Abstract
Sensitive og spesifikke biomarkører av protein kinase hemming kan utnyttes til å akselerere narkotika utviklingsstudier i onkologi ved å knytte tidlige molekylære responser med target hemming. I denne studien benyttet vi deg hagle fosfotyrosin (pY) proteomikk for å oppdage nye biomarkører for respons til dasatinib, et lite molekyl Src-selektiv hemmer, i prekliniske modeller for tykk- og endetarmskreft (CRC). Vi utførte objektive massespektrometri hagle PY proteomikk å avsløre pY proteomet av dyrkede HCT-116 colonic carcinoma celler, og deretter utvidet denne analysen til HCT-116 xenografttumorer å identifisere PY biomarkører av dasatinib-respons in vivo. Store dasatinib-responsive PY steder i xenografttumorer inkludert steder på delta-type protein kinase C (PKCδ), CUB-domene som inneholder protein 1 (CDCP1), Type-II SH2-domene som inneholder inositol 5-fosfatase (SHIP2), og reseptor-protein-tyrosin fosfatase-alfa (RPTPα). Den pY313 nettstedet PKCδ ble ytterligere støttet som en relevant biomarkør av dasatinib-mediert Src hemming i HCT-116 xenografter ved immunhistokjemi og immunblotting med en phosphospecific antistoff. Reduksjon av PKCδ pY313 ble ytterligere korrelert med dasatinib-mediert hemming av Src og redusert vekst som kuler av et panel av humane CRC cellelinjer. Disse studiene viser PKCδ pY313 som en lovende avlesning av Src hemming i CRC og potensielt andre solide tumorer og kan gjenspeile respons til dasatinib i en undergruppe av kolorektal kreft
Citation. McKinley ET, Liu H, McDonald WH, Luo W, Zhao P, Coffey RJ, et al. (2013) Global fosfotyrosin Proteomikk Identifiserer PKCδ som en markør av Respons for å Src Hemming i tykktarmskreft. PLoS ONE 8 (11): e80207. doi: 10,1371 /journal.pone.0080207
Redaktør: Laszlo Buday, ungarske Academy of Sciences, Ungarn
mottatt: 19 juli 2013; Godkjent: 30 september 2013; Publisert: 08.11.2013
Copyright: © 2013 McKinley et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse studiene ble støttet med tilskudd fra National Cancer Institute: R25 CA136440, P50-951903; R01-CA140628; K25-CA127349; RC1-CA145138; R01-CA46413; og Kleberg Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tyrosinfosforylering er en viktig signalmekanisme som regulerer sentrale aspekter ved pattedyrcelle oppførsel inkludert spredning, bevegelighet, metabolisme, og differensiering [1]. Protein tyrosin kinaser ble først anerkjent som produkter av virale onkogener inkludert v-src og v-abl, og som reseptorer for vekstfaktorer, inkludert EGF. Avvikende signalisering ved mange av de konvensjonelle nitti tyrosinkinaser kodet av det humane genom har vært knyttet til sykdomsprosesser, inkludert utvikling og spredning av kreft [1,2].
Målrettet behandling med tyrosinkinasehemmere (TKI) er en stadig voksende modalitet som muliggjør personlig kreftbehandling [3,4]. Landmark eksempler inkluderer lite molekyl inhibitor imatinib som effektivt behandler kronisk myelogen leukemi drevet av BCR-ABL oncoprotein [5,6], så vel som terapi for å inhibere mutant BRAF i kreftformer slik som melanom [7,8]. Lite molekyl TKI og nøytraliserende monoklonale antistoffer som er rettet mot EGF reseptor (EGFR) og /eller nært beslektet ErbB2 (HER2 /neu) har hatt suksess i behandling av ikke-småcellet lungekreft og brystkreft [9,10].
I tykktarmskreft (CRC), et stort flertall av tilfellene viser forhøyet aktivitet av Src-familien ikke-reseptor tyrosin kinaser [11,12], som gradvis øker i aktivitet som svulster videre til metastatisk sykdom [13]. Aberrant Src-aktivitet kan bidra til malignitet ved å påvirke flere reseptor-systemer, inkludert cadherin-mediert celle-celle kryss, integrin-mediert celle-ECM sammenvoksninger, og aktiverte reseptor-komplekser inkludert EGFR [14-16]. Forhøyet Src aktivitet i CRC spår dårlig klinisk prognose [17]. Følgelig har det vært stor interesse for Src som et terapeutisk mål i CRC og andre kreftformer [18-21]. Dasatinib, den mest klinisk undersøkt Src-selektiv inhibitor, er en effektiv cytostatisk middel å inhibere tumorvekst, invasjon og metastase [22]. I tillegg til Src-familie kinaser, dasatinib potent hemmer BCR-ABL og ble nylig vist å være bedre enn imatinib som en terapi for kronisk myelogen leukemi [23].
