Abstract
i antikreftterapi mediert av en nanopartikkel-baserte medikamentleveringssystem (DDS), avhenger samlet effekt på frigjøring effektiviteten av last fra nanopartiklene i kreftcellene, så vel som spesifisiteten levering til svulstvev. Konvensjonelle liposom-baserte DDS har ingen mekanisme for spesifikt å frigjøre de innkapslede last inne i kreftceller. For å overvinne denne barrieren, har vi utviklet nanopartikler som inneholder en roman liposomal membran destabilisering peptid (LMDP) som kan destabilisere membraner ved spalting med intramembranøse proteaser på /i kreftceller. Calcein innkapslet i liposomer modifisert med LMDP (LMDP-lipo) ble effektivt frigitt i nærvær av en membranfraksjon som inneholder en LMDP-spaltbar protease. Frigivelsen ble hemmet av en protease-inhibitor, noe som tyder på at LMDP-lipo effektivt kunne slippe lasten inn i cellene i respons til en cancer-spesifikk protease. Dessuten, når LMDP-lipo inneholdt fusogene lipider, ble utgivelsen av last akselerert, noe som tyder på at fusjon av LMDP-lipo med cellemembraner var det første skritt i den intracellulære levering. Time-lapse mikroskopiske observasjoner viste at utgivelsen av last fra LMDP-lipo oppstod rett etter sammenslutning av LMDP-lipo med målceller. Følgelig kan LMDP-lipo være en nyttig nanopartikkel i stand til effektiv frigjøring av last spesifikt inn målrettede kreftceller
Citation. Itakura S, Hama S, Ohgita T, Kogure K (2014) Utvikling av Nanopartikler innarbeide en Novel liposomal Membran destabilisering Peptide for effektiv utløsning av Cargos til kreftceller. PLoS ONE 9 (10): e111181. doi: 10,1371 /journal.pone.0111181
Redaktør: Pedro V. Baptista, Universidade Nova de Lisboa, Portugal
mottatt: 23 juli 2014; Godkjent: 26 september 2014; Publisert: 24 oktober 2014
Copyright: © 2014 Itakura et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av JSP KAKENHI Grant Numbers 25860030, 26-9314, og av Kyoto Pharmaceutical University Fond for fremme av vitenskapelig Forskning. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i cancerterapi, et medikamentleveringssystem (DDS) som spesifikt kan levere en rekke terapeutiske midler til tumorvev er et kraftig verktøy for å oppnå kreftcelle-spesifikk terapi uten bivirkninger. Rask fremgang i genomisk og proteomikk forskning har ført til identifisering av molekyler som medierer utvikling og progresjon av kreft. Det har således blitt mulig å designe mer spesifikke terapeutiske midler mot kreftceller. Generelt er svært spesifikke medikamenter så som peptider, antistoffer, proteiner og nukleinsyrer er høy molekylvekt (HMW) agenter. Imidlertid er klinisk anvendelse av mange HMW midler begrenset på grunn av deres raske nedbrytning av enzymer i blodet så vel som deres utilstrekkelig levering inn i cellene ved deres målrettet mot sider [1]. For å løse disse problemene, må HMV-agenter være innkapslet i nanopartikler som liposomer eller polymere miceller i stand til å beskytte last fra enzymatisk nedbrytning og oppnå effektiv intracellulær levering. I dagens nanopartikkel-baserte DDS, modifikasjon med polyetylenglykol (PEGyleringen) er en viktig strategi for sin leveranse til svulstvev via økt permeabilitet og oppbevaring (EPR) effekter som PEGylerte bærere kan sirkulere i lange perioder [2], [3]. Imidlertid er bare ~ 10% av de injiserte molekylene nå tumorvevet [4]. Derfor er det plass for forbedret levering. Videre tumor levering via EPR effekter avhenger av antallet av umodne tumorkarene. Følgelig leveringseffektiviteten i krefttyper med lav vaskulær tetthet, for eksempel kreft i bukspyttkjertelen, er mindre effektiv [5].
