Abstract
Bakgrunn
p63 er et medlem av p53 familie som har vært innblandet i vedlikehold av epiteliale stamcelle avdelinger. Tidligere studier har vist at p63 er nedregulert i muskel-invasiv blærekreft, men forholdet mellom p63 uttrykk og overlevelse er ikke klart.
Metodikk /hovedfunnene
Vi brukte real-time PCR for å karakterisere p63 ekspresjon og flere gener involvert i epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT) i humane blærecancercellelinjer (n = 15) og de primære tumorer (n = 101). Vi korrelert svulst markør uttrykk med scene, sykdomsspesifikke (DSS), og total overlevelse (OS). Uttrykk av E-cadherin og p63 korrelert direkte med hverandre og omvendt med uttrykk for mesenchymale markører Zeb-en, Zeb-2, og vimentin. Ikke-muskel-invasiv (Ta og T1) blærekreft jevnt uttrykt høye nivåer av E-cadherin og p63 og lave nivåer av mesenchymale markører. Interessant, tumorer et delsett av muskel-invasiv (T2-T4) opprettholdes høye nivåer av E-cadherin og p63 ekspresjon. Som forventet, var det en sterkt signifikant korrelasjon mellom EMT markør ekspresjon og muskel invasjon (p 0,0001). Men OS var kortere hos pasienter med muskel-invasiv svulster som beholdt p63 (p = 0,007).
Konklusjon /Betydning
Våre data bekrefter at molekylære markører for EMT er forhøyet i muskel-invasiv blærekreft, men interessant, retensjon av «epiteliale» markør p63 i muskel-invasive tumorer er forbundet med et dårligere resultat
relasjon:. Choi W, Shah JB, Tran M, Svatek R, Marquis L, Lee IL, et al. (2012) p63 uttrykk Definerer en dødelig Delsett av muskel-invasiv blærekreft. PLoS ONE 7 (1): e30206. doi: 10,1371 /journal.pone.0030206
Redaktør: Wafik S. El-Deiry, Penn State Hershey Cancer Institute, USA
mottatt: 22 juli 2011; Godkjent: 12 desember 2011; Publisert: 10 januar 2012
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Cancer Center Support Grant (CA016672) og MD Anderson SPORE i Genitourinary Cancer (CA091846). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blære kreft utvikles langs to «spor» produserende svulster med svært ulike kliniske kjennetegn [1]. En fører til dannelsen av papillærtumorer med høy tilbakefallsprosent som sjelden metastasize eller forårsake død, mens den andre fører til utvikling av ikke-papillær, muskel-invasiv tumorer, hvorav en undergruppe utvikler seg raskt og er dødelig. I dag er det umulig å prospektivt identifisere de dødelige muskel-invasiv tumorer; Men, samler bevis tyder på at molekylær omprogrammering karakteristisk for en utviklingsprosess som kalles epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT) er involvert. Muskel-invasiv kreft er preget av nedregulering av E-cadherin og p63, to «epitelceller» markører jevnt uttrykt i normal urothelium og hos ikke muskel-invasiv kreft [2] – [5]. Disse endringene er ledsaget av oppregulering av mesenchymale markører Zeb-en, Zeb-2, vimentin, og MMP9, som fører til økt invasjon og migrasjon. En rolle for EMT i å drive blærekreft, progresjon og metastaser er forenlig med en stor mengde bevis som kommer i andre faste tumorer, spesielt brystkreft [6] – [8]. Videre kan håndheves ekspresjon av EMT regulatorer forårsake forandringer som minner om den som ble observert i kreft stamceller [8] – [10]. Fordi kreft stamceller synes generelt å være motstandsdyktig mot konvensjonell kjemoterapi, koblingen mellom EMT og «stemness» gir ekstra støtte for ideen om at EMT bidrar til dødelighet.
