Abstract
Bakgrunn
ETS transkripsjonsfaktorer regulerer viktige signalveier involvert i celledifferensiering og utvikling i mange vev, og har dukket opp som viktige aktører i prostatakreft. Imidlertid er den biologiske effekten av ETS faktorer i prostata tumorigenesis fortsatt debattert.
Metodikk /hovedfunnene
Vi utførte en analyse av ETS genet familien bruker microarray data og real-time PCR i normal og tumorvev sammen med funksjonelle studier i normale og kreftcellelinjer for å forstå effekten i prostata tumorigenesis og identifisere viktige målene for disse transkripsjonsfaktorer. Vi fant hyppig feilregulering av ETS gener med onkogene (dvs. ERG og ESE1) og tumor suppressor (dvs. ESE3) egenskaper i prostatakreft i forhold til normal prostata. Tumor undergrupper (dvs. ERG
høye, ESE1
høye, ESE3
lav og NoETS svulster) ble identifisert på grunnlag av deres ETS uttrykk status og viste tydelig transkripsjonen og biologiske funksjoner. ERG
høye og ESE3
lave svulster hadde de mest robuste gen signaturer med både forskjellige og overlappende funksjoner. Integrering genomiske data med funksjonelle studier i flere cellelinjer, demonstrerte vi at ERG og ESE3 kontrollert i motsatt retning transkripsjon av Polycomb Gruppe protein EZH2, en viktig genet i utvikling, differensiering, stamcellebiologi og tumorigenesis. Vi videre vist at prostata-spesifikt tumorsuppressorgenet Nkx3.1 ble kontrollert av ERG og ESE3 både direkte og gjennom induksjon av EZH2.
Konklusjon /Betydning
Disse funnene gir ny innsikt i rollen til ETS transcriptional nettverk i prostata tumorigenesis og avdekke tidligere ikke koblinger mellom avvikende uttrykk for ETS faktorer, deregulering av epigenetiske effektorer og stanse av tumorsuppressorgener. Koblingen mellom avvik ETS aktivitet og epigenetisk genet Slå kan være relevant for den kliniske behandlingen av prostatakreft og design av nye terapeutiske strategier
Citation. Kunderfranco P, Mello-Grand M, Cangemi R, Pellini S, Mensah A, Albertini V, et al. (2010) ETS transkripsjonsfaktorer Kontroll transkripsjon av EZH2 og epigenetiske lyddemping av tumorsuppressorgenet Nkx3.1 i prostatakreft. PLoS ONE fem (5): e10547. doi: 10,1371 /journal.pone.0010547
Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 03.11.2009; Godkjent: 12 april 2010; Publisert: 10. mai 2010
Copyright: © 2010 Kunderfranco et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Oncosuisse (OCS-01913-08), Swiss National Science Foundation (FNS-31003A-118113) og Ticino Foundation for kreftforskning til GMC. MGM og CG ble støttet av Compagnia di San Paolo, Torino, Italia. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i prostata er den vanligste kreftformen og en ledende årsak til kreft dødsfall i vestlige land [1]. Prostatakreft har en svært heterogen klinisk atferd og lite er kjent om de molekylære mekanismene som bidrar til dette heterogenitet [1]. Nylig har ETS transkripsjonsfaktorer dukket opp som viktige elementer i prostata tumorigenesis på grunn av funn av tilbakevendende trans involverer ETS gener, den hyppigste være TMPRSS2: Erga genet fusjon som fører til overuttrykk av full lengde ERG [2], [3] , [4]. Imidlertid er den biologiske effekten av translokerte ETS gener fortsatt debattert. Nyere rapporter tyder på at ERG over-uttrykk er ikke tilstrekkelig til å indusere neoplastisk transformasjon og samarbeid med andre onkogene trasé som PTEN tap og PI3K /AKT feilregulering er nødvendig [5], [6], [7], [8], [9]. Den menneskelige ETS-familien omfatter 27 medlemmer som deler et høyt konservert DNA-bindende domene og er knutepunkter av ulike signalveier kontrollerer celleproliferasjon, differensiering og overlevelse [10]. Selv om det er et stort potensial for overlapping, individuelle ETS faktorer har forskjellige funksjoner som manifesterer gjennom positiv og negativ regulering av ulike undergrupper av gener og biologiske prosesser [10]. Videre, i mange vev ETS faktorer utgjør komplekse regulatoriske nettverk med spesifikke cellulære responser avhengig av balansen mellom faktorer med liknende eller motsatte funksjoner [10]. De fleste ETS faktorer, slik som de som er translokert i prostata cancer, fremmer cellevekst, overlevelse og vekst, mens andre virker som tumor-suppressorer [10]. Nylig fant vi at den epiteliale spesifikke ETS faktor ESE3 var ofte nedregulert i prostatakreft, negativt påvirket celleproliferasjon og overlevelse, og fungerte som tumor suppressor i prostata epitelceller [11]. Derfor, for å forstå den samlede virkningen av ETS genet deregulering i tumorigenesis og identifisere viktige mål for deregulerte ETS faktorer, vil det være viktig å vurdere hele settet med ETS gener uttrykt i et gitt vev.
