Abstract
En serie nye antracen L-rhamnopyranosides forbindelser ble utformet og syntetisert og deres anti-proliferative aktivitet på kreftcellelinjer ble undersøkt. Vi har funnet at en derivatet S-8 (EM-D-Rha) sterkt hemmet celleproliferasjon i et panel av forskjellige humane cancercellelinjer inkludert A549, HepG2, OVCAR-3, HeLa og K562 og SGC-790 cellelinjer, og viste IC50 verdier i lave mikro-molar områder, som er ti folder mer effektiv enn emodin. I tillegg har vi funnet EM-d-Rha (3-(2”,3”-Di-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-2’,3’-di-
O
-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl)-emodin) vesentlig indusert cellulær apoptose av HepG2 og ovčar-3 celler i tidlig vekstfase. Videre EM-d-Rha ført til en reduksjon av mitokondriell transmembranpotensialet, og oppregulert uttrykkelig av celler apoptose faktorer i en treringstrinnet og tidsavhengig måte. Resultatene indikerte EM-D-Rha kan hemme veksten og proliferasjonen av HepG2 celler gjennom reaksjonsveien av apoptose-induksjon, og den mulige molekylære mekanismen kan skyldes aktivering av indre apoptotisk reaksjonsvei signal
Citation:. Xing jy, Song Gp, Deng Jp, Jiang Lz, Xiong P, Yang Bj, et al. (2015) Antitumor Effekter og Mekanisme Novel emodin Rhamnoside Derivater mot humane kreftceller
In Vitro
. PLoS ONE 10 (12): e0144781. doi: 10,1371 /journal.pone.0144781
Redaktør: Gautam Sethi, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, SINGAPORE
mottatt: 30 juli 2015; Godkjent: 22 november 2015; Publisert: 18.12.2015
Copyright: © 2015 Xing et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Major Program of Science and Technology Program for Guangzhou (PX, 11C32100704), Kina, Reserch Prosjekt for kinesisk medisin Administration i Guangdong-provinsen (px, 2.010.276), Kina og Natural Science Foundation for Ungdom (GPS pX, B020602), Kina. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
emodin (3-metyl-1, 6, 8-trihydroxyanthraquinone) (figur 1), en utbredt antrakinon, er avledet fra røtter og jordstengler av
Rheum palmatum L
., og andre planter som
Polygonum
,
trollheggfamilien
,
Leguminosae
, og
Lilje
. Emodin er en viktig del av kinesiske urter og strukturelt ligner antracyklin. Den har samme trisykliske planar kromofor skjelett som visse antitumor antibiotika, for eksempel daunorubicin og mitoxantrone som kan intercalate DNA av kreft celler. Antitumoraktiviteten av emodin har blitt godt dokumentert. Det ble demonstrert at emodin besitte antiproliferation, forebygge kreft metastase [1-3], sensibiliserende kreftceller til radioterapi og kjemoterapeutiske midler [4-6], anti-angiogene [7, 8] og reverseringsmultimedikamentresistent (MDR) av kreftceller [ ,,,0],9]. Det har blitt bekreftet at emodin er et bredspektret hemmende middel av kreftceller, inkludert leukemi [10, 11], lungekreft [12-14], human tunge squamous kreft [15, 16], tykktarmskreft [17, 18] , galleblæren kreft [19-21], bukspyttkjertelkreft [22-24], brystkreft [25-27], menneskelig livmorhalskreft [28] og leverkreft celler [29-31]. De kreftmekanismer emodin var involvert i mange biologiske pathways [32-34], slik som kasein kinase Ⅱand ERK1 /2. Imidlertid er emodin en utilfredsstillende kjemoterapeutisk middel mot kreft på grunn av sin mangel på bioaktivitet, relativt dårlig biotilgjengelighet og toksisitet in vivo. Til tross for dette, emodin, som en naturlig forbindelse, gir godt grunnlag for å utvikle nye chemoprevention og kjemoterapeutiske midler mot kreft (fig 1). Siden potensielle kandidater fra naturlige produkter ble regnet som en av de mest produktive strategier i dagens medisiner og utvikling [35].