Selv om utviklingen av anticancer DDS har raskt utviklet seg, er det ingen alternativ strategi stand til å forbedre leveringen av nanopartikler av EPJ-effekter. Derfor er det nødvendig å øke den terapeutiske effekt av de innkapslede anti-kreftmidler for å kompensere for lav virkningsgrad levering til tumorvev. Når anti-kreftmidler er innkapslet i nanopartikler, avhenger terapeutisk effekt på mengden av frie midler frigjøres fra nanopartikler. Derfor er utgivelsen effektiviteten av last fra nanopartikler et viktig skritt i å styrke terapeutiske effekten. For å oppnå kreftcelle-spesifikk toksisitet uten uønskede bivirkninger, må last innkapslet i nanopartikler bli frigitt når nanopartikler blir levert til tumorvev, ikke under sirkulasjon. I det siste, for å oppnå tumorspesifikk frigjøring av last, har ulike nanopartikler er utformet for å gjøre bruk av tumormiljøet. For eksempel har nanopartikler som kan frigi i tumorspesifikke sure ekstracellulære omgivelser blitt utviklet [6] – [8]. Imidlertid, når en nanopartikkel svarer til det ekstracellulære miljøet, blir lasten slippes utenfor cellene. Denne utformingen skaper et nytt teknisk problem fordi mange HMW midler slik som nukleinsyrer og proteiner skal leveres og utgitt i tumorcellene. I tillegg spesifikk frigjøring av en lav molekylvekt (LMW) anticancermiddelet inne i tumorcellene viste mer effektiv anticancer aktivitet enn ekstracellulære frigjøringen [9].
I denne forbindelse, en DDS bærer stand til å frigi en last inn i kreft celler har blitt utviklet. For eksempel, avhengig av en nukleinsyre som bærer på proteinkinase Cα (PKCα), som blir overuttrykt i kreftceller [10], [11]. Dette bærer er et kompleks av nukleinsyrer og kationiske polymerer som omfatter et substrat sekvens som kan bli målrettet av PKCα. Deres elektrostatisk interaksjon er redusert ved fosforylering av substratet sekvens på polymeren ved PKCα, hvoretter nukleinsyre frigjøres. En annen tilnærming utnyttet forhøyet ATP-konsentrasjonen i kreftceller. Det vil si, et middel innkapslet i chaperonin frigis etter en ATP-mediert trigger [12]. Men i disse frigjøringssystemer, er levering av agenter begrenset og
in vivo
programmet er vanskelig. Således blir ytterligere forbedringer i farmakokinetikk og intracellulære dynamikk nødvendig. I denne forbindelse, kan liposomer som innkapsler HMW medikamenter og LMV midler. Hydrofobe midler kan bli gjennomført i lipidmembranen og hydrofile stoffer kan beholdes i den vandige fase [13]. Således allsidigheten av liposomer gjør dem vi spennende for utforming av nye DDSS.
Når det gjelder frigjøring av last fra liposomer, mange systemer har blitt utviklet for å indusere fusjon av liposomale membranene med endosomale-lysosomal membraner i det sure miljø av endosomet-lysosomet [14]. Men når effektiviteten av flukt fra endosomet er lav, kan narkotika gjennomgå lysosomal degradering og endocytic resirkulering [15]. Derfor er forbedringer i legemiddelmeldingen via membranfusjon nødvendig. For dette formål, utviklet vi et system som destabiliserer den liposomale membranen under fusjon med kreft cellemembraner. Vi fokusert på membranen indre protein γ-sekretase av kreftceller. Dette intramembranøse protease kan spalte det transmembrane domenet av substratet proteinet hakk [16], [17]. For å bruke denne mekanismen, innlemmet vi peptider som etterligner det transmembrane domenet av hakk i lipidmembranen av liposomene. Når således liposom-membranen delvis smelter sammen med cellemembranen, innkapslede last ville bli sluppet inn i cellene ved destabilisering av liposomale membranene ved intramembranøse γ-sekretase. Ved hjelp av dette konseptet, innlemmet vi en liposomal membran destabilisering peptid (LMDP) i liposomer (LMDP-lipo) som etterlignet den transmembrane domene Notch. Her viser vi at utgivelsen av last fra LMDP-lipo ble lydhør overfor y-sekretase i kreftcellemembraner.