I denne studien, gjennom en omfattende analyse av ETS genet familien i prostata normale og tumorvev, identifiserte vi svulst undergrupper med forskjellige ETS uttrykk mønstre. Foruten allerede kjente ETS mål, oppdaget vi tidligere ikke gener og stier knyttet til avvikende ETS aktivitet. Ved å integrere genomiske data med funksjonelle studier, etablerte vi at Polycomb Group (PCG) protein EZH2 er et direkte mål for ERG og ESE3, og en sentral aktør i transkripsjonen stanse av prostata spesifikt tumorsuppressorgenet Nkx3.1. Til sammen våre data indikerer hyppigere og komplekse endringer av ETS gener enn tidligere anerkjente og identifisere viktige gener som EZH2 og Nkx3.1 bidra til omprogrammering av prostata epitelceller transkriptomet svar på avvikende uttrykk for onkogene og kreft suppressor ETS faktorer. Disse funnene kan være relevant for den kliniske behandlingen for prostatakreft og design av nye terapeutiske strategier.
Resultater
ETS genuttrykksmønster Definer prostatakreft Undergrupper
For å få en helhetlig visning av ETS transcriptional nettverk i prostatakreft, vi undersøkte uttrykk for ETS genet familien i microarray datasett fra primær prostatakreft (
n = 59
) og normal prostata (
n = 14
) kliniske prøver. Analyse av microarray data viste at flere ETS gener ble uttrykt forskjellig i tumorprøver i forhold til normal prostata. Kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) ble anvendt for å bekrefte den differensielle ekspresjonen av de mest hyppig endrede ETS faktorer (fig. S1). De mest betydelig påvirket ETS gener var ERG, ESE3 og epitel spesifikke ETS factor-1 (ESE1 /ELF3 /ESX). Vi har tidligere vist at ESE3, som uttrykkes i normale prostata epitelceller, negativt påvirket proliferasjon og overlevelse av prostatakreftceller og foreslått at den fungerte som en tumor suppressor [11]. ESE1, som er nært beslektet til ESE3, blir uttrykt i normale epitelceller i forskjellige organer, inkludert prostata, bryst og lunge og er kjent for å opptre som et onkogen når overuttrykt i bryst epitelceller [12], [13]. Men oppregulering av ESE1 i prostatakreft har ikke blitt rapportert før. Totalt sett feilregulert uttrykk for ETS gener var meget hyppig i prostatakreft. Faktisk, de fleste av svulstene hadde minst én opp- eller ned- regulert ETS gen i forhold til normal prostata og ofte flere ETS ble samtidig påvirket.