Til nå strukturell endring av emodin hovedsakelig involvert transformasjon av sidekjeden , inkludert metyl, hydroksyl og arylring parti. Faktisk ble det vist at innføringen av sidekjeder slik som polymethyleneamine, sukker eller heterocyklus til emodin kan forbedret antitumoraktivitet [36-38]. I tillegg har de andre derivater som oppnås ved å innføre aminogrupper og glykosidbindinger viste også høyere anticancer aktivitet [39-41]. Emodin glycoside derivat har blitt isolert fra
R
.
nepalensis
,
trollheggfamilien
planter [42],
Rhamnus frangula L
. [43] og
Rumex japonicus Houtt
. [44]. Noen naturlige emodin glycoside derivater som
frangulin B Hotell og
2
,
3-di-O-acetylfrangulin A product: [45-47], viste signifikant høyere antitumoraktivitet enn emodin. Disse studiene viste at tilsetningen av sukkerkjeder på C3-OH sete på emodin molekylet ikke bare øket sin løselighet, men også betydelig forbedret sin anti-tumoraktivitet [46]. Så langt har imidlertid forskningen på emodin derivater av glykosylering modifikasjoner er sjelden rapportert. Nylig har vi syntetisert en serie nye antracen L-rhamnopyranosides derivater av emodin ved å koble L-rhamnopyranosides til et plant aromatisk molekyl (figur 2) [48]. I denne studien vi screenet og analysert antitumor-virkningene av alle derivater. Vi fant en forbindelse, EM-d-Rha, hemmer sterkt vekst og spredning av kreftceller, som var nesten ti folder sterkere enn emodin. I denne studien demonstrerte vi videre den antiproliferative aktivitet av EM-D-Rha på kreftcelle, og utforsket mekanismen virkning av EM-d-Rha hemme vekst og formering av HepG2 celler.
Materials og metoder
emodin derivater syntetisert
syntesen av målet forbindelser S-2, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9 var den samme som beskrevet tidligere (fig 2) [48].
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og kjemiske reagenser
human kreft A549 lunge, human hepatisk karsinom HepG2, human brystcancer MCF-7 , human prostatakreft PC-3, Menneskelig livmorhalskreft HeLa, human kronisk myelogen leukemi K562, human magekreft SCG-7901, Madin-Darby Canine Kidney celle (MDCK), human normal leveren celle L02 og menneske ovarialcancer ovčar-3 celler oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Alle bortsett fra leukemi K562-celler ble dyrket ved 37 ° C i en fuktighetskontrollert atmosfære inneholdende 5% CO2 i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium supplert med natriumbikarbonat (2,2%, w /v), L-glutamin (0,03%, w /v), penicillin (100 ug /ml), streptomycin (100 ug /ml) og føtalt bovint serum (FBS, 10%). Leukemi K562 celler ble dyrket i RPMI-1640 komplett medium supplert med 10% FBS.
Cisplatin (
TOKYO Chemical Industry Co
.
LTD:), HCPT (
SHAANXI Sciphar Natural Products Co
.
Ltd
), dimetylsulfoksid (DMSO,
MP Biomedicals LLC
), Fetal Bovine Serum (FBS, Hyclone, USA), Dulbeccos Modified Eagle Medium ( DMEM,
Hyclone
,
USA
), RPMI Media 1640 (
Hyclone
,
USA
), Penicillin-streptomycin Double antibiotika (
SIGMA -ALDRICH
), 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT,
Sigma-Aldrich
), 0,25% Trypsin-EDTA (
Gibco
,
USA
), trypanblått Stain (
Sigma-Aldrich
), Hoechst 33342 Farging Solution (
Pik dager institutt for bioteknologi
,
Jiangsu
), apoptose-DNA ladder Extraction Kit (
Pik dager institutt for bioteknologi
,
Jiangsu
), Annexin apoptose Detection Kit V-F1IC /7-AAD (
BD Pharmagen Firma
,
USA
), PI /RNase Farging Solution (
BD Pharmagen Firma
,
USA
), EZNA
TM Total RNA Kit II (
OMEGA
), M-MLV Reverase transkriptase (
Promega
), dNTP (
Promega
), Oligo (
Promega
), GoTaq®qPCR Master Mix (
Promega
).