Vi innledet denne studien å direkte teste hypotesen om at EMT markører kunne identifisere undergruppe av muskel-invasiv svulster som viser aggressiv klinisk atferd. I humane blærecancercellelinjer, observerte vi en direkte sammenheng mellom E-cadherin og p63 ekspresjonen, og en invers korrelasjon mellom disse markører og Zeb-1, Zeb-2, og vimentin, noe som indikerer at de cluster inn i unike «epithelial» og «mesenchymale «undergrupper. Våre data bekrefter at mesenchymale markører (Zeb-1, Zeb-2, MMP og vimentin) uttrykkes nesten utelukkende av muskel-invasive svulster [11], [12], den delen av blærekreft med verre utfall. Interessant, våre data viser også at innenfor denne muskel-invasiv undergruppe, tumorer beholder p63 (som ser ut til å være en «epitelial» markør), vise signifikant dårligere overlevelsen enn de muskel-invasive tumorer som viser en mer typisk «mesenchymale» fenotype. Vi diskuterer mulige forklaringer på sammenhengen mellom p63 og dårlig overlevelse utfallet.
Resultater
Uttrykk av EMT markører i publiserte genuttrykk datasett
Vi først undersøkt uttrykk for EMT markører i to offentlig tilgjengelige genuttrykk profilering datasett [13], [14]. I begge unsupervised hierarkisk clustering skilles overfladiske fra muskel-invasiv sykdom [13], [14]. Overfladiske svulster uttrykt høyere nivåer av «epitel» markør E-cadherin enn muskel-invasiv tumorer; omvendt, muskel-invasiv tumorer uttrykt høyere nivåer av «mesenchymale» markører (figur 1A-B)
A B: Alle EMT markørgener med betydelige forskjeller i uttrykk (P 0,001) i 2 uavhengige offentlig tilgjengelige datasett. En in-house cDNA microarray med 10368 prober ble brukt i A [13]. HU-133A Affymetrix plattform ble brukt i B [14].
Relasjoner mellom EMT markører i menneskeblærekreftcellelinjer
neste målte uttrykk for EMT markører i 15 blæren kreft cellelinjer av kvantitativ real-time PCR. Resultatene antydet eksistensen av 2 dikotome undergrupper av svulster, en visning av en «epitel» mønster preget av uttrykk for E-cadherin og p63; den andre karakterisert ved ekspresjon av «mesenchymale» markører Zeb-1, Zeb-2, og vimentin (figur 2A-B). Kvantifisering av både p63 mRNA (figur 2B) og protein (data ikke vist) nivåer viste det ble uttrykt utelukkende av E-cadherin-positive, «epiteliale» cellelinjer, og at ekspresjon av imidlertid lite antall cellelinjer for hvilke MMP’er ble hevet virkninger betydningen av denne observasjonen. Viktigere, tidligere undersøkelser konkluderte med at «mesenchymale» blærecancercellene er som en gruppe meget inngripende og motstandsdyktig mot stråling og EGFR-rettet terapi [11], [12], [15] – [17], som tyder på at de kan ha ugunstige biologiske egenskaper .