I evalueringen målrettet TKI i klinisk onkologi, det er et behov for å identifisere relevante biomarkører som kan brukes til å lede utvalget dose i preklinisk utvikling og for å overvåke anti-tumor aktivitet i kliniske studier. Biomarkører kan også være av verdi i å forutsi om en pasient er sannsynlig å dra nytte av en bestemt behandling. Flere studier har benyttet ulike tilnærminger i et forsøk på å identifisere slike markører [24-26]. Rasjonelt, kan slike biomarkører også være spesifikke tyrosin områder som fosforyleres av kinase (e) blir hemmet. Således er det av interesse å karakterisere de tyrosinkinase-signalveier som opererer i tumorceller. Tyrosinfosforylering i tumorceller kan være systematisk og grundig profilert bruker massespektrometri for å analysere peptider beriket for fosfotyrosin (pY) av immunoaffinitetskolonnerensing [27]. Vi har tidligere brukt dette objektivt hagle proteomikk tilnærming for å få en grundig analyse av tyrosinfosforylering i normal versus Src-transform musefibroblastere, og dermed karakterisere de globale konsekvensene av onkogene Src [28]. I en annen anvendelse av denne tilnærmingen, avslørte pY signalering i et stort utvalg av ikke-småcellet lungekreft cellelinjer og solide svulster aktivert tyrosin kinaser [29].
Formålet med denne studien var å bruke hagle pY proteomforskning for å oppnå en global oversikt over tyrosinfosforylering i den kjente HCT-116 human kolon adenokarsinom-cellelinje, og for å utvide analysen til HCT-116 xenograft tumorer som ble behandlet med dasatinib for å identifisere dasatinibbehandlede responsive py biomarkører. Vi identifiserte py sider på signalanlegg proteiner inkludert PKCδ CDCP1, og RPTPα som store dasatinib-responsive nettsteder i HCT-116 xenografttumorer som kan være nyttig som prediktive biomarkører av SRC hemming. Til slutt, ved hjelp av sfæroide kulturer etablert fra en rekke humane cellelinjer CRC, observerte vi en korrelasjon mellom datatinib-mediert inhibering av proliferasjon og reduksjon av PKCδ pY313. Våre resultater viser PKCδ pY313 som kandidat biomarkør for å forutsi respons på dasatinib i CRC.
Materialer og metoder
Cell kultur og medikamentell behandling
HCT-116 (ATCC CCL- 247), Caco-2 (ATCC HTB37), Colo205 (ATCC CCL-222), DKO-1, DLD-1 (ATCC CCL-221) ble oppnådd fra ATCC og Lim1215 celler [30] ble oppnådd fra Robert Whitehead, Ludwig Institute for Cancer Research. De humane CRC-cellelinjer ble opprettholdt som en monolagskultur på Subkonfluente tetthet i en 5% CO
2, 37 ° C atmosfære. Vekstmediet besto av Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; Mediatech) for alle cellelinjer med unntak av Colo205 som ble dyrket i RPMI (Cellgro). Dyrkningsmediet ble supplert med 10% føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals), 1% antimykotiske antibiotika (Mediatech), og 100 mM ikke-essensielle aminosyrer (Gibco-Invitrogen). Alle celler ble passert bruker 0,25% EDTA-trypsin (Gibco).
Dasatinib (BMS-354825) ble vennlig levert av Richard Smykla fra Bristol-Myers Squibb Oncology (Princeton, NJ). Dasatinib ble løst opp i dimetylsulfoksyd (DMSO) i en 10 mM stamløsning. HCT-116, Caco-2, Colo205, DKO-1, og DLD-1-cellene ble behandlet med økende konsentrasjoner (dasatinibbehandlede 0, 10, 100, 1000, 5000 nM) i 24 timer. Ved slutten av behandlingen, ble kulturmediet fjernet og cellene ble høstet for analyse.