Celleproliferering og celleviabilitet analysen
levedyktighet av kreftceller ble evaluert av MTT-analyse. I korthet ble cellene inokulert i 96-brønns kulturplater med en tetthet på 1 x 10
4 /brønn med komplett medium inneholdende 10% føtalt kalveserum i et sluttvolum på 0,2 ml. Celler ble inkubert ved 37 ° C i minst 24 timer for å tillate optimal festing. Når cellene nådde 60% konfluens, ble de behandlet med cisplatin, HCPT og emodin rhamnopyranosides derivater i forskjellige konsentrasjoner og inkubert i et fuktighetsregulert 5% CO
2 inkubator ved 37 ° C i 72 timer. Medium ble utvekslet en gang hver 24. time. Celle kontrollgruppe og blank gruppe ble satt opp på samme måte, med hver gruppe har seks parallelle brønner. Celleoverlevelse ble bedømt ved direkte tilsetning av 22 ul 5 mg /ml MTT til 0,2 ml medium. Etter tre timer ble bunnfallet formazan ble oppløst i 200 ul isopropanol per brønn, og fullstendig blandes under romtemperatur. Etterpå ble optisk tetthet på hver brønn detektert ved 570 nm bølgelengde ved iMark mikroplateleser (
Bio-Rad
,
USA
). Dette eksperimentet ble gjentatt minst tre ganger.
Morfologisk analyse
For morfologiske observasjoner, HepG2-celler i logaritmisk vekstfase ble sådd i en 96-brønn plate med en tetthet på 1 x 10
4 /brønn med 0,2 ml komplett medium inneholdende 10% føtalt kalveserum. Cellene fikk feste ved 37 ° C i 24 timer. Da celler ble behandlet med EM-D-Rha og HCPT ved en spesifikk konsentrasjon. Hver gruppe har seks parallelle brønner. Celler ble inkubert i en fuktig 5% CO2 inkubator ved 37 ° C i 72 timer. Medium ble utvekslet en gang hver 24. time. Etter 48 timer ble vekstlandene og morfologiske endringer av HepG2 celler observert med en invertert mikroskop (
Nikon
,
Japan
).
Fluorescensmikroskopi analysen
HepG
2-celler ble inokulert in duplo på 3 x 10
5 /brønn tetthet i 6-brønns plate og tillatt å feste ved 37 ° C i 24 timer. Etterpå ble cellene behandlet med 10 pM HCPT, 25 uM emodin og spesifikk konsentrasjon EM-d-Rha (0,1 gM, 0,5 pm, 2.5μM), henholdsvis. Celle kontrollgruppe ble angitt på samme måte. Deretter ble cellene inkubert i en fuktet inkubator med 5% CO
2 ved 37 ° C i 72 timer. Medium ble byttet som tidligere beskrevet. Til slutt ble alt medium fjernet, og cellene ble spaltet med 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA-løsning ved 37 ° C i 5 minutter. Etter at cellene ble høstet, ble cellene vasket to ganger med PBS, etterfulgt av sentrifugering ved 300 x g i 5 minutter. Til slutt, ble cellene resuspendert i 100 ul kald PBS etter supernatanten ble kastet. Celler ble dyrket i mørket i 10 minutter ved værelsestemperatur etter tilsetning av 100 ul 1 mg /ml Hoechst 33342 fargeløsning. Cellene ble høstet på nytt som beskrevet tidligere for å forkaste fargeløsning. Vask høstes cellene to ganger med PBS før bruk for de rene glassplater. ble observert morfologiske endringer av celler kjerner og fotografert under fluorescens mikroskop (
Olympus
,
Japan
) ved 350 nm eksitasjon bølgelengde. Forsøket ble gjentatt tre ganger.
DNA stige assay
DNA stige dannelse er et viktig kriterium for å bestemme celler apoptose. For å bekrefte apoptoseinduksjon virkning, ble det gjennomført en analyse av DNA-fragmentering. HepG2-celler i logaritmisk vekstfase ble inokulert i 10 cm diameter kulturplater ved en tetthet på 5 x 10
5-celler med 12 ml komplett medium inneholdende 10% føtalt kalveserum, og latt bli koblet ved 37 ° C i 24 timer. Etterpå ble cellene behandlet med EM-D-Rha og Cisplatin ved en spesifikk konsentrasjon. Celler ble dyrket og høstet som beskrevet tidligere. Endelig DNA av alle prøvene ble ekstrahert ved hjelp av apoptose DNA stigen deteksjon kit følge produsentens instruksjoner. DNA-fragmentering ble analysert ved elektroforese på en 1,5% agarosegel inneholdende 0,5 mg /ml etidiumbromid (EtBr) ved 5 V /cm for 2.5hours og fotografert under ultrafiolett. Størrelsen på DNA-fragmentering ble sammenlignet med markør (molekylvekt-standard).
Strømningscytometri-analyse
Strømningscytometri-analyse ble bestemt ved anvendelse av Annexin V-APC /7-AAD Apoptose Detection Kit (
BD Parmagen
,
U
.
