroide kultur. Nylig ble en annen versjon av UC-proHB-EGF, hvis kuttesete ble slettet, brukes til å studere proHB-EGF funksjoner. Dette UC-proHB-EGF forhindret anoikis av Madin-Darby canine nyreceller [28]. Men i sammenligning med de metoder som ble benyttet hittil, er det noen fordeler ved vår tilnærming ved hjelp av en 3D-sfæroide kultur og et funksjonelt anti-HB-EGF-antistoff: funksjonene av endogent uttrykt proHB-EGF kan påvises, og formalinfiksering, hvilke kan forårsake artefakter, ikke er nødvendig fordi det ikke er endogen SHB-EGF funksjon.
Akkumulerte rapporter viste at sfæroide kulturligner kreft miljøet bedre enn en 2D kultur i form av celle-celle kontakter, narkotika motstand, narkotika penetrasjon, og nærings effektivitet [23], [29]; derfor funksjonene til endogent uttrykt proHB-EGF funnet i 3D sfæroide antyder at proHB-EGF kan spille viktige roller i tumorprogresjon. I denne studien brukte vi 3 kreftcellelinjer endogent uttrykker proHB-EGF. Y-142 hemmet proliferasjonen av NUGC-3-celler med 72%, 5637-celler med 55%, og BxPC-3-celler med 24% i den maksimale konsentrasjon (fig. 3B). Som vist på fig. 1A, 3 cellelinjer har forskjellige nivåer av proHB-EGF uttrykket (NUGC-3-celler 5637 celler BxPC-3-celler), noe som kan forklare den relative effekten av Y-142 på proliferasjon. De 3 cellelinjer er avledet fra mage, blære, og kreft i bukspyttkjertelen vev, noe som er kjent for å overuttrykke HB-EGF [30] – [32]. HB-EGF har blitt rapportert å være oppregulert ved andre cancertyper slik som bryst og eggstokk-kreft og glioblastom [33] – [35]; Derfor kan proHB-EGF utøve sine funksjoner i et bredt spekter av krefttyper.
I den sfæroide kultur, behandling med Y-142 økt antall celler som diffunderer ut av den sfæroide kjerne (fig. 3A) . Inhiberingen av EGF-proHB juxtacrine-aktivitet ble påvist selv etter 3 d Y-142-behandling (fig. 5), da celle spredning ble observert. Vi spekulerer i at proHB-EGF-mediert celle-celle kontakt er direkte forbundet med sin proHB-EGF juxtacrine aktivitet. Resultatene av en tidligere studie ved hjelp av uc-proHB-EGF støttet denne spekulasjon ved at resultatene indikerte en cytobeskyttende rolle proHB-EGF ved å forbedre EGFR-mediert celle-celle-kontakt og viste at caspaseaktivering ble hemmet av proHB-EGF /EGFR /AKT sti [28]. Vi har også oppdaget at caspaseaktivering og hemmet EGFR og AKT-fosforylering av Y-142 behandling i den sfæroide kultur (fig. 4, 5A og 5C). Våre resultater kan være avledet fra inhiberingen av den cyto-beskyttende rollen av EGF-proHB. Vi spekulere at anti-kaspase funksjon av proHB-EGF medvirker til kreftcelleoverlevelse ved å hemme apoptose signaler slik som de som er aktivert i celler utsatt for kjemoterapeutiske midler, radioterapi, hypoksi, og immun-celle-mediert cytotoksisitet. En tidligere studie rapporterte at anti-apoptotiske protein BAG-1 medierer proHB-EGF celleoverlevelseseffekt [36]. Den BAG-1-mediert celle overlevelse effekten av proHB-EGF ble notert i CHO-celler, som er blottet for EGFR, noe som tyder på at proHB-EGF /BAG-en sti bruker EGFR-uavhengig celle overlevelse signalering. proHB-EGF kan bruke både EGFR-avhengig og EGFR-uavhengig veier å utøve sin celle overlevelse effekter. I tillegg bemerket vi inhibering av ERK1 /2 fosforylering av Y-142 (fig. 5B), noe som tyder på at celleformering signal fra proHB-EGF medieres gjennom ERK1 /2 pathway. Selv om måling av den juxtacrine aktiviteten av proHB-EGF i et 3D sfæroide kultur, bemerket vi inhibering av EGFR-signalisering ved Y-142 (fig. 5), noe som tyder på at proHB-EGF utøver anti-apoptotiske og celle spredningsfunksjoner på nabocellene via deres EGFR vei. I de tilfeller hvor kreftceller uttrykker både proHB-EGF og EGFR, kan den samme celle opptre som donor og akseptor for celleoverlevelse og spredningssignaler. Til sammen spår vi at proHB-EGF induserer effektivt tumorprogresjon ved direkte å fremme kreftcelle spredning og ved å hemme apoptose. Som vist på fig. 6, gjorde Y-142 ikke hemme ectodomain Shedding, som fører til CTF produksjon. Derfor konkluderte vi med at den biologiske aktiviteten av Y-142 funnet her var ikke knyttet til hemming av CTF produksjon.