Vårt mål var å forstå hvordan disse individuelle og sammensatte ETS endringer kan påvirke biologien til prostatakreft. Bruke QRT-PCR data på ETS genekspresjon og genomiske data vi vurdert om spesifikke transkripsjons profiler ble assosiert med den distinkte ETS uttrykk mønstre. Vi brukte flere kriterier for å minimalisere de potensielle konfunderende effekter av tilstedeværelsen av flere ETS faktorer. Først ble QRT-PCR-data som brukes til å klassifisere nøyaktig tumorer i henhold til deres ETS genekspresjon status. Deretter, tumorer bare med meget høy eller meget lav ekspresjon av en gitt ETS (dvs. ≥4 ganger høyere eller lavere enn gjennomsnittsverdien i normal prostata) ble tilordnet til en gruppe og med i analysen. Ved anvendelse av disse kriteriene, omtrent 80% av prostatakreft hadde høyt deregulert ekspresjon av minst en dominerende ETS-genet. På disse basene, identifiserte vi tre store kreft undergrupper preget av den dominerende feilregulering av en ETS faktor: i) svulster med høy ERG uttrykk (ERG
høy,
n = 14
), ii) svulster med høy ESE-1 uttrykk (ESE1
høy,
n = 12
) og iii) svulster med lav ESE3 uttrykk (ESE3
lav,
n = 13
). En fjerde gruppe (NoETS,
n = 14
) inkludert svulster som hadde normal-lignende nivåer av alle ETS genet (Fig. 1a). Åtte svulster med ≥4 ganger over-uttrykk enten av ETV1, ble ETV4, ETS2 eller ETS1 ekskludert fra analysen på grunn av deres begrenset antall. ESE1 ble sterkt uttrykt i 26 av de 59 (44%) prostatatumorer, men bare i 12, som var inkludert i ESE1
høyt uttrykkende gruppe, det var den eneste overuttrykt ETS. ESE3 var nedregulert ≥4 fold i 27 av de 59 (46%) prostatakreft, men bare i de 13 sakene, som ble inkludert i ESE3
lav uttrykke gruppe, det var det eneste deregulert ETS. Vi brukte et lignende tilnærming til et offentlig tilgjengelig microarray datasett fra en uavhengig studie [14] skaffe en tilsvarende fordeling av prostatakreft i fire store undergrupper (fig. S2). Interessant, i serien 6 og 8 av de 14 ERG
høye tumorer hadde samtidig dysregulerte ekspresjon av ESE3 og ESE1, henholdsvis (fig. 1A). Tilsvarende i det offentlige datasett de 15 ERG
høye svulster hadde samtidig dysregulerte uttrykk for ESE3 og ESE1 (Fig. S2A). Dermed ERG over-uttrykk kunne tydelig sameksistere med feilregulert uttrykk for disse andre ETS faktorer. I vår svulst serien, 11 av de 14 ERG
høye svulster (79%) var positive for TMPRSS2: Erga fusjon avskrift vurdert av endepunkt RT-PCR (Fig S3A.). De andre ERG over-uttrykke svulster hadde sannsynligvis andre typer fusion transkripsjoner ikke oppdages av analysen. Syv svulster hadde svært lave nivåer av TMPRSS2: Erga transkripsjon ved endepunktet RT-PCR, normal-aktig uttrykk for ERG ved QRT-PCR og ble ikke inkludert i ERG
høy gruppe. Ingen av de 8 normale prøver og av de 11 godartet prostatahyperplasi (BPH) undersøkte prøvene viste tegn på TMPRSS2: Erga transkripsjon (Fig. S3A). Kliniske og patologiske parametere av de fire undergruppene tumor er vist i fig. S3b. Det var ingen statistisk signifikant sammenheng mellom ETS undergrupper og en hvilken som helst av de vurderte kliniske /patologisk parametere.
A. Uttrykk av ERG, ESE1 og ESE3 bestemmes av QRT-PCR i normale prostata og prostatakreft. Svulster er gruppert etter den overveiende uttrykt ETS faktor. B. Prinsipal komponent analyse. Dots representerer individuelle prøver med sin plassering bestemmes av de viktigste komponentene i transkriptom. C. Antall differensielt uttrykte gener med Q≤0.1 i hvert ETS undergruppe. D-E. Venn-diagrammer som viser felles og distinkte differensielt uttrykte gener blant de angitte tumor undergrupper.
Transkripsjon programmer i Prostate Cancer Undergrupper
Vi brukte Principal Component Analysis (PCA) for å vurdere den globale grad av likheten eller divergens av de enkelte transcriptomes av normale og prostatakreft prøver. Som vist på fig. 1B, tumorer som tilhører ulike undergrupper som dannes delvis atskilte klynger som tyder på at divergens i transkripsjonsprogrammene avhengig i det minste delvis på deres ETS genuttrykksmønster. ERG
høye og ESE3
lave svulster var de mest fjernt fra normal prostata og i stor grad skiller seg fra de andre undergruppene. Deretter sammenlignet vi transkripsjons profiler av tumor undergrupper med at av normal prostata ved hjelp av Gene Expression Profil Analyse Suite (GEPAS) [15] for å identifisere felles og forskjellige funksjoner og trekke ETS-spesifikke gen signaturer. Antallet av differensielt uttrykte gener (Q≤0.1) i hver undergruppe er vist i fig. 1C og genet listene er vist i tabell S1. ERG
høye og ESE3
lave svulster hadde de mest robuste gen signaturer med det største antall differensielt uttrykte gener i forhold til normal prostata, mens antall differensielt uttrykte gener var betydelig mindre i ESE1
høy og NoETS svulster .