Animal modell
Alle studier ble godkjent av Vanderbilt University Institutional Animal Care og bruk komité og alle anstrengelser ble gjort å minimalisere dyrs lidelse. HCT-116 xenografter ble generert i atymiske nakne mus (Harlan Sprague-Dawley) etter subkutan injeksjon av 2-4 × 10
6 celler. Håndgripelig svulster ble oppdaget i løpet av to til fire uker. Dasatinib ble rekonstituert i DMSO. Umiddelbart før behandlingen ble ni deler steril saltløsning tilsettes til medikamentløsningen. Tumor-bærende mus (0,5-1 cm lengste dimensjon) ble tilført 100 ul dasatinib (60 mg /kg) eller DMSO /saltvannsbærer ved oral gavage. Dyr ble gitt enten en enkelt dose eller behandlet daglig i 5 påfølgende dager. For hver behandlingsregime, ble årskull av dyrene avlivet og svulstene ble skåret 4 timer og 24 timer etter den siste Drug Administration.
Utarbeidelse av fosfotyrosin-beriket Peptidprøver
tryptiske peptider beriket i fosfotyrosin var fremstilt fra HCT-116 monolagskulturer (eksponentielt voksende på ca 70% konfluens) og fra HCT-116 xenografttumorer. Cellelyse, protein fordøyelse, og immunoaffinitetskromatografi berikelse for pY-inneholdende tryptiske peptider ble oppnådd ved hjelp av PhosphoScan Kit (P-Tyr-100; Cell Signaling Technology) i henhold til produsentens protokoll. For dyrkede celler, ble hver runde av analyse utført ved anvendelse av 60 mg totalt celleprotein (skaffet fra åtte 150 mm skåler). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av BCA (Thermo Scientific), med bovint serumalbumin (BSA; Sigma) som en standard. Tumor lysater ble fremstilt ved homogenisering på is for å dispergere det frosne vev (ca. 400 mg våtvekt tumor i 9 ml i PhosphoScan Lysis Buffer), etterfulgt av kort ultralydbehandling og sentrifugering (20000 x
g
i 15 min) for å klart uløselig materiale. Ryddet tumor lysater inneholdende ca. 40 mg protein (bestemt ved BCA-analyse) ble anvendt i analysen. Tryptiske peptider ble samlet ved behandling lysatene over natten ved 25 ° C med trypsin-TPCK (60: 1 cellulært protein: trypsin).
Massespektrometri
LC-MS /MS analyse av peptidene ble utført ved hjelp av en hybrid lineær ionefelle /orbitrap instrument (LTQ-Orbitrap, Thermo-Fisher) er utstyrt med en Eksigent NanoLC-AS1 autosampler, Eksigent NanoLC-1D pluss væskekromatografi (HPLC) pumpe med høy ytelse (Eksigent), nano-electro kilde, og Xcalibur instrument kontroll programvare. Peptider ble separert på en kapillarkolonne av smeltet silisiumdioksyd (100 um x 18 cm) pakket med omvendt fase-harpiks (Jupiter C18, 3 um, 300 Å; Phenomenex), og kombinert med en in-line, frittet (generert med flytende silikat Kasil) fangst kolonne (100 mikrometer × 4 cm) også spekket med C18 harpiks (Jupiter C18, 5 um, 300 Å, Phenomenex) [31]. Bifasisk gradient kromatografisk eluering ble anvendt hvorved mobil fase A bestod av 0,1% maursyre og mobil fase B bestod av 0,1% maursyre i acetonitril. Strømningshastigheten under lasting og avsalting fase av gradienten var 1,5 pl /min, og under separasjonsfasen var 500 Nl /min. En 184 min gradient ble utført med en 10 minutters vaskeperiode omdirigert til avfall etter pre-kolonne (100% oppløsningsmiddel A for den første 10 min, etterfulgt av en gradient til 98% oppløsningsmiddel A, v /v, 15 min) for å tillater fjerning av eventuelle gjenværende salter. Etter vaskeperioden ble gradienten økt til 35% B etter 125 minutter, fulgt av en økning til 90% B etter 140 minutter og holdt der i 9 min før retur til startbetingelsene. Tandem spektra ble anskaffet ved hjelp av en dataavhengig skanning modus der en hel MS scan (m /z 300-2000) ble kjøpt på Orbitrap med en oppløsning på 60 000. Maksimal injeksjon tid var 1 s. Dataavhengig MS /MS-skanner ble kjøpt for de fem mest intense ioner fra full skanning ved hjelp av en isolasjonsbredde 2 m /z, en aktivering på 30 ms, en 30% normalisert kollisjonsenergi, og en maksimal injeksjons tid på 150 ms .
For å forbedre deteksjonen av fosfor, en ekstra dataavhengig algoritmen i Xcalibur programvaren ble aktivert som tilstedeværelsen av en dominerende fosfat nøytral tap (97,97, 48,99 og 32,66 m /z enheter) vil utløse Kjøpet av en MS /MS /MS [32]. Å tillate innsamling av MS /MS spektra fra lavere overflod peptider, ble tidligere mål ioner valgt for MS /MS dynamisk utelukket med en listelengde på 150 ioner og en tid på 60 s. «Monoisotopic forløper utvalg» ble aktivert og lade tilstander av 1+ og 4+ ble ekskludert fra hensynet til MS /MS. Instrumentet ble operert i forhåndsvisningsmodus for å tillate samtidig samling av MS /MS spektra under Orbitrap skanningen. Generelle massespektrometriske Betingelsene var som følger: spray spenning, 2,2 kV; ingen skjede og hjelpe gasstrømmen; ion Overføringsrøret temperatur, 200 ° C; og tube linse spenning 80 V.
Database søking, filtrering, og falske funnrate bestemmelse
Metoder lignet på database søker strategier tidligere beskrevet [28], med mindre modifikasjoner. Thermo RAW-filer ble forvandlet til DTA filer ved hjelp av ScanSifter algoritmen (Vanderbilt University), deretter søkte etter TurboSEQUEST V.27 (rev. 12) algoritme (Thermo Electron) mot mus /human undergruppe av UniRef100 database, som ble reversert for å beregne falske funnrate. Søkene ble utført slik at de følgende differensial modifikasjoner: 57 på cystein (for carboxyimidomethylation fra iodoacetamide), 16 på metionin (oksidasjon), og 80 på Ser, Thr, eller Tyr (fosforylering). MS /MS /MS-spektra ble også søkt etter en -18 masseforskyvning på Ser, Thr, eller Tyr å ta hensyn til tap av vann, noe som resulterer fra nøytral tap av fosforsyre. Peptid og fragment ion toleranser ble satt til 2,5 Da og 1,0 Da, respektivt.
False-funnrate ble deretter estimert fra peptid kampene til den omvendte sekvenser multiplisert med to og delt på totalt antall peptid treff. Peptider hentet fra databasen søkealgoritmer med 5% falske funnraten ble ytterligere filtrert av ytterligere tre trinn. Først satte terskelen ble satt avhengig av peptid kategori. For ladnings 1 peptider, ble peptider valgt med xcorr større enn eller lik 1, RSP mindre enn eller lik 5, og Sp er større enn eller lik 350; for lade 2 peptider, terskelen ble satt til xcorr 1.8, RSP fem og Sp 350; for ladnings 3 peptider, terskelen ble satt til xcorr 2,5, RSP 5, og Sp 350. For det andre, ble det bare peptider med minst et tyrosin og en fosforylering beholdt. Endelig, av de gjenværende peptid treff, bare pTyr-inneholdende peptider med minst ett av tre ytterligere kriterier ble opprettholdt: (1) minst to samsvarende spektra hadde xcorr verdier over høy terskel (3,3 for ladning av tre, 2,2 for ladning av 2 og 1.5 for kostnad på 1), (2) pTyr området ble uavhengig identifisert fra to eller flere distinkte peptider, eller (3) pTyr området hadde blitt uavhengig identifisert andre steder og inkludert i PhosphoSite online ressurs for
in vivo
fosforyleringsseter, versjon 1.5 (https://www.phosphosite.org), opprettholdt av Cell Signaling Technology, Inc.