S
.
A
). HepG
2-celler ble podet med en densitet på 3 x 10
5 /brønn på 6-brønners plater og tillatt å feste ved 37 ° C i 24 timer. Etterpå ble cellene behandlet med spesifikk konsentrasjon EM-D-Rha, og dyrket og høstet som beskrevet tidligere. Celler av hver prøve ble resuspendert i 300 ul kald bindingsbuffer før tilsetning av 2,5 pl Annexin V-APC-konjugat og 5 ul 7-AAD-løsning. Deretter ble cellene inkubert i 15 minutter på is i mørket. Cellesuspensjonen ble fortynnet til et sluttvolum på 250 uJ med iskald, 1 x Annexin V bindingsbuffer. Analysen ble utført av flowcytometri (
BD FACSCalibur
,
USA
). Spredningsplott ble generert ved hjelp av Cell quest pro programvare (
BD Biosciences
,
San Jose
,
CA
). Forsøket ble gjentatt tre ganger.
Analyse av mitokondriemembranpotensialet
HepG
2-celler ble inokulert i 10 cm diameter kulturplater ved en tetthet på 5 x 10
5-celler, og latt bli koblet ved 37 ° C i 24 timer. Etterpå ble cellene behandlet med 5.0μM EM-d-Rha for 0, 24, 48 timer og 72 timer hhv. Celler ble inkubert i en fuktet inkubator forsynt med 5% CO
2 ved 37 ° C i 72 timer. Medium ble utvekslet en gang hver 24. time. De høstede celler av hver prøve ble suspendert i 500 ul PBS før tilsetning av 5 pl Rhodamine123. Da prøvene ble inkubert ved 37 ° C i mørke i 15 min. Cellene ble igjen samlet ved sentrifugering ved 300 x g i 5 minutter, og supernatanten ble kastet. Cellepelletene ble vasket to ganger med 4 ° C PBS. Endelig cellene i alle prøvene ble resuspendert i 500 ul PBS. Før du utfører analysen, justere eksitasjon bølgelengde og emisjon bølgelengde til 480nm, 520nm henholdsvis ble ΔΨm endringer av HepG2 mitokondrie målt med et flowcytometer (
BD FACSCalibur
,
BD Biosciences
,
US
). Forsøket ble gjentatt minst tre ganger.
Cell syklus analyse (PI farging)
HepG2 celler i logaritmisk vekstfase ble inokulert i 10cm kulturplater på tettheten av 5 × 10
5 celler og inkubert over natten og lov til å feste. Etter å ha blitt utsatt for EM-d-Rha ved bestemte konsentrasjoner i 48 timer, ble cellene høstet og vasket med kald PBS to ganger. Da de oppsamlede celler ble fiksert med 1 ml PBS og 3 ml kald 100% etanol ved 4 ° C over natten. Deretter ble cellene på nytt innhøstet ved sentrifugering ved 300 x g i 10 min. Cellene ble vasket med kald PBS og resuspendert i 450 ul PBS, og deretter behandlet med ribonuklease 50ul (RNase, 10 mg /ml) ved 37 ° C i 15 minutter. 500 ul av propidiumjodid (PI, 50 ug /ml) ble tilsatt til prøvene. Etter at cellene ble inkubert i 30 minutter ved 4 ° C i mørke, ble cellesyklusfordelingen målt ved bruk av en BD FACSCalibur Flow cytometer (
BD Biosciences
,
USA
), og 10,000cells ble tellet for hver prøve. Prosentandelen av celler i ulike faser av cellesyklus ble analysert ved flyt Jo (
BD Biosciences
,
USA
). Forsøket ble gjentatt tre ganger.
Gene analyse ved RT-qPCR
HepG
2-celler ble inokulert i 6-brønners kulturplater ved en tetthet på 3 x 10
5 celler /brønn og tillatt å feste ved 37 ° C i 24 timer. Da celler ble behandlet med bestemte konsentrasjoner av EM-D-Rha og inkubert i en fuktet inkubator forsynt med 5% CO
2 ved 37 ° C i 48 timer. Medium ble endret en gang hver 24. time. Etterpå mRNA ble ekstrahert fra hver gruppe ved hjelp E.Z.N.A.
TM Total RNA Kit II i henhold til produsentens instruksjoner. Den ekstraherte mRNA ble oppløst i 20 mL DDH
2o (
Qiagen
) inneholder dietyl pyrocarbonate (DEPC). Konsentrasjonen av mRNA ble kvantifisert med et Nanodrop ND-100-enheten (Thermo Fisher Scientific). cDNA ble syntetisert ved hjelp 3μg av utdraget mRNA fra hver prøve med PCR system (
BIO-RAD
,
USA
). CDNA syntesereaksjon ble fremstilt i henhold til produsentens instruksjoner ved å blande 3μg mRNA, 4.0μL 5 × MMLV buffer, 3 mL oligodT18, 0,5 ul 10 mM dNTP løsning, 0.8μL RNase inhibitor, 3.7μL MMLV Rtase, og 6.0μL DEPC DDH
2o i PCR-rør. Reaksjonsbetingelsene ble 5 min ved 70 ° C, 60 min ved 42 ° C og 10 min ved 4 ° C. Produktene ble anvendt for etterfølgende RT-qPCR-analyse. Nivået av mRNA uttrykk ble målt med RT-qPCR ved hjelp av en CFX96
TM C1000 Real-Time PCR System (
BIO-RAD
,
USA
) .De primere ble utformet ved hjelp idt .dna programvaresystem (http //www.idtdna.com). De spesifikke primere var: Cyto C: 5′-AGATGGTGAGCACAAGGTAAG-3 «(fremover), 5’CTCACTGTCCCACAAAGATACA -3» (bakover); Caspase 3: 5’CCTACAGCCCATTTC TCCATAC-3 «(fremover), 5»-GCCTCACCACCTTTAGAACAT-« (bakover); β-actin: 5»-GGACCTGACTGACTACCTCAT-3 «(fremover), 5′-CGTAGCACAGCTTCTCCTTAAT-3» (bakover). Produktet størrelser av Cyto C, Caspase 3 og β-aktin var 91bp, 125bp og 107bp hhv. PCR reaksjonen ble utført i et sluttvolum på 20 pl ved bruk av en optisk 96-brønns brett. Reaksjonsblandingen besto av 10 ul av SYBR jeg grønn Mix /GoTaq®qPCR
Master Mix (
Promega
), 0,3 ul av hver primer (10 uM), og 1,0 mL cDNA mal. PCR sykling tilstand var en syklus på 5 min ved 95 ° C, 39 sykluser og hver ble besto av 15 sekunder ved 95 ° C, 15 sekunder ved 62 ° C og 30 sekunder ved 72 ° C, med endelig forlengelse ved 60 ° C i 5 sekunder. Den termiske smelte parameter ble undersøkt for å vurdere homogenitet av PCR. Hver prøve ble analysert i fire eksemplarer, og gjennomsnittet ble brukt for videre analyse. De mRNA ekspresjonsnivåer av hver prøve ble kvantifisert ved å måle terskelsyklus (CT) verdier av gener. De relative verdier av mål-genekspresjon ble beregnet i henhold til CT verdier av målgener og referansegenet (β-actin) ved å anvende Livak og Schmittgen metode. Det vil si, det tilsvarer 2
-Δ ΔCT, ΔCT er lik middelverdien for Ct for mål-gen minus gjennomsnittet av Ct for β-aktin-genet, og ΔΔCT lik ΔCT av den behandlede gruppe minus ΔCT av kontrollgruppen.
Western blot-analyse
HepG
2-celler ble inokulert, dyrket og høstet som beskrevet tidligere. Deretter ble eksperimentet utført på is. Den høstet Cellepelleten ble vasket med kald PBS før de ble resuspendert i 300 ul lyseringsbuffer cytosol gjennom virvelen. Så cellene i alle prøvene ble lysert ved ultralydmetoden på is ved hjelp av ultralyd celle disruptor (100 V i 30 sekunder x 4 ganger). Totalt protein for hver prøve ble målt ved Bradford-analysen ved bruk av protein kvantifisering reagenser fra Bio-Rad. Alle prøver ble det tilsatt 2 x ladningsbuffer før analyse på 12% geler ved hjelp av SDS-PAGE. Deretter ble proteinene overført til nitrocellulosemembraner ved elektroblotting. Membranene ble blokkert i 1% bovint serumalbumin (BSA) eller 5% melk oppløsningen ved værelsestemperatur i 30 min, etterfulgt av inkubasjon med det primære antistoff mot kanin (
Univ-bio
,
Kina
) ved 4 ° C over natten. Membranene ble deretter vasket tre ganger med 1 x TBST, hver gang siste i 5 minutter. Membranene ble deretter inkubert med det sekundære antistoff i 3 timer ved 4 ° C, etterfulgt av vasking med 1 x TBST som beskrevet tidligere. Til slutt ble de immunreaktive band oppdaget og dokumentert ved hjelp av en forsterket kjemiluminescerende Western blotting system (
Thermo-vitenskapelige
,
USA)
på en Versa Doc imaging system.
statistisk analyse
Alle data ble presentert som gjennomsnitt ± SEM SPSS statistisk programvare for Windows versjon 17.0 ble brukt for enveis ANOVA analyse etterfulgt av Tukey HSD test for multiple sammenligninger når det passer. Forskjeller i variabler målt mellom to grupper ble sammenlignet med t-test. P 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant. GraphPad Prism 5-programvaren (
GraphPad Software
,
Inc
,
San Diego
,
CA
,
USA
) ble brukt for analysen. For RT-qPCR og flowcytometri eksperimenter, data var representative for minst tre uavhengige eksperimenter.
Resultater
Celleviabilitet analysen
Vi har testet effekten av ulike konsentrasjoner emodin (S-1) og dets derivater (S-2, S-3, S-4, S-5, S-6 S-7 S-8 S-9) på viabilities av de testede humane kreftceller linjer (figur 2 og tabell 1). Slik at halv-inhiberende konsentrasjon (IC
50) verdiene ble beregnet fra disse dataene. Dataene viste at ulike derivater hemme veksten av ulike cellelinjer med varierende grad (tabell 1).
Ifølge effektevalueringen standarder for antitumorlegemiddel in vitro tester, IC
50 verdier av det syntetiserte forbindelsen eller planteekstrakten bør være mindre enn 10 ug /ml og effekten bør har en dose-avhengig måte, i mellomtiden den maksimale hemmende virkning skulle overstige 80%. Dersom testet forbindelsen møtes alle de beskrevne kriterier, ble det ansett å ha anti-spredning og hemmer vekst effekter på kreftceller in vitro.
Som vist i tabell 1, blant alle de syntetiserte forbindelser, S-8 og S-9-derivater hadde en sterkere inhiberende virkning på de testede cancerceller enn moder emodin. Egentlig S-8 handle bedre enn S-9. Når sammenlignet med IC
50 av emodin, IC
50 verdier av S-8 på A549, HepG2, OVCAR-3 og HeLa-celler ble redusert ved 7,52, 19,68, 42,3 og 10,56 fold, respektivt. I et annet ord, S-8 forsterket anticancer aktivitet med om lag ti størrelsesordener. Spesielt HepG2 og OVCAR-3 celler ble funnet å være utsatt for S-8 derivat.
Struktur-aktivitet analyse av emodin rhamnopyranosides derivater
Celleviabilitet analysen viste at rhamnopyranosides derivater handlet bedre enn moder emodin. Men det er fortsatt uklart hvordan de endrede kjemiske strukturer bidratt til økt aktivitet. Så vi foreløpig analysert kreft struktur-aktivitetsforhold (figur 2 og tabell 1). Fra in vitro-data, kan det sees at innføringen av rhamnose kan bidra til å øke den anticancer-aktivitet (figur 2). Imidlertid er den forbedrede aktivitet knyttet til den innførte måte rhamnose og den substituerte posisjon av rhamnose hydroksyl av acetylgrupper. Hvis bare en ramnose ble innført i emodin, var løseligheten av derivatet forbedret, men anticanceraktiviteten var dårlig (S-3). Videre, når hydroksylgruppen av ramnose ble disubstituert med to acetylgrupper. Anticancer aktivitet av den genererte derivatet fra 3, 4-hydroksyl av rhamnose disubstituert med den tilstøtende acetyl, er overlegen i forhold til 2, 3-hydroksyl eller 2, 4-hydroksyl-disubstituert derivat, det vil si, det tidligere har en sterk antiprolifertion virkning (S-5). Når emodin rhamnopyranosides derivatet hadde dets sukkerkjeder forlenget, ble anticancer aktivitet in vitro betydelig forbedret (S-8). Tilsvarende, når hydroksylgruppene i C-1 og C-8 stillingen av emodin er metylert, dens anticancer aktivitet også ble forbedret (S-9).
Inhiberende virkning av EM-D-Rha på flere kreftcelle linjer
for å bekrefte den hemmende virkning og antiproliferative aktivitet av EM-D-Rha på kreftceller in vitro, og forstå den dose-respons-forhold, vi ytterligere gjennomførte eksperimenter på forskjellige konsentrasjoner av EM-d-Rha overfor flere kreftceller. IC
50-verdier ble beregnet fra disse dataene.
Som vist i tabell 2 og tabell 3, kan vi se at EM-d-Rha har meget betydelige anti-proliferative effekter mot forskjellige cancercellelinjer i en konsentrasjonsavhengig måte. Men dens halv-hemmende konsentrasjonsverdier for normale vevceller er høyere enn for kreftceller. Det er mulig at den veksthemmende virkninger av EM-d-Rha på celler er selektive til en viss grad.
Dose-responskurven for EM-d-Rha mot HepG2
EM-d-Rha som utøves en betydelig anti-proliferativ effekt på HepG2-celler, og resultatene førte oss til å videre undersøke og sammenligne dose-respons kurver av EM-d-Rha med den for emodin, Cisplatin og HCPT. Som vist i figur 3, er den veksthemmende virkning av EM-D-Rha på HepG2 celler oppviste en doseavhengig måte. Med den økende av log-konsentrasjon av EM-D-Rha, inhiberingsprosenten av HepG2-celler signifikant øket (figur 3). Videre er aktiviteten av EM-d-Rha var sterkere i forhold til det av emodin mot HepG2 celler. Det er imidlertid dårligere sammenlignet med den for Cisplatin og HCPT mot HepG2 celler.
Fire kurver representerer den dose-responskurve av HCPT, EM-D-Rha, cisplatin, og emodin mot HepG2 celle fra venstre til rett etter tur. De feilfelt representerer gjennomsnitt ± standardavvik (tre gjentak). Den horisontale aksen representerer log konsentrasjonen av EM-D-Rha, representerer den vertikale aksen inhiberingsprosenten.
Effekten av EM-D-Rha på morfologien til HepG2-celler
for å se direkte den veksthemmende virkning av EM-D-Rha på HepG2-celler, ble det observert morfologiske forandringer av HepG2-celler etter behandling (fig 4). De morfologiske forandringer av cellene kan gjenspeile vekst og død tilstand. Som et resultat av de ubehandlede HepG2-cellene i kontrollgruppen viste en høy sammenfletting av monolagsceller og blomstret i den logaritmiske vekstfase, som hadde åpenbare morfologiske karakteristika for eugeniske celler slik som intercellular tette forbindelser, klar membran, full cytoplasma og god brytnings ytelse ( figur 4A). I kontrast til EM-d-Rha-behandlede celler viste tydelig de morfologiske forandringer av apoptose slik som reduksjon i cellevolum og mister celle-celle-kontakter på en doseavhengig måte (figur 4D-4H). Når behandlet med 12.5μM EM-d-Rha, morfologiske endringer i HepG2 celler viste lignende funksjoner til at av 2.5μM HPLC-behandlet (fig 4C).
Bright-feltet mikroskopi bilder etter inkubasjon med HCPT for 48t på 0,5 pm; 2.5μM og med EM-d-Rha i 48 timer ved forskjellige konsentrasjoner: 0μM (kontroll); 0,1 gM; 0,5 pm; 2.5μM; 12.5μM; 62.5μM (opprinnelig forstørrelse 100 ×).
For ytterligere å undersøke om levedyktighet nedgang på HepG2 celle behandlet med EM-d-Rha skyldes apoptoseinduksjon, gjennomførte vi den morfologiske observasjon med fluorescens mikroskopi som har forbedret følsomhet og kontrast. HepG2-celler ble farget med et fluorescerende fargestoff DNA Hoechst 33342, som har høy følsomhet og lav cytotoksisitet. Det kan trenge kreftceller membran, og binder DNA og avgir en sterk indigo fluorescens. Hoechst binder DNA på groove regioner som inneholder generøse AT basesekvensen. Den har god vannløselige og stabilitet. Derfor kombinerer fluorescens mikros høyeste følsomhet med molekylær spesifisitet og eksepsjonell bildekontrast. For å verifisere om testen er vellykket eller ikke, etablerer vi HCPT forbindelse som positiv kontroll.
Som vist i figur 5, HepG2 celler viste den typiske apoptotisk kjernefysisk morfologi etter eksponering for 2.5μM HCPT for 48t, og presenterte celle-til-celle-kontakt tap, atom krymping, membran blobbing, DNA-kondensering og fragmentering (figur 5C). Tilsvarende, når HepG2-celler ble behandlet med varierende konsentrasjoner av EM-d-Rha i 48 timer, de viste klart egenskapene til kjerne krymping og DNA-kondensasjon, og presenterte en dose-avhengig forverret skade (fig 5D-5F) .Noen av HepG2-celler løsrevet fra monolaget og fløt på kulturmediet, men den apoptotiske atom utseende ble ikke observert i ubehandlet kontroll, HepG2-celler i kontrollgruppen viste ensartet blå fluorescens (figur 5A). HepG2 celler behandlet med 25 pm emodin vises også apoptotiske morfologiske endringer (figur 5B).
Det ble observert kjerner morfologiske endringer av HepG2 celle med fluorescens mikroskopi etter inkuberes med 25.0μM emodin, 2.5μM HCPT for 48 timer og med EM -d-Rha i 48 timer ved forskjellige konsentrasjoner: 0μM (kontroll); 0,1 gM; 0,5 pm; 2.5μM (opprinnelig forstørrelse 400 ×). De kondenserte og fragmenterte fluorescerende kjerner (hvite piler) av apoptotiske celler er synlige i de behandlede celler, men ikke i kontrollcellene.
Effekter av EM-d-Rha på DNA fragmentering av HepG2 celler
for ytterligere å undersøke om EM-d-Rha førte til DNA-fragmentering av HepG2 celler, som er en viktig funksjon i celle apoptose. Den kjerne-DNA ble påvist med agarosegelelektroforese metode. Vi har også funnet at EM-d-Rha kan utøve sin apoptotisk-induserende effekt, da HepG2-celler ble behandlet med EM-D-Rha, det ekstraherte DNA fra HepG2-celler først på vanlig leider eller fragmentering form (figur 6), var i likhet med hva DNA fra HepG2-celler behandlet med cisplatin presentert, men var forskjellig med DNA-form av de ubehandlede HepG2-celler (Fig 6). Resultatet antydet at EM-d-Rha forårsaket dobbelttrådet DNA brudd i HepG2 celler og indusert apoptose i HepG2 celler
Lane M. DNA Ladder; Lane 6: Kontroll; Lanes1, og 2: Celler behandlet med 3.0μM og 6.0μM Cisplatin; Kolonnene 3, 4 og 5: Celler ble behandlet med 2.5μM, 5.0μM og 10.0μM EM-D-Rha, henholdsvis
apoptose-induserende effekt av EM-d-Rha på HepG2 og OVCAR-3. cellene
demonstrerte videre at EM-d-Rha kan hemme veksten og proliferasjonen av HepG2-celler og OVCAR-3-celler via mekanismen av apoptose-induksjon, vi også anvendes strømningscytometri-analyse med den dobbelte fargemetoden til Annexin V-APC og 7-AAD (7-amino-actinomycin D). Den apoptoseinduksjon aktiviteten til S-8 ble gjenkjent av bindingen mellom Annexin V og fosfatidylserin (PS) som i hovedsak fordele i den cytoplasmatiske side av levende celler, men under den tidlige fase av celle apoptose, PS migrere fra den cytoplasmatiske side til celleveggen side, slik at dette kan generere spesifikke bind mellom Annexin V og PS. 7-AAD er en nukleinsyre flekk, som kan trenge gjennom cellemembraner ved sent stadium av celle apoptose og døde celler og ytterligere fargestoff sin kjerne rødt. Slik at den kombinerte bruk av Annexin V-APC og 7-AAD kan skille sen apoptotiske celler fra begynnelsen av apoptotiske celler. HepG2-celler og OVCAR-3-celler gjennomgikk apoptose etter eksponering for EM-d-Rha ved 2.5μM, 5 uM og 10 uM i 48 timer (figur 7 og figur 8). Prosentandelen av apoptotiske celler er vist i tabell 4 og tabell 5.
HepG2-celler ble inkubert i 72 timer med EM-d-Rha på 0, 2.5μM, 5 uM, 10 uM, respektivt. Og celler ble farget med FITC konjugert Annexin V og 7-AAD. A: Representative prikkplotter av Annexin V-FITC /7-AAD farging. a: kontroll, 72h; b: 2.5μM EM-d-Rha, 72h; c: 5 pm EM-d-Rha, 72h; d: 10 uM EM-d-Rha, 72h. 3-(2”,3”-Di-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-2’,3’-di-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl)-emodin