(A) mRNA uttrykk for E-cadherin, Zeb-en, Zeb-2 og vimentin ble målt ved hjelp av kvantitativ real-time PCR. En invers korrelasjon mellom E-cadherin og Zeb-1 /Zeb2 ble observert i cellelinjene. (B) mRNA-ekspresjon av total p63, ble TAp63 og 0,0001, fig S1A) . I likhet med vår cellelinje-data, 0,0001, figur S1B). Som vi hadde observert i cellelinjer, var uttrykk for E-cadherin direkte forbundet med uttrykk av p63 (Spearmans korrelasjonskoeffisient rho = 0,32, p = 0,0028) og omvendt med uttrykk av Zeb-en (rho = -0,37, p 0,0001) , Zeb-2 (rho = -0,48, p 0,0001), og vimentin (rho = -0,49, p 0,0001). På den annen side, selv om MMP2 og MMP9 ble også uttrykt ved høyere nivåer i muskel-invasive svulster sammenlignet med overfladiske svulster (begge p-verdier og lt; 0,0001, figur S1C), gjorde vi ikke observere så sterke sammenhenger mellom uttrykk for MMP2 og MMP9 og ekspresjon av p63 i enten det samlede sett av tumorer (Spearmans rho korrelasjon = -0,17, p = 0,08, mellom p63 og MMP9, og rho = -0,24, p = 0,01 mellom p63 og MMP2), eller i den undergruppen av muskel-invasiv pasienter (rho = -0,15, p = 0,21, mellom p63 og MMP9, og rho = -0,23, p = 0,065 mellom p63 og MMP2). Men en sterk invers korrelasjon mellom E-cadherin og MMP9, og MMP2 ble likevel opprettholdt (rho = -0,46, p 0,001 med MMP9, rho = -0,38, p 0,001 med MMP2) i den totale gruppen, og de samme assosiasjoner ble observert i muskel-invasiv pasienter (rho = -0,45, p 0,001 med MMP9, rho = -0,39, p = 0,002 med MMP2).
(A) uttrykk for kjerne E-cadherin-relaterte EMT markører (E-cadherin, p63, Zeb-en, og Zeb-2) i 101 primær blæren svulster ble vurdert av kvantitativ real-time PCR. (B) Uttrykk for MMP2, MMP9, og vimentin. (C) Ekspresjon av TAp63 og 1,60 ble oppnådd ved å bruke regresjon treet analyse. Spesielt ble forhøyet p63 forbundet med en signifikant dårligere median OS 8 måneder (95% konfidensintervall av 4, 140 måneder), mens pasienter med lavere nivåer av p63 hadde en forbedret median OS på 27 måneder (95% KI av 17, 85 måneder, log-rank p = 0,007). Analyser av resultatene for DSS resultater var lik dem for OS resultat. Forhøyet p63 var assosiert med en median DSS 8 måneder med 95% konfidensintervall (19, 140) måneder, mens pasienter med lavere nivåer av p63 hadde en forbedret median DSS av 41 måneder (95% KI: 19, 140 + måneder , log-rank p-verdi = 0,004). Selv i denne muskelen-invasiv gruppe, vedlikehold av p63 direkte korrelert med uttrykk for epiteliale markører (E-cadherin rho = 0,34, p = 0,006), og omvendt med mesenchymale markører (vimentin: rho = -0,35, p = 0,0047; Zeb -1: rho = -0,36, p = 0,003, og Zeb-2: rho = -0,39, p = 0,0014, henholdsvis). Interessant, oppbevaring av p63 i pasienter som er klassifisert som å ha T1 svulster ble også assosiert med signifikant negativ overlevelse utfallet. Pasienter med T1 sykdom med høyere nivåer av p63 hadde en median overlevelse på 58 måneder, mens det var ingen sykdomsrelaterte dødsfall hos pasienter med lavere nivåer av p63 i denne undergruppen (data ikke vist).
Alle p- verdiene som oppgis er 2-sidig, med log-rank test. A: Forhøyede p63 var assosiert med negative utfall hos pasienter med muskel-invasiv kreft (median OS 8 måneder, 95% konfidensintervall 4, 140 måneder), som sammenlignet med lavere uttrykk av p63 (median OS 27 måneder, 95% CI av 17 , 85 måneder) log-rank p = 0,007. B: Forhøyede p63 var assosiert med uønskede DSS hos pasienter med muskel-invasiv kreft (median DSS 8 måneder, 95% CI 19, 140), mens pasienter med lavere nivåer av p63 hadde en forbedret median DSS av 41 måneder (95% CI 19 , 140 + måneder, log-rank p = 0,004). C: Økt MMP9 er forbundet med negativt resultat (median OS 10,2 måneder, 95% CI i4.9, 26,6) sammenlignet med lavere MMP9 (median OS 35,4 måneder, 95% CI 19,3, 107,9, p = 0,003). D: Forhøyede MMP9 var assosiert med uønskede DSS (median 10,3 måneder, 95% KI: 4,9, 140+) sammenlignet med lavere MMP9 (median DSS 140; 95% KI: 19,3, 140+ måneder, p = 0,01). E (OS) og F (DSS): Ved hjelp av en multivariat Cox regresjonsmodell, p63 og MMP9 var uavhengige prediktorer for uønskede utfall i muskel-invasiv sykdom. Pasientene ble tildelt 1 poeng hver for enten forhøyet p63 eller MMP9 (0 = ingen forhøyet, 1 = enten forhøyet, 2 = begge forhøyet). Verste overlevelse ble observert når begge merkene ble forhøyet, og best når verken ble forhøyet (median OS for 0, 1 eller 2: = 69, 10 måneder, og 8 måneder, med en 5-års OS eller 55%, 8 %, og 0% henholdsvis).