Alle originale massespektrometri data fra xenograph tumorforsøk har blitt gjort offentlig tilgjengelig gjennom refrenget online massespektrometri data ressurs (https://chorusproject.org/). Med et kor brukerkonto, kan noen undergruppe av disse rådata lastes ned eller sett online. Alternativt kan disse dataene lastes ned direkte som en 2,8 GB fil uten å registrere deg på:. Https://chorusproject.org/anonymous/download/experiment/-2997969850554343767)
Antistoffer og immunoblotting
celle~~POS=TRUNC prøver~~POS=HEADCOMP ble tatt etter 24 timer av dasatinib eksponering. Xenograft tumorprøver ble samlet fire timer eller 24 timer etter den siste administrering av dasatinib. Svulster ble hurtigfrosset i flytende nitrogen, deretter homogenisert og fortynnet til 1 pg /pl i lyseringsbuffer. Mellom 20 og 40 ug av total protein fra hver prøve ble fylt i 7,5 til 12% SDS-PAGE-geler og løses ved elektroforese før overføring til PVDF-membraner (PerkinElmer). Membranene ble blokkert over natten ved 4 ° C i tris-bufret saltvann 0,1% Tween-20 (TBST) inneholdende 5% w /v ikke-fettholdig tørrmelkpulver. Deretter ble membranene immunoblottet med antistoffer mot p-Src Y416 (Cell Signaling # 6943S), total Src (Cell Signaling # 2107), p-PKCδ Y313 (Cell Signaling # 2055S), total PKC (Cell Signaling # 2058), p- RPTP Y789 (Cell Signaling # 4481S), total RPTP (Upstate # 07-472), β-aktin (Cell Signaling # 4967), og β-tubulin (Cell Signaling # 2128). Sondering forekom i 1 time ved romtemperatur med antistoffer utvannet som foreslått av leverandørene i TBST med 3% bovint serumalbumin (BSA), etterfulgt av inkubering i 1 time ved romtemperatur med det arts passende pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Jackson ImmunoReserach) fortynnet 1: 5000 i TBST inneholdende 3% BSA. Western Lightning
TM Plus-ECL (PerkinElmer) substrat ble brukt for deteksjon på en Xenogen IVIS 200. Densitometry ble gjennomført ved hjelp av levende bilde 3.2-programvaren (Sylinder).
spheroid vekstanalyse
serie~~POS=TRUNC mikroskopiske bilder av celleklumper fra 0, 24, 48 og 72 timer etter dasatinib behandling ble importert til ImageJ programvarepakken (NIH). Bilder ble automatisk konvertert til binær og hull i binære bildet ble stengt ved hjelp av fyll Holes funksjon i ImageJ. The Wand markeringsverktøyet ble brukt til å segmentere alle tilkoblede piksler fra spheroid, og antall piksler i dette området ble registrert. Totalt areal for hver spheroid var normalisert til 24 h tidspunkt.
Immunohistochemistry
Umiddelbart etter offer, viste prøver tatt av utskåret tumor ble fiksert i 10% formalin i 24 timer og overført til 70% etanol. Prøvene ble deretter behandlet for parafin innebygging og seksjonert før farging. Etter seksjonering, ble vevsprøver deparaffinized, rehydrert, og antigen gjenfinning trinn ble utført ved anvendelse av en citratbuffer (pH 6,0) løsning påføres i 20 minutter ved 105 ° C, etterfulgt av 10 minutter ved romtemperatur. Prøvene ble deretter behandlet med 3% H
20
2 for å fjerne endogen peroksidaseaktivitet. Seksjonene ble deretter blokkert med et serumfritt proteinblokkerende reagens i 20 minutter. Seriesnitt ble inkubert over natten med en 1: 100 fortynning av p-PKCδ pY313 (Cell Signaling # 2055S) antistoff eller p-SHIP2 Y986 /987 (Cell Signaling # 2008). Påvisning av primære antistoffer anvendes forestille seg + Systems (Dako) med pepperrot-peroksidase-merket polymer (30 min inkubasjon) etterfulgt av tilsetning av DAB substrat (5 min inkubasjon). Farget Prøvene ble fotografert ved 40x forstørrelse og analysert for ekspresjon av histologiske markører.
Resultater
Den fosfotyrosin proteomet av dyrkede HCT-116 menneskelige kolorektal celler
Vi har tidligere gjennomført en omfattende analyse av fosfotyrosin proteomet av Src- forvandlet musefibroblastere
i vitro product: [28]. Hensikten med denne studien var å utføre en tilsvarende analyse for å karakterisere pY proteomet av menneske CRC cellelinje og deretter utvide tilnærming for å søke etter potensielle PY biomarkører av dasatinib-respons i HCT-116 xenografttumorer.