Materialer og metoder
Material
Egg fosfatidylcholin ble hentet fra NOF Corporation (Tokyo, Japan). 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propan (DOTAP) og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ble kjøpt fra Avanti Polar Lipid (Alabaster, AL, USA). Cell Tracker CM-Dil ble hentet fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Cholesteryl hemisuccinate (CHEMS) og calcein ble kjøpt fra Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). Bio-perler SM-2 adsorbenter ble kjøpt fra BIO-RAD (Hercules, CA, USA). HUEhT-2-celler, en udødeliggjort human navlevene endotelceller (HUVEC) linje etablert ved elektroporering av Pires-hTERT-hygromete, HeLa-celler, en human cervical epithelioid carcinom-cellelinje, og MCF-7-celler, en human brysttumorcellelinje, ble hentet fra JCRB Cell Bank (Osaka, Japan). A549 celler, en human lunge adenokarsinom cellelinje, ble levert av Riken Cell Bank (Saitama, Japan). Den liposomale membranen destabilisering peptid (LMDP), LHLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLSRKRRR, ble syntetisert ved SCRUM (Tokyo, Japan). En fluorescens-quenching peptidsubstrat, NMA-GGVVIATVK (Dnp) RRR-NH
2 og en inhibitor av γ-sekretase, N- [N- (3,5-Difluorophenacetyl) -L-alanyl] -S-fenylglycin t -butylester (DAPT), ble oppnådd fra Peptide Institute, Inc. (Osaka, Japan). 3 – [(3-Cholamidopropyl) dimetylammonio] -2-hydroxypropanesulfonate (CHAPSO) ble kjøpt fra Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japan)
Membran isolert fra celler
Membranfraksjonen ble fremstilt i henhold. til tidligere rapporter [18]. Alle prosedyrer ble utført på is. Dyrkede HeLa-celler, A549-celler, MCF-7 celler og HUEhT-2-celler (ca. 1 x 10
8 celler) ble pelletert. Celler ble resuspendert i en buffer inneholdende 20 mM Hepes, pH 7,5, 50 mM KCl, 2 mM EGTA, og protease-inhibitor cocktail, Complete mini (Roche Applied Science), og homogenisert ved hjelp av 15 slag av en Dounce homogenisator med en stram pistill. De cellulære Homogenatene ble sentrifugert ved 800 x
g
i 10 min og rehomogenisert som ovenfor. Supernatantene ble sentrifugert ved 100.000 x
g
i 1 time og resuspendert i samme buffer og recollected ved sentrifugering ved 100.000 x
g
i 30 minutter ved hjelp av en Optima XL-90 (Beckman Coulter) . Membraner ble resuspendert i 20 mM HEPES, pH 7,0, 150 mM KCl, 2 mM EGTA, 1% (w /v) CHAPSO, og Complete mini og oppløst ved 4 ° C i 1 time med ende-over-ende-rotasjon. De oppløseliggjorte Membranene ble sentrifugert ved 100.000 x
g
i 1 time, og supernatantene ble samlet. Den totale proteinkonsentrasjonen ble bestemt med en BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific).
γ-sekretaseaktiviteten måling
For å måle γ-sekretase aktivitet, oppløste membranpreparater (15 mikrogram total protein) ble inkubert med åtte uM fluorescens-slukking peptid-substrat ved 37 ° C over natten og sentrifugert ved 16100 x
g
i 15 min. Fluorescensen av supernatantene ble målt ved Plate Infinite M200 (TECAN) med en eksitasjonsbølgelengde på 355 nm og emisjonsbølgelengde på 440 nm.
Fremstilling av LMDP-lipo
Tynne Lipidfilmene sammensatt av EPC , EPC /DOPE /DOTAP (4/4/1), EPC /DOPE /CHEMS (4,5 /4,5 /2) i et glassrør ble hydratisert i PBS (-) eller 30 mM kalsein-løsning i PBS (-) i 10 min , etterfulgt av ultralydbehandling i 5 minutter i et bad-sonikator typen (NEY). Liposomene ble blandet med 1% Triton X-100 og inkubert ende-over-ende i 1 time. Ett mM LMDP oppløst i 1% Triton X-100 ble tilsatt til liposomet oppløsning (3-5 mol%) og inkubert ende-over-ende i 1 time. Deretter ble SM-2 bio-perler tilsatt til lipid-LMDP-detergentløsning i en time ved en perler-til-vaskemiddel-forhold på 30 (w /w) for å fjerne detergent. Den resulterende oppløsning ble sentrifugert ved 16000 x
g
i 10 minutter og supernatanten liposom oppløsning ble oppsamlet. For liposomer inneholdende calcein ble fri calcein fjernet ved anvendelse av en Sephadex G-50-kolonne ekvilibrert med PBS (-). Lipidkonsentrasjonen av liposomer ble bestemt ved kolin oxidase-DAOS metode (fosfolipider C-test Wako kit). Partikkelstørrelse og overflate potensialet i preparerte liposomer ble målt med en Zetasizer nano (Malvern Ins. Ltd.).
LMDP spalting aktivitet ved γ-sekretase
For å studere LMDP spalting av γ-sekretase, den konkurrerende inhiberende virkning av LMDP eller LMDP-lipo på spaltning av peptidet substrat (den samme som ble brukt i 2,2) ble evaluert. De oppløste membranpreparater av A549 (16,5 ug totalt protein) ble inkubert med 5 mM peptidsubstrat og 0, 5, 10, 50 eller 100 uM LMDP eller LMDP-lipo som LMDP-konsentrasjonen ble holdt konstant ved 37 ° C over natten. Deretter, ble fluorescensintensiteten målt som beskrevet i 2.2.
spaltingen av LMDP ble også evaluert ved hjelp av HPLC-analyse. De oppløste membranpreparater av A549 (16,5 ug totalt protein) ble inkubert med 100 pM LMDP eller LMDP-lipo- ved 37 ° C i 1 time. LMDP ved en konsentrasjon på 100 uM hadde inhiberende virkninger i konkurrerende hemming studier og inkubasjonstiden (1 time) ble matchet med reaksjons tilstand i calcein frigivelse analysen. LMDP-lipo ble solubilisert med 1% Triton X-100, og den LMDP tilbake i oppløsning, ble påvist ved væskekromatografi (HPLC) ved anvendelse av Alliance system (Waters, Milford, MA, USA) koblet til en kolonne av Sunfire C18 ( 5 mikrometer, 4,6 × 150 mm, Waters, Milford, MA, USA). Den mobile fase besto av 0,1% TFA i H
2O (mobil fase A) og /acetonitril i 0,1% TFA (elueringsmiddel B). Gradienten ble startet med en innledende grad på 80% mobilfase A og 20% mobil fase B, etterfulgt av en lineær gradient fra 80 til 10% mobil fase A i 20 min. Strømningshastigheten var 0,3 ml /min og Detekteringsbølgelengden var 220 nm.
Calcein utgivelsen analysen
For å studere utgivelsen av last fra liposomer, Kontroll-lipo eller LMDP-lipo inneholder calcein var inkubert med solubiliserte membraner (lipid /protein = 2,0 (w /w)) eller PBS eller 1% Triton X-100 ved 37 ° C i 1 time i nærvær eller fravær av den γ-sekretase inhibitor DAPT. De oppløseliggjorte Membranene ble preinkubert med γ-sekretase inhibitor DAPT (10 pM) ved 37 ° C i 30 minutter før behandling med liposomer. Den frigjorte calcein ble analysert ved å måle intensiteten av fluorescens ved hjelp av en plate Infinite M200 (TECAN) med en eksitasjonsbølgelengde på 490 nm og emisjonsbølgelengde på 515 nm. Prosentandelen av calcein frigivelse ble beregnet ved følgende formel:
Calcein Slipp (%) = [(F-F
0) /(F
100-F
0)] x 100, hvor F, F
0 og F
100 var fluorescensstyrkene til calcein etter inkubering i nærvær av en membranfraksjon, i PBS og 1% Triton, respektivt.
Confocal laserskannings mikroskopiske observasjoner av LMDP-lipo
A549-celler ble dyrket på 0,002% poly-L-lysin (PLL) belagte 96-brønners plater (BD bilde Falcon) ved en tetthet på 1 x 10
4 celler /brønn i 24 timer i DMEM inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS). Etter vasking med PBS (-), ble cellene behandlet med kontroll-lipo eller LMDP-lipo- inneholdende 0,2 mol% CM-Dil og 30 mM kalsein i 1 time i serumfritt DMEM. CM-Dil og calcein var glade med han /Ne (543 nm) og Ar (488 nm) lasere, henholdsvis. En serie bilder ble oppnådd ved konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM) (LSM 510 META, Carl Zeiss Co Ltd, Jena, Tyskland) er utstyrt med en olje nedsenking objektiv (Plan-Apochromat 63 /NA1.4). For å hindre γ-sekretaseaktiviteten og endocytotic vei, A549-celler ble dyrket som ovenfor og cellene ble pre-inkubert i serumfritt DMEM inneholdende 50 uM DAPT eller 0,4 M sukrose ved 37 ° C eller 30 min, 2,5 mM amilorid ved 37 ° C i 10 minutter og 5 mikrogram /ml FilipinIII ved 37 ° C i 1 time, etterfulgt av behandling med liposomer ved 37 ° C i 1 time og observert av CLSM, som beskrevet ovenfor. For en detaljert studie av calcein utgivelsen, ble liposomer observert av time-lapse avbildning av liposomer i levende A549 celler. Cellene ble dyrket på PLL-belagte 35 mm glassbunn retter (Iwaki) ved en tetthet på 2 x 10
5-celler /skål i 24 timer i DMEM inneholdende 10% FBS. Cellene ble vasket med PBS (-) og behandlet med LMDP-lipo inneholdende 0,2 mol% CM-Dil og 30 mM kalsein ved 4 ° C i 10 minutter i serumfritt DMEM. Etter fjerning av liposomer, ble cellene vasket 3 ganger med PBS (-), etterfulgt av tilsetning av friskt serumfritt DMEM. Tid lapse avbildning ble kjøpt ved hjelp av et Nikon A1 CLSM (Nikon Instruments Inc., Melville, USA) utstyrt med en olje-nedsenking objektiv (Plan Apo VC 60X 1,4 N.A.). Prøvene ble holdt ved 37 ° C og 5% CO
2 under alle avbildnings eksperimenter. Laserlys ved 488 nm og 561 nm ble brukt til å eksitere calcein og DII, respektivt. Time-lapse oppkjøpet ble konfigurert til å ta bilder av det samme feltet hvert 30 sek over 30 min. Tiden lapse avbildning av ca tre prikker /celle for 5 celler av hver prøve ble analysert ved hjelp av NIS-Elements (Nikon Instruments Inc., Melville, USA).
Statistisk analyse
Statistisk signifikans ble bestemt ved hjelp av Student t-tester og Tukey-Kramer HSD-tester. Forskjeller med p-verdier på mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
System design. Utgivelsen av last i cellene gjennom γ-sekretase-avhengige spalting av LMDP innlemmet i den liposomale membranen
Vi utviklet et system hvor et substrat peptid med γ-sekretase ble inkorporert inn i liposomholdige membraner. Slike liposomer bør være i stand til å bære en last og effektivt slippe den til kreftceller. Peptidet, som vist i fig. 1, var sammensatt av 29 aminosyrerester som utgjorde et hydrofilt område inne i cellen og en hydrofob sekvens av det transmembrane domenet av Notch. Det ble kalt «Liposomalt Membran destabilisering Peptide» (LMDP). Den sekundære strukturen til LMDP ble forutsagt ved hjelp av Sosui programvare [19]. Som illustrert i fig. 1, ble det vist at 23 rester av den N-terminale ende antatt en spiralformet struktur og inn i membran, og 6 rester fra den C-terminale side var sterkt hydrofile og var plassert utenfor lipidmembranen. Derfor er LMDP ble utformet for å trenge inn i det ytre lipid bilaget. I tillegg kunne den LMDP bli spaltet ved 3 punkter ved γ-sekretase [17]. For å bestemme spesifisiteten av LMDP for γ-sekretase, utførte vi en homologi leting etter LMDP ved BLAST. Det var ingen protein med høy homologi med LMDP. Således LMDP kanskje ikke være et substrat for proteaser høyt uttrykte av kreftceller, slik som matriks-metalloproteinase. Således, når den inkorporeres i liposomer (LMDP-lipo), spalting av LMDP bør destabilisere det ytre lipid bilaget ved å utløse membranfusjon, etterfulgt av frigjøring av last inn i cellen.
Dette bilde viser konseptet av bærerne omfatter LMDP inn i liposomal membran (LMDP-lipo). Det ytre lipid bilaget membran av LMDP-lipo blir destabilisert ved å spalte LMDP som en utløser for membranfusjon. Destabilisering fremmer laster slippe inn i cellen.
Den spalting av LMDP av γ-sekretase
For å bekrefte at LMDP ble spaltet av γ-sekretase, vi valgte A549 (human lunge karsinom), MCF-7 (human brystcancer) og HeLa (human cervical cancer) cellelinjer, hvor høy aktivitet av γ-sekretase hadde blitt rapportert [20] – [22]. Den γ-sekretase aktivitet i membranfraksjonen av disse celler ble undersøkt ved anvendelse av fluorescerende substrat peptid prober som kan spaltes ved γ-sekretase. I tillegg ble HUEhT-2 (en human vaskulær endotelial cellelinje) også undersøkt som en normal kontroll. Før spaltning ble fluorescensen til substratet peptidene stanset på grunn av fluorescens-resonans energioverføring (FRET) mellom en bråkjøling gruppe (Dnp) og en fluorescerende gruppe (NMA) ved den N-terminale ende av peptidet på tvers av spaltningssetet. Således fluorescens ville bli vist med eliminering av FRET på grunn av spalting av peptidene. Slike peptid-prober blir ofte brukt til evaluering av γ-sekretaseaktivitet, [18]. Vi fant at y-sekretase aktiviteter var nesten det samme i HeLa-celler og normale HUEhT-2-celler, men var signifikant høyere i MCF-7 og A549-celler (Fig. 2a). I tillegg ble ekspresjon av presenilin-1, som er et aktivt senter av γ-sekretase, undersøkt ved hjelp av strømningscytometri. Som vist på fig. S1, ekspresjon av presenilin-1 ble observert på samme nivå i alle celler. Den spesifikke aktivitet av γ-sekretase (γ-sekretaseaktiviteten /presenilin-1-ekspresjon) ble beregnet og γ-sekretase aktivitet var høyere i MCF-7 og A549-celler enn i andre cellelinjer. Siden A549-celler hadde større plasmamembranområder enn MCF-7-celler, ble de foretrukket for intracellulær frisetting analyser.
(a) γ-sekretase aktivitet i dyrkede celler. Fluorescensen peptid probe ble inkubert med membranfraksjoner fra HUEhT-2, HeLa, MCF-7 og A549-celler. (B) kompetitiv hemming av LMDP. Peptidet probe og LMDP ble inkubert ved de angitte konsentrasjoner i membranfraksjonen av A549-celler ved 37 ° C over natten. Verdier og barer representerer midler og SD, henholdsvis. (C) Representative kromatogrammer av LMDP med eller uten membranfraksjonen som bestemt ved HPLC-analyse fra tre uavhengige eksperimenter. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001 versus HUEhT-2 (a), 0 mikrometer LMDP (b), n = 3.
Membranfraksjonen ble isolert fra A549 celler og ble vurdert for LMDP cleavage aktivitet . For å undersøke interaksjonen av LMDP med γ-sekretase, undersøkte vi kompetitiv hemming av LMDP på spaltningen av det fluorescerende substrat peptidet sonde med en membranfraksjon inneholdende γ-sekretase. Fluorescensintensiteten av substratet proben var signifikant redusert i en LMDP konsentrasjonsavhengig måte (IC
50:29 pM) (Fig. 2b). Dette resultatet antydet at spaltingen av fluorescerende substrat peptid med γ-sekretase var konkurranse forhindret av LMDP. En betydelig reduksjon i fluorescensintensitet ble ikke observert når det ble undersøkt på samme måte ved hjelp av et annet polypeptid som hadde en lignende størrelse (30 residuer) (fig. S2). Disse resultatene antydet at LMDP sekvensen ble spesifikt gjenkjent av γ-sekretase.
Spaltningen av LMDP ved γ-sekretase var ved undersøkt ved HPLC. Toppområdet av LMDP ble redusert på 22,6 ± 10,5% i nærvær av en membranfraksjon med γ-sekretase aktivitet (tabell 1) og bekrefter derved spaltning av LMDP. Fig. 2c viser et representativt kromatogram av LMDP behandlet med eller uten membranfraksjonen. Disse resultatene antydet at syntetisk LMDP ble spaltet av en A549 cellemembranen brøkdel inneha høy γ-sekretase aktivitet.
Bygging av LMDP-lipo
LMDP ble innlemmet i liposomale membraner av et vaskemiddel fjerning metode. LMDP ble solubilisert med et overflateaktivt middel (1% Triton X-100) og ble blandet med fosfolipid. Deretter ble det overflateaktive middel i lipid /LMDP blanding fjernes for å fremstille liposomer som omfatter LMDP av en vulst adsorpsjon fremgangsmåte som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Vi har fastslått at 2,3 ± 0,2% LMDP ble inkorporert i liposomene ved HPLC-analyse. Calcein ble anvendt som en modell last og er innkapslet i liposomene. Vi vurderte lekkasje av calcein i nærvær av en A549 cellemembranfraksjon. Ved å innlemme LMDP i liposomer bestående av EPC, var det ingen forskjell i lekkasjerate av calcein sammenlignet med liposomer uten LMDP (fig. 3). I dette system har det transmembrane domenet av substratet peptidet i de liposomholdige membraner som skal spaltes ved hjelp av y-sekretase i cellemembranen. Fordi det var nødvendig for å optimalisere lipid-sammensetningen av liposomene, forsøkte vi å gi liposomer membranfusjon evne.
Kontroll-lipo besto av EPC eller EPC /DOPE /DOTAP (DOTAP), eller EPC /DOPE /CHEMS (Chems). LMDP-lipo inneholdt 5 mol% LMDP. De ble inkubert med membranfraksjonen fra A549-celler ved 37 ° C i 1 time. Hvite og svarte kolonner viser Kontroll-lipo og LMDP-lipo, henholdsvis. Verdier representerer hjelp av tre individuelle eksperimenter. Barer representerer SD. *, P . 0,05
Dermed DOPE ble inkludert i lipid sammensetning. Dessuten, siden LMDP hadde et hydrofobt transmembrandomene og et hydrofilt område med basiske aminosyrer (arginin og lysin) (fig. 1), antatt vi at den elektrostatiske interaksjon mellom overflateladningen av liposomene og ladningen av den hydrofile området ville påvirke begge inkorporering av LMDP i liposomer og deres funksjonalitet. Derfor har vi utarbeidet membran fusion liposomer med positive eller negative ladninger inneholder DOTAP eller CHEMS i EPC /DOPE og innlemmet LMDP i hver.
lekkasje av innkapslet calcein fra negativt ladet EPC /DOPE /Chems liposomer økt tre ganger i nærvær av en membranfraksjon som inneholder γ-sekretase. På den annen side, når sammensetningen inkluderte kationisk lipid DOTAP, lekkasje av calcein ble ikke økt med LMDP (fig. 3). Resultatene antydet at inkludering av CHEMS og DOPE med EPC var nødvendig for å optimalisere funksjonaliteten til LMDP. De fysiokjemiske egenskapene til liposomer og deres sammensetninger er oppsummert i tabell 2.
Mekanismen for medikamentfrigjøring ved LMDP-lipo
bestemmes først om LMDP ble spaltet ved γ-sekretase når det ble inkorporert i liposomer. Således, testet vi muligheten av LMDP-lipo til kompetitivt å inhibere spaltning av et fluorescerende substrat sonde av y-sekretase. Vi har bekreftet at spaltningen av det fluorescerende peptidet proben ble signifikant inhibert selv når LMDP-lipo ble tilsatt til membranfraksjonen inneholdende γ-sekretase (fig. 4a). Selv om den hemmende effekten av LMDP-lipo var mindre enn LMDP alene, ble det bekreftet at LMDP i liposomholdige membraner kunne reagere med γ-sekretase. Spaltingen av LMDP i liposomale membranene ble også evaluert ved hjelp av HPLC i nærvær av den γ-sekretase-inneholdende membranfraksjonen. Toppområdet av LMDP i liposomene var redusert med omtrent 36,8 ± 7,0%, og spaltingen av LMDP er vist i nærvær av en membranfraksjon (tabell 3). Fig. 4b viser de representative kromatogrammer av LMDP-liposom med eller uten membranfraksjonen.
(a) konkurrerende inhibering av LMDP i liposomer. Fluorescensen peptid probe ble inkubert med kontroll-lipo (EPC /DOPE /CHEMS) eller LMDP-lipo- (EPC /DOPE /CHEMS /3 mol% LMDP) ved de indikerte LMDP konsentrasjonene i nærvær av membranfraksjonen av A549-celler ved 37 ° C over natten. Hvite og svarte kolonner viser Kontroll-lipo eller LMDP-lipo, henholdsvis. (B) Representative kromatogrammer av LMDP-liposomer med eller uten membranfraksjonen som bestemt ved HPLC-analyse fra tre uavhengige eksperimenter. (C) størrelsedistribusjonen av liposomer i nærvær av membranfraksjon oppnådd fra A549-celler med eller uten γ-sekretase inhibitor ble målt ved anvendelse av Zetasizer nano. Heltrukken linje og stiplet linje indikerer Kontroll-lipo og LMDP-lipo, henholdsvis. (D) polydispersitetsindeks (PDI) av toppen ved hjelp av Ctrl-lipo eller LMDP-lipo. Hvit, grå og sorte kolonner indikerer liposomer alene, liposomer i nærvær av en A549 cellemembranfraksjon eller liposomer, i nærvær av en membranfraksjon med 10 uM DAPT, respektivt. (E) Overflod fordeling av toppen for Kontroll-lipo (svarte sirkler) og LMDP-lipo (svarte trekanter) på samme vilkår som (d). (Verdier og barer representerer midler og SD henholdsvis *, P . 0,05 og ***, P 0,001 versus 0 mikrometer LMDP (a), Kontroll-lipo (c, d), n = 3.
Deretter vi evaluert endring av LMDP-lipo partikkelstørrelse i nærvær av γ-sekretase-inneholdende membranfraksjonen. Vi evaluerte også innvirkningen av partikkelstørrelse i nærvær av N- [N- (3, 5-difluorophenacetyl) -L-alanyl] -S-fenylglycin-t-butylester (DAPT), en γ-sekretase inhibitor. Den hemmende virkning av DAPT ble bekreftet ved hjelp av et substratpeptid sonde. Nærmere bestemt, γ-sekretaseaktiviteten ble inhibert med omtrent 60% ved tilsetning av DAPT (fig. S3). fig. 4b viser at partikkelstørrelsesfordelingen for LMDP-lipo ble bred sammenlignet med kontroll-lipo i nærvær av en membranfraksjon. Denne brede fordeling ble hemmet ved behandling med DAPT. polydispersitetsindeksen (PDI) av LMDP-lipo var signifikant økt i nærvær av membranfraksjonen i forhold til kontroll-lipo, en forskjell som ble redusert ved behandling med DAPT. I tillegg er PDI i Kontroll-lipo behandlet med membranfraksjonen ble svakt øket i sammenligning med det i kontroll-lipo uten membranfraksjonen. Imidlertid, denne økningen ble ikke endret ved ko-behandling med den γ-sekretase inhibitor, DAPT, noe som tyder på at økningen av PDI i kontroll-lipo var på grunn av tilstedeværelsen av membranfraksjonen. (Fig. 4c). Den overflod fordeling av den hovedtopp av liposomene ble sammenlignet i fravær eller nærvær av membranfraksjonen. Den mengde av den hovedtopp av LMDP-lipo ble signifikant redusert i nærvær av membranfraksjonen. Disse endringene ble undertrykt av DAPT, og det ble ikke observert i kontroll-lipo (Fig. 4d). Disse resultatene antydet at størrelsesfordelingen ble endret på grunn LMDP ble spaltet ved γ-sekretase, forårsaker destabilisering av den liposomale membranen og endre partikkelstørrelse.
γ-sekretase-avhengige frigjøring av last fra LMDP-lipo
Vi undersøkte om utgivelsen av last avhengig av γ-sekretase aktivitet. Således ble LMDP-lipo innkapsle calcein blandet med membranfraksjonen fra A549-celler, HeLa-celler, MCF-7-celler eller HUEhT-2-celler. Når LMDP-lipo ble blandet med membranfraksjoner isolert fra A549 celler og MCF-7-celler med svært høye y-sekretase aktivitet, økt lekkasje av calcein i forhold til kontroll-lipo. Den økte lekkasje ble betydelig undertrykt ved behandling med DAPT. På den annen side, calcein lekkasje ikke øke når membranfraksjoner av HeLa-celler og normale HUEhT-2-celler (noe høy eller lav γ-sekretase aktivitet, respektivt) ble anvendt (Fig. 5). Derfor resultatene tyder på at utgivelsen av last fra LMDP-lipo er avhengig av høy γ-sekretase aktivitet i kreftceller.
Kontroll-lipo (EPC /DOPE /CHEMS) eller LMDP-lipo (EPC /DOPE /CHEMS /5mol% LMDP) ble inkubert i nærvær av membranfraksjonen fra HUEhT-2-celler (hvite kolonner), HeLa-celler (stiplede kolonner), MCF-7-celler (skraverte søyler), A549-celler (svarte kolonner) eller A549 celler med 10 pM DAPT (grå kolonner) ved 37 ° C i 1 time. Data representerer middel ± S.D. (N = 3-7) *, P 0,05, **, P 0,01 og ***, P . 0.001
Intracellulær utgivelsen av last fra LMDP-lipo