I en tidligere studie viste vi at en lav E-cadherin /MMP9 forholdet var også assosiert med en negativ overlevelse utfallet. Derfor har vi også vurdert forholdet mellom MMP9 uttrykk og OS i denne kohorten (figur 4C og D). I samsvar med den tidligere data, ble ekspresjon i høyt nivå av MMP9 i forbindelse med kortere OS (median OS 10,2 måneder, 95% CI 4,9, 26,6) sammenlignet med de tumorer som uttrykker lavere mengder av MMP9 (median OS 35,4 måneder, 95% CI 19.3, 107,9, p = 0,003, figur 4C). Likeledes median DSS var kortere med ekspresjon på høyt nivå av MMP9 (median DSS 10,3 måneder, 95% CI 4,9, 140 + måneder) og sammenlignet med dem som uttrykker lavere mengder av MMP9 (median DSS 140, 95% CI 19.3, 140+ måneder, p = 0,01, figur 4D).
Vi har også bekreftet sammenhengen mellom forhøyet p63 og dårlig overlevelse i muskel-invasiv urothelial kreft ved hjelp av en uavhengig gen-uttrykk datasett (GEO Tiltredelse antall GSE13507 [24]) Bruke regresjon-tree-analyse, ble innhentet cut-off point for p63 høyde. Forhøyet p63 var assosiert med en betydelig dårligere OS og DSS (log-rank p = 0,012 og 0,002, henholdsvis figur S2). Andre forsøk på vev bekreftelse ved hjelp av immunhistokjemi i en muskel-invasiv blærekreft vevet microarray var mangelfulle, i stor grad som et resultat av mangel på spesifisitet av kommersielt tilgjengelige 4A4 antistoff for henholdsvis = 69, 10 måneder, og 8 måneder, med en 5-års OS på 55%, 8% og 0%). Proporsjonale farer forutsetninger for hver risikofaktor er fornøyd i regresjonsmodellen for enten 67 muskel-invasiv pasienter, eller 101 pasienter med primær blærekreft.
Diskusjon
Tidligere studier konkluderte med at tap av p63 er forbundet med kortere overlevelse hos pasienter med blærekreft [3], [20]. I motsetning til våre resultater tyder på at vedlikehold av p63 uttrykk er forbundet med negative utfall hos pasienter med muskel-invasiv blærekreft. På overflaten våre resultater ser ut til å motsi disse andre studier. Men vi mistenker denne tilsynelatende avviket skyldes delvis til inkludering av overfladiske kreft viser jevnt gode overlevelsesegenskaper i tidligere analyser i motsetning til vår nåværende fokus på deres innflytelse i muskel-invasiv sykdom. Som gruppe er de mest overfladiske blære kreft har utmerket langsiktig overlevelse (nær 100%), og jevnt uttrykte høye nivåer av E-cadherin og p63. På den annen side er tapet av p63 begrenset til et undersett av muskel-invasive tumorer, og muskel-invasiv sykdom er vanligvis assosiert med dårligere kliniske resultater som sammenlignet med overfladisk, ikke-invasiv kreft. Derfor inkludering av overflatiske tumorer jevnt viser en «epitel» fenotype kan fortynne ut en negativ effekt av en «epitel» fenotype i muskel-invasiv kohort. I tillegg kan den kommersielle antistoff (4A4) som er mest brukt til å måle p63 i vevssnitt ikke skille de to store p63 isoformene (TA og 0,001 beregnet fra to-utvalgs t-test med en falsk funnrate (FDR) mindre enn 0,1). For å observere mønstre av EMT genekspresjon, ble hvert gen, justert til en middelverdi på null, som brukes for clustering med Cluster og Treeview [40].