I utgangspunktet søkte vi å karakterisere pY proteomet av dyrkede HCT-116 celler, i fravær av dasatinib behandling. Fra 15 uavhengige LC-MS /MS-runs (5 biologiske replikat, hver støttet av 3 tekniske replikater), ble 249 forskjellige py peptider identifisert. Disse peptidene representerer 162 forskjellige PY nettsteder på 116 forskjellige proteiner. Kriterier for peptid oppbevaring inkludert høy terskel xcorr verdi og identifikasjon i En biologisk replikere. Tabell S1 viser opptjent peptider gruppert etter en funksjonell klassifisering, py nettstedet aminosyre posisjon, antall uavhengige identifikasjoner (spektrale teller), og høyeste xcorr verdier. Listen av tilbakeholdt PY peptider og spektral count data gir en global oversikt over PY signal aktiviteter HCT-116 celler under betingelser av monolayer cellekultur. Omtrent halvparten av Py områder oppført representerer proteinkinaser (44/162) og andre signalproteiner (38/162), mens en annen 25% av nettstedene er på proteiner assosiert med celle adhesjon og aktin cytoskjelettet (40/162) (Figur 1A).
I dyrkede HCT-116 celler, ble 162 py områder identifisert som representerer 116 forskjellige proteiner (A). Proteiner klassifisert under hovedkategorier av vedheft og Cytoskjelett, proteinkinaser, og andre Signale står for omtrent tre fjerdedeler av totalen. Av de py steder på protein kinaser, de aller fleste er på konvensjonelle tyrosin kinaser og «CMGC Gruppe» protein kinaser som inkluderer CDK, ERK /MAPK, GSK-3, og andre dual-spesifisitet kinaser. Se tabell 1 og tabell 2 for en liste over de mest vanlige identifiserte områder ved spektral teller i HCT-116 celler. Alle de 162 steder er presentert i tabell S1 sammen med nøkkelinformasjon inkludert Uniprot nummeret, fosforpeptidene som detekteres i den LC-MS /MS-analyse, og de totale spektrale ID-er. I HCT-116 xenografttumorer, ble 71 py områder identifisert som representerer 58 forskjellige proteiner (B). Oppbevaring kriterier for nettstedene var 7 eller flere spektrale IDer i svulster og deteksjon også i HCT-116 dyrkede celler. De 71 py sider representerer 58 forskjellige proteiner. Tumor områder som oppfyller kriteriene oppbevaring har en funksjonell fordeling meget lik den til områder som er identifisert i dyrkede celler. Se Tabell 3 og Tabell 4 for en liste over topp områder ved spektral teller i HCT-116 xenografter. Alle 71 områdene er presentert i tabell S2 sammen med nøkkelinformasjon inkludert Uniprot ID-nummer, fosfor oppdaget i LC-MS /MS-analyse, og antall spektrale IDer fra ubehandlede
versus
dasatinibbehandlede svulster.
Av protein kinase py nettsteder, identifiserte vi 24 sider på 14 forskjellige tyrosin kinaser og 15 sider på 14 forskjellige CMGC kinaser. CMGC kinaser (en bred klassifisering gruppe som inkluderer CDK, ERK /MAPK, GSK-3, og familier av dual-spesifisitet kinaser) var fremtredende blant de hyppigst identifisert HCT-116 nettsteder (tabell 1). CDK1 pY15 var den mest oppdaget området med 146 spektrale teller. En kinase domene aktivering sløyfe hotellet (pY1234) på MET, hepatocyte vekstfaktor reseptor tyrosin kinase, var den nest mest identifisert nettstedet i HCT-116 dyrket celle profil med 74 spektrale teller. Andre topprangerte nettsteder på CMGC kinaser (inkludert PRP4, ERK2, DYRK1, og GSK-3) også bor i kinase domene aktivering løkker hvor fosforylering indikerer aktivert tilstand. Vi identifiserte en rekke steder i HCT-116 celler som ikke ble observert i vår forrige omfattende analyse av MEFs [28], Tabell 2.
Protein
funksjonsklasse FBT-Parts.com Site
IDer
CDK1Protein kinase: CMGCY15146METProtein kinase: Tyrosin * Y123474PRP4Protein kinase: CMGC * Y84969CDCP1Adhesion: Cell /ECM Y70747PaxillinAdhesion: Cell /ECMY11841ERK2Protein kinase: CMGC * Y18736SHBOther SignalingY24632Annexin A2Other SignalingY2429DYRK1AProtein kinase: CMGCY32126SHBOther SignalingY26824LAP2 /ErbinOther SignalingY110424Catenin δ-1Adhesion: Cell /CellY22824GSK-3Protein kinase: CMGC * Y27922Table 1. Alle fosfotyrosin nettsider oftest identifisert i HCT-116 dyrkede celler product: * Site i protein kinase domene aktiverings sløyfe Forkortelser. CDCP1, CUB domene som inneholder protein 1; CDK1, Celledeling kontroll protein 2 homolog; DYRK1A, Dual spesifisitet tyrosin-fosforylering regulert kinase 1A; ERK2, mitogenaktivert proteinkinase 1; GSK-3, glykogensyntasekinase-3 (alfa og beta); MET, hepatocytter vekstfaktor reseptor; PRP4, Serine /treonin-protein kinase PRP4 homolog; SHB, SH2 domene som inneholder adapter protein B. CSV ned CSV Protein
funksjonsklasse FBT-Parts.com Site
IDer
CDCP1Adhesion: Cell /ECMY70747DCBLD2MiscellaneousY75019PKCδProtein Kinase: AGCY31318FAT1Adhesion: Cell /CellY424416MST1R /RONProtein Kinase: Tyrosin * Y123815Annexin A2Other SignalingY3014DCBLD2MiscellaneousY73214TYK2Protein kinase: TyrosineY29213FYNProtein kinase: Tyrosin ** Y21311LYNProtein kinase: Tyrosin ** Y19311Table 2. fosfotyrosin områder som ikke finnes i den forrige omfattende analyse av kultivert MEFs
(28) product: * Site i protein kinase domene aktivering sløyfe ** Site i Src-familie kinase SH2 domainAbbreviations: CDCP1, CUB domene som inneholder protein 1; DCBLD2, Discoidin, CUB og LCCL domene som inneholder protein 2; FAT1, Protocadherin Fat 1; FYN, Tyrosin-protein kinase Fyn; LYN, Tyrosin-protein kinase Lyn; MST1R /RON; Makrofag-stimulerende protein reseptor; PKCδ, Proteinkinase C delta-type; TYK2, Ikke-reseptor tyrosin-protein kinase TYK2. CSV Last ned CSV
Den fosfotyrosin proteomet av HCT-116 xenografttumorer
Etter å ha innhentet de pY profilen til HCT-116 celler i kultur, PY proteomikk strategien ble deretter benyttet til å identifisere HCT-116 PY nettsteder som er fremtredende i xenografttumorer og som har potensial til å tjene som biomarkører for dasatinib respons. Subkutane HCT-116 xenograft tumorer ble etablert i atymiske nakne mus og pY-anrikede tryptiske peptider ble fremstilt fra hver av 3 svulster fra begge vehikkelbehandlede mus og fra mus behandlet i 4 timer tidligere med 60 mg /kg dasatinib. Hvert peptid-preparat ble analysert gjennom tre replikat LC-MS /MS løper for å oppnå tumor py profiler. Fra denne analysen, 71 py områder, som representerer 58 forskjellige proteiner, ble anerkjent som fremtredende i xenografttumorer så vel som blir oppdaget i de dyrkede celler (tabell S2). I likhet med den kultiverte celle profil, de fleste av disse områdene var på signale proteiner (inkludert mange protein kinaser) og vedheft /cytoskjelett-assosiert proteiner (Figur 1b). Tyrosinkinaser og CMGC proteinkinaser var igjen fremtredende i tumoren profilen. Nettsteder om CMGC kinaser dominerte listen over de hyppigst identifiserte kreft nettsteder inkludert CDK1 Tyr15, og aktiverings sløyfe områder på p38 MAPK, PRP4, ERK1, ERK2, og GSK-3 (tabell 3).
Protein
funksjonsklasse
Side
IDer (ubehandlet, 4t DAS)
CDCP1Adhesion: Cell /ECM Y70790, 14CDK1Protein Kinase: CMGCY1585, 80PKCδProtein Kinase: AGCY31372, 10p38α MAPKProtein Kinase: CMGC * Y18259 , 35PRP4Protein Kinase: CMGC * Y84949, 45ERK2Protein Kinase: CMGC * Y18735, 31ERK1Protein Kinase: CMGC * Y20430, 27RPTPαOther SignalingY79827, 1β-actinCytoskeletonY5522, 24GSK-3Protein Kinase: CMGC * Y27919, 22Annexin A2Other SignalingY3019, 5Histone H4MiscellaneousY8919, 17Table 3. fosfotyrosin sider de hyppigst påviste hos ubehandlede HCT-116 xenografttumorer: Sammenlignet med dasatinibbehandlede dyr product: * området i aktivering løkke av protein kinase domene Forkortelser. CDCP1; CUB domene som inneholder protein 1; CDK1, Celledeling kontroll protein 2 homolog; ERK1, mitogenaktivert proteinkinase 3; ERK2, mitogenaktivert proteinkinase 1; GSK-3, glykogensyntasekinase-3 (alfa og beta); p38a MAPK, mitogenaktivert proteinkinase 14; PKCδ, Proteinkinase C delta-type; PRP4, Serine /treonin-protein kinase PRP4 homolog; RPTPα, Receptor-type tyrosin-protein fosfatase alpha. CSV Last ned CSV
CDCP1 pY707 (90 spektrale teller), PKCδ pY313 (72 spektrale teller), og PKCδ pY334 (14 spektrale tellinger) var blant de hyppigst identifiserte områder i ubehandlede xenografttumorer. Dasatinib behandling sterkt redusert identifisering frekvensen av alle de tre områdene (Tabell 3, tabell 4), i samsvar med deres blir mål av Src-familie kinaser. I motsetning til områder på CMGC kinaser (ikke anses å være fosforylert av dasatinib-sensitive kinaser) ble identifisert ved tilsvarende frekvenser i ubehandlede og dasatinibbehandlede svulster. Andre åpen dasatinib-responsive nettsteder blant de hyppigst identifisert i kjøretøy-behandlede tumorer inkludert pY798 på RPTPα og pY30 på Annexin A2 (Tabell 3). RPTPαpY798 ble identifisert i 27 spektra fra ubehandlede tumorer, men bare én gang i dasatinibbehandlede prøver.
Protein
funksjonsklasse
Side
IDer (ubehandlet, 4t Das)
RAIG-1Other SignalingY34715, 1PKCδProtein Kinase: AGCY33414, 0SHC1Other SignalingY42713, 0α-enolaseMetabolic EnzymeY4413, 3SHIP2Other SignalingY98611, 0Table 4. andre dasatinib-responsive fosfotyrosin nettsider bemerkelsesverdige identifisert i ubehandlede HCT-116 xenografttumorer: Sammenlignet med dasatinibbehandlede dyr
Forkortelser: PKCδ, Protein kinase C delta typen;. PRP4, Serine /treonin-protein kinase PRP4 homolog; RAIG-1, Retinsyre-indusert protein 3; SHC1, SHC-trans protein 1; SHIP2, fosfatidylinositol-3,4,5-trisphosphate 5-fosfatase 2. CSV ned CSV
Immunoblotting validerer dasatinib respons fra PKCδ pY313 og RPTPα pY798 nettsteder HCT-116 xenografttumorer
av de mest fremtredende dasatinib -responsive py områder identifisert fra phosphoproteomic analyse av HCT-116 xenografttumorer (Tabell 3, Tabell 4), phospho-spesifikke antistoffer er kommersielt tilgjengelig for PKCδ pY313, SHIP2 pY986 /987 og RPTPα pY798. Disse antistoffene ble brukt til å validere dasatinib respons av disse områdene i forhold til Src hemming (bestemt ved hjelp av en phosphospecific antistoff mot Src pY416 autofosforylerings stedet). For både PKCδ pY313 og RPTPα pY798 områder, immunblotting med phospho-spesifikke antistoffer indikerte en markert nedgang i fosforylering i 4 h dasatinibbehandlede svulster samtidig med Src hemming (figur 2A). Fosforyleringen status av disse restene returnerte til basislinjenivåer i nærheten av 24 timer etter behandlingen, noe som tyder på holdbarheten av Src-inhibering i denne modellen var forbigående med en enkelt administrering.
Immonoblot analyse av PKCδ pY313 og RPTPα pY798 i xenografttumorer i forhold til Src pY416 etter en enkelt farmakologisk dose (A) eller 5 daglige doser av dasatinib (B). Xenograft vev ble evaluert 4 t og 24 h følgende dasatinib eksponering. Både PKCδ pY313 og RPTPα pY798 korrelerer med Src hemming i HCT-116 xenografter. I tillegg til en enkelt dose, steady-state behandlingsregimer (B) resulterte i forlenget Src hemming målt 24 timer etter eksponeringen av dasatinib og korrelert med redusert nivå av PKCδ pY313 og RPTPα pY798.
For å evaluere effekten av dasatinib behandlingsvarighet på holdbarheten av Src hemming, HCT-116 svulster behandlet med 5 daglige doser av dasatinib ble vurdert av western blot analyse for å fastslå responsen av identifiserte rester etter steady-state Drug Administration.