Deretter krysset vi listene over differensielt uttrykte gener i forhold til normal prostata for å fastslå graden av overlapping og divergens mellom kreft undergrupper (fig. 1D-E). Spesielt, ERG
høye og ESE3
lave svulster delte mange forskjellig uttrykt gener med en stor overlapping blant både oppregulert og ned-regulert gener, noe som indikerer at endret uttrykk for ERG og ESE3 hadde delvis lignende effekter. På den annen side, ERG
høye og ESE3
lave svulster hadde et stort antall særtrekk i forhold til No ETS (Fig. 1 D) og (1E Fig.) Svulster ESE1
høy. Disse forskjellene i genet sett overlapper var statistisk signifikant (P 0,0001, Fisher Exact test). Genene modulerte både i ERG
høy og ESE3
lave svulster, men ikke i de andre svulst undergrupper, identifisert gjennom en 3-veis (Fig. 1 D) og 4-veis (Fig. S4) Venn-diagrammer, oppført i tabell S2.
for å forstå de funksjonelle konsekvensene av forskjellene mellom tumor undergruppene vi brukte Metacore, en programvarepakke for integrert funksjonell analyse av genuttrykk data [16]. Metacore lov til å kartlegge vanlige, tilsvarende og unike funksjoner blant kreft undergrupper og definere vanlig og ulikt berørt Gene Ontologi veier. Som vist på fig. 2A, var det mange vanlige og lignende funksjoner blant kreft undergrupper. På den annen side, ERG
høye og ESE3
lave svulster hadde det største antall unike funksjoner. Den øverste ofte påvirket GeneGo pathway kart (GGPM), vist i fig. 2B, inkludert
immunrespons, cytoskjelettet ombygging, utvikling, cellesyklus Hotell og
transkripsjonsregulering
. De kan representere gener og veier vanligvis aktivert i tumorer sammenliknet med normalt vev. De ulikt berørt GGPMs ble prevalently eller utelukkende beriket i ERG
høy og ESE3
lave svulster (Fig. 2C). Den øverste forskjellig berørte GGMPs inkludert
celle adhesjon-inte mediert
,
cytoskjelettet ombygging
,
celle adhesjon-ECM ombygging Hotell og
celle adhesjon-chemokiner
, noe som tyder på at aktivering av disse banene, relatert til celle migrasjon og invasjon, kan være dominerende trekk ved disse svulstene. Interessant, disse data impliserte også at ESE3 tap fått konsekvenser ganske lik ERG over-uttrykk på transkripsjonsprogrammet prostatakreft.
A. Antall unike, tilsvar og fellestrekk blant de differensielt uttrykte gener i forhold til normal prostata i ERG
høy, ESE3
lave, ESE1
høye og NoETS svulster i henhold til Metacore. B. Vanligvis påvirkes GeneGo Pathway Maps i tumor undergrupper. C. Forskjellig påvirket GeneGo Pathway Maps i ERG
høy, ESE3
lav, ESE1
høy og NoETS svulster.
ERG oppregulerer EZH2 Expression i prostatakreft
Omfattende evaluering av ETS genekspresjon og genomiske data viste robuste og delvis overlappende genet signaturer i ERG
høye og ESE3
lave svulster med mange aktiverte og fortrengte gener. Deretter søkte vi ERG
høye og ESE3
lave underskrifter for målgener som kunne fungere som viktige noder medierende effekten av disse abnorme uttrykt ETS faktorer på prostatakreft transkriptom. EZH2 var blant de 169 oppregulert gener både i ERG
høy og ESE3
lave svulster gener (Fig. S4 og Tabell S2), mens det ikke ble økt i de andre svulst undergrupper. EZH2 ble også positivt korrelert med ERG og negativt korrelert med ESE3 i en korrelasjonsanalyse av hele microarray datasettet (Tabell S3). EZH2 er en histon H3 lysin 27 (H3K27) metyltransferase og et sentralt element i epigenetisk genet Slå [17], [18]. H3K27 metylering er en histon mark som skaper et forankringspunkt for rekruttering av flere kromatin remodeling faktorer som induserer en undertrykkende kromatin tilstand [17]. Således kunne induksjon av EZH2 forbundet med ERG vinning og tap ESE3 bidra til den brede undertrykkende signaturen observert i disse tumorene (Fig. 1C). EZH2 har vist seg å være oppregulert i prostata kreft sammenlignet med normal prostata med spesielt høyere nivåer i høy grad og metastatiske tumorer [19]. Men noen faktorer har blitt identifisert som kan øke EZH2 uttrykk i prostatakreft [20], [21], [22], [23]. Vi fant ut at EZH2 var signifikant oppregulert i ERG
høye svulster i forhold til både normal prostata og NoETS svulster (Fig. 3A), noe som indikerer at det kan være en direkte kobling mellom EZH2 og ERG uttrykk som ikke hadde blitt anerkjent før. I samsvar med dette funnet, EZH2 var signifikant høyere i ERG
høy sammenlignet med NoETS svulster (Q 0,0001). Også i et uavhengig datasett (Fig. 3B)
A. EZH2 uttrykk i vevsprøver. Microarray data er presentert som log2 forhold i forhold til referansen. B. EZH2 uttrykk i NoETS og ERG
høye svulster i Wallace et al. microarray datasett. C. EZH2 uttrykk i LNCaP og 22Rv1 celler transient transfektert med tom (
ev
) eller ERG uttrykk (
Erg
) vektor bestemmes av RT-PCR (
venstre
) og Western blot (
midt
). D. EZH2 nivå i kontroll og stabile ERG-uttrykker 22Rv1 og LNCaP celler bestemt ved RT-PCR (
øvre
) og Western blot (
nederst
). E. EZH2 nivå i Vcap celler transient transfektert med kontroll og ERG-spesifikk (siERG) siRNA bestemmes av RT-PCR (
venstre
) og Western blot (
midt
). F. chip i de angitte cellelinjer med ERG antistoff og qPCR med primersett omfatter EBS i EZH2 promoter. Positiv (MMP3 promoter) og negative (ETS2) kontroller er vist i fig. S6a-B og 7A, respektivt. G Vevsprøver av ERG
høye og NoETS svulster ble utsatt for brikke med anti-ERG antistoff og analysert ved qPCR. ETS2 ble anvendt som negativ kontroll (Fig. S7b). *, P 0,01; **, P . 0,0001
Deretter undersøkt vi den funksjonelle sammenhengen mellom ERG og EZH2 og muligheten for direkte regulering av EZH2 av ERG i prostatakreftceller, der vi eksperimentelt opp- og ned -regulated ERG. I disse forsøkene vi over-uttrykt ERG i ERG-trans negative 22Rv1 og LNCaP prostata kreft celler som ikke uttrykker endogen ERG. Ved transfeksjon, 22Rv1 og LNCaP cellene uttrykte ERG til nivåer tilsvarende TMPRSS2: ERG trans positive Vcap celler (Fig. S5a). Parallelt knock-down av ERG ble utført i Vcap celler ved hjelp av en ERG bestemt siRNA. Nivået av ERG RNA og protein ble signifikant redusert i siRNA transfekterte celler sammenlignet med kontroll VCap-celler (Fig. S5b). For å validere disse cellemodeller, undersøkte vi uttrykket av gener, som MMP3, PLA-en og CRISP3, som var på toppen av listen over oppregulert gener i ERG
høye svulster og hadde tidligere blitt vist seg å bli kontrollert av ERG i andre cellesystemer [6]. Uttrykk av disse genene økt på ERG over-uttrykk i 22Rv1 og LNCaP celler (Fig. S5C) og redusert på ERG knock-down i Vcap celler (Fig. S5D). Resultatene viste tilstrekkeligheten av våre cellulære modeller for å undersøke potensielle ERG målgener sammen med prediktiv verdi av genet signaturer som vi stammer fra prostata kreft kliniske prøver.
Både forbigående og stabil uttrykk for ERG i ERG-negative LnCap og 22Rv1 celler førte til forhøyet nivå av EZH2 (fig. 3C-D). Videre ble EZH2 mRNA og protein redusert på siRNA-mediert knock-down av ERG i Vcap celler (Fig. 3E). Endringene i EZH2 uttrykk observert på opp- og ned-regulering av ERG antydet muligheten for direkte regulering av ERG. Vi identifiserte antatte ETS bindingsseter (EBSS) innen 1 kb av EZH2 TSS ved matematisk analyse og utført chip eksperimenter for å finne ut om ERG var i stand til å binde seg til disse områdene (Fig. 3F). Binding av ERG til EZH2 arrangøren ble observert i ERG trans positiv Vcap celler og i LNCaP og 22Rv1 celler ved stabil uttrykk for ERG, mens ingen binding ble sett i ikke-ERG uttrykke foreldrenes LNCaP og 22Rv1 celler (Fig. 3F). Tilsvarende ERG ble bundet til MMP3 genet, et kjent ERG mål her brukt som positiv kontroll, bare i ERG uttrykker kloner og i VCap-celler (fig. S6a). Ingen binding av ERG ble sett til den ETS2 promoteren, som ble brukt som en negativ kontroll (Fig. S7A). Den delen av ETS2 promoteren vurderes av Chip inkludert transkripsjonsstartsetet, og begge RNA-polymerase II og Sp1 hadde blitt vist å binde seg til denne regionen i gel-skift og chip-analyser ([24], og data ikke vist). Til sammen utgjør disse data støtter konklusjonen om at ERG fungerte som en transkripsjonen aktivator av EZH2 ved binding til dets promoter. Til slutt, for å bevise at denne interaksjonen inntraff også i kliniske vevsprøver vi utført chip for å vurdere binding av ERG til EZH2 arrangøren i ERG
høye og NoETS prøver (Fig. 3G). ERG var forbundet til den EZH2 promoteren i ERG
høye tumorer mens den var fraværende i NoETS tumorer, i samsvar med hypotesen om at den kontrollert transkripsjon av dette gen. Spesifisitet ble demonstrert ved fravær av binding av ERG til ETS2 arrangøren i tumorprøver (Fig. S7b).
ERG undertrykker Nkx3.1 i prostatakreft gjennom EZH2 og Histone H3K27 Metylering
i tillegg til oppregulert gener, transkriptom av ERG
høye svulster inkludert mange gener som uttrykk ble betydelig redusert i forhold til normal prostata, noe som tyder på at disse genene kan bli undertrykt enten direkte eller indirekte av ERG. Listen over nedregulert gener i ERG
høye svulster inkludert mange relevante gener som kan ha betydelig innvirkning på sykdomsutviklingen. Blant gener med kjente tumor suppressor funksjoner, fokuserte vi på Nkx3.1, som ble påvirket på samme måte i ERG
høy og ESE3
lave svulster. Nkx3.1 er en prostata-spesifikt homeobox genet og en transkripsjonsfaktor som har kritiske funksjoner i prostata utvikling og svulst undertrykkelse [25]. Tap av ekspresjon Nkx3.1 er en hyppig hendelse i prostata tumordannelse og har blitt tilskrevet forskjellige mekanismer, inkludert alleliske tap, metylering og post-transkripsjonell stanse [25], [26], [27], [28]. Vi har funnet at nivået av Nkx3.1 ble signifikant redusert i ERG
høye tumorer sammenliknet med normal prostata og NoETS tumorer (Fig. 4A). For å avgjøre om Nkx3.1 nedregulering ble funksjonelt knyttet til ERG over-uttrykk, undersøkte vi nivået av Nkx3.1 i prostatakreftceller ved modulering av ERG. ERG knock-down i VCap-celler resulterte i økt ekspresjon Nkx3.1 på mRNA og proteinnivå (fig. 4B). På den annen side ble Nkx3.1 nivået redusert med stabil ekspresjon av ERG i ERG negativ LNCaP og 22RV1 celler, noe som gir ytterligere bevis for kontroll av Nkx3.1 ekspresjon av ERG (Fig. 4B). Siden ETS faktorer kan fungere som transkripsjonsaktivatorer eller repressors avhengig av arrangøren sammenheng [10], [29], vi søkte på Nkx3.1 promoter for mulig EBS som kunne formidles ERG bindende. Matematisk analyse viste tilstedeværelse av en antatt EBS i Nkx3.1 promoteren. Chip-analyser viste binding av ERG til denne regionen av promoteren i VCap-celler (fig. 4C). ERG okkuperte Nkx3.1 arrangøren også i LNCaP og 22Rv1 celler ved stabil ERG uttrykk og samtidig til taushet av genet (fig. 4C). Således binding av ERG til Nkx3.1 promoteren var forbundet med transkripsjonen undertrykkelse av genet. Vi observerte Nkx3.1 promoter belegg av ERG også i kliniske kreftprøver ved å utføre chip i ERG
høy og NoETS svulster. ERG ble bundet til Nkx3.1 promoteren i ERG
høye tumorer, i samsvar med hypotesen om at den kontrollert negativt transkripsjon av genet i denne tumor undergruppe (fig. 4D).
A. Nkx3.1 uttrykk i normale og tumor vevsprøver. B. Nkx3.1 nivå i LNCaP celler transient transfektert med tom (
ev
) eller ERG uttrykk (
Erg
) vektor bestemmes av Western blot (øvre panel), Nkx3.1 nivå i Vcap -celler transient transfektert med siERG og tak siRNA bestemt ved RT-PCR og Western blot (midtre panel), Nkx3.1 nivå i kontroll og stabile ERG-uttrykk 22Rv1 og LNCaP-celler analysert ved RT-PCR og Western blot (nedre panel). C. Binding av ERG til Nkx3.1 arrangøren bestemt av chip og qPCR i angitte cellelinjer. Negative kontroller er vist i fig. S7A. D. Vevsprøver av ERG
høy og NoETS tumor ble utsatt for brikke med anti-ERG antistoff og analysert ved qPCR. Negative kontroller er vist i fig. S7b. E. VCap, foreldre (kontroll) og ERG uttrykker (ERG 18) LNCaP-celler transfektert med EZH2 spesifikke (siEZH2) og tak siRNA og analysert ved RT-PCR. F. brikke med et antistoff for metylert H3K27 og qPCR med primersett omfatter EBS (
øvre panel
) og en androgen responsive forsterker (ARE) (
nedre panelet
) i Nkx3.1 genet. ETS2 ble anvendt som negativ kontroll (Fig. S8A). G. Nkx3.1 promoter-aktivitet i LNCaP-celler transfektert med human Nkx3.1 promoter reporter sammen med de indikerte ekspresjonsvektorer. Luciferase reporter-aktiviteten ble målt etter 24 timer. H. Nkx3.1 proteinnivået i LNCaP-celler transient transfektert med tom (-) eller enten ERG (PERG) eller EZH2 (pEZH2) ekspresjonsvektor bestemt ved Western blot. I. Nkx3.1 promoter metylering ble bedømt ved bisulfitt-behandlede DNA-sekvensering. Tomme og fylte sirklene representerer unmethylated og denaturert CpG områder, henholdsvis. *, P 0,01; **, P. 0,001
For å avgjøre om induksjon av EZH2 av ERG kan bidra til å stanse all Nkx3.1, vi banket ned EZH2 i ERG uttrykke celler. siRNA-mediert knock-down av EZH2 i VCap-celler økte ekspresjon av Nkx3.1, i overensstemmelse med den hypotese at genet var under kontroll av EZH2 i disse cellene (fig. 4E). Videre EZH2 knock-down i ERG-uttrykkende kloner LnCap delvis gjenopprettet Nkx3.1 uttrykk til et nivå lik den til foreldre LNCaP-celler (fig. 4E). For ytterligere å bevise rolle EZH2, vi bestemmes av Chip vidt Nkx3.1 promoteren anskaffet H3K27 metylering merket karakteristisk for EZH2 aktivitet i celler i hvilke genet, ble undertrykt. Vi har observert økt H3K27 metylering i området rundt EBS, som vi identifisert i promoteren, og på nivå med en androgen responsiv forsterker (ARE), som er en viktig regulerende område i Nkx3.1-genet [30] i ERG- trans positive Vcap celler (fig. 4F). En tilsvarende anrikning av H3K27 metylering ble også observert i LNCaP-celler og 22Rv1 med stabil ekspresjon av ERG (fig. 4F). Dermed Nkx3.1 kjøpt et undertrykkende mark karakteristisk for EZH2 aktivitet i en ERG avhengig måte. Samlet utgjør disse dataene etablert som Nkx3.1 var et mål for både ERG og EZH2. ERG trykt Nkx3.1 direkte ved å binde seg til sin promotor og indirekte via induksjon av EZH2 og H3K27 metylering. Luciferaserapportørplasmid analyser og forbigående transfeksjon eksperimenter støttet denne hypotesen. Nkx3.1 promoter-aktivitet og proteininnhold ble redusert ved transient ekspresjon av ERG i LNCaP-celler (fig. 4G-H). I motsetning til dette, forbigående transfeksjon av EZH2 alene hadde ingen effekt på Nkx3.1 promoter-aktivitet i analysen reporter eller Nkx3.1 proteinnivå (fig. 4G-H), noe som indikerer at EZH2 kreves ERG og stabil ekspresjon til taushet Nkx3.1. Disse funnene er således i overensstemmelse med evnen til ETS faktorer for å virke alternativt som transkripsjonal aktivator og repressor [10], [29] og med den hypotese at transkripsjonsfaktorene kan påvirke rekrutteringen av epigenetiske effektorer som EZH2 til genet promotorer [31].
Kjøp av undertrykkende histone merkene, som H3K27 metylering, er bare en av flere mekanismer som bidrar til å stanse all tumorsuppressorgener i kreftceller [18]. Arrangøren av Nkx3.1 gen inneholder en CpG island og genet har blitt rapportert å bli brakt til taushet av CpG promoter metylering i prostatakreft [26]. Dermed fant vi ut om DNA metylering var også involvert i ERG indusert Nkx3.1 lyddemping. Bisulfite sekvensering viste fravær av CpG metylering i Nkx3.1 promoter i ERG-trans positive Vcap celler og ERG uttrykker og ikke-uttrykke LNCaP celler (fig. 4i). I kontrast, ble Nkx3.1 arrangøren metylert i ERG-trans negative PC3 prostata kreft celler som ikke uttrykker Nkx3.1 (Fig. 4I) indikerer at disse cellene Nkx3.1 ble brakt til taushet av CpG promoter metylering. Dermed ERG-indusert Nkx3.1 stanse avhengig hovedsakelig på EZH2 og var uavhengig av arrangøren metylering, i samsvar med reaktivering av Nkx3.1 uttrykk på EZH2 knock-down.
ESE-3 undertrykker EZH2 og Aktiverer Nkx3.1 transkripsjon
transkriptomet av ERG
høye og ESE3
lave svulster delte mange gener felles. Dette antydet at ERG og ESE3 kunne påvirke transkripsjonen av mange gener i motsatte retninger, og at ERG opp-regulering og ESE3 nedregulering kunne resulterer i delvis lignende virkninger på prostatakreft transcriptome. Som sett i ERG
høye svulster, EZH2 var signifikant høyere i ESE3
lave svulster i forhold til normal prostata og NoETS svulster (Fig. 5A). Den omvendte forholdet mellom ESE3 og EZH2 uttrykk nivå ble også sett i et selvstendig microarray datasett (Q 0,0004) [14] (figur 5B;. S2D). Disse observasjonene antydet at ESE3 kan negativt regulere EZH2 i prostata og tap av ESE3 kan føre til økt EZH2 uttrykk i prostatakreft. For å teste denne hypotesen, genererte vi kloner av LNCaP celler (ESE3-
kd
) der vi stabilt slått ned ESE3 hjelp shRNA konstruerer. Disse klonene hadde signifikant lavere nivåer av ESE3 sammenlignet med foreldre LNCaP-celler som uttrykker påvisbare nivåer av ESE3 (fig. S5E). I samsvar med vår hypotese, ESE3-
kd
LNCaP cellene hadde høyere uttrykk av EZH2 enn foreldre celler (Fig. 5C). For å avgjøre om ESE3 kontrollert uttrykk for EZH2 også i normale prostata epitelceller vi stabilt knock-down ESE3 i udødeliggjort LHS celler [32], som vi har vist tidligere å uttrykke ESE3 [11]. Som vist på fig.