Cellelinjer
Cellelinjer ble erholdt fra MD Anderson Blære SPORE Tissue Bank, og deres identitet validert av DNA fingerprinting hjelp AmpFlSTR® Identifiler® Amplification (Applied Biosystems, Foster City, California) eller AmpF
l
STR® Profiler® PCR forsterkning (Applied Biosystems), utført av MD Anderson Karakterisert cellelinje Core, eller selv, henholdsvis. Disse fingeravtrykk er tilgjengelig på MD Anderson blæren SPORE nettside. Cellelinjer ble dyrket i modifisert Eagles MEM supplert med 10% føtalt bovint serum, vitaminer, natriumpyruvat, L-glutamin, penicillin, streptomycin, og ikke-essensielle aminosyrer ved 37 ° C i 5% CO
2 inkubator.
Menneskelige prøver
kliniske utfall data og pasientprøver for real-time PCR ble oppnådd for 101 pasienter fra MD Anderson urin kreft forskning database. Dypfryst vev ble hentet fra vår SPORE Tissue Core. Prøver ble samlet ved hjelp av macrodissection fokus på områder med minst 80% tumor-konsentrasjon. Alle pasientene hadde tidligere signert informert samtykke slik samling av deres vev og kliniske data i vår urin forskningsdatabase. En ytterligere IRB godkjent protokoll ble oppnådd for den spesifikke analyser som beskrives i dette dokumentet. Alle vevsprøver ble anmeldt av en patolog. Pasientene ble klassifisert som muskel-invasiv for tumorvekst i muscularis propria; Ellers ble de klassifisert som overfladisk (non-invasiv muskel). Total RNA fra humane prøver ble isolert ved hjelp av Mirvana ™ miRNA isolasjon kit (Ambion, Inc).
Sanntids revers transkriptase PCR-analyse
EMT markører ble analysert ved Taqman-basert real-time PCR (ABI PRISM 7500, Applied Biosystems). Den komparative CT metoden [41] ble anvendt for å bestemme relative genekspresjon for hvert mål-genet; den cyklofilin Et gen var internkontrollen brukes til å normalisere mengden av forsterkende RNA (Analyse ID-nummer: E-cadherin, Hs00170423_m1, ZEB1; Hs00232783_m1, ZEB2; Hs00207691_m1, vimentin; Hs00185584_m1, MMP2; Hs00234422_m1, MMP9, Hs00957562_m1 og Cyklofilin A; Hs99999904_m1). Primere og fluorescerende prober for P63 isoformer ble designet av Primer Express 3.0 (Applied Biosystems) med følgende sekvenser: TAP63 frem primer 5′-TGCAGGACTCGGACCTGAGT-3 «, reverse primer 5’TGTTCAGGAGCCCCAGGTT-3′, sonder 5»-ACCCCATGTGGCCAC-3 «; = T2). Expression verdier ble sammenlignet mellom overfladisk og muskel-invasiv blærekreft ved bruk av Wilcoxon rank sum test. Korrelasjoner mellom uttrykket av markørene ble kvantifisert ved hjelp av Spearmans rho koeffisienter. Kaplan-Meier-estimat av overlevelse fordeling ble vist ved det undersøkte biomarkør uttrykket kjennetegnet ved høy og lav (for eksempel p63, MMP9), hvor avskjæringen punktet for å definere høy og lav ble oppnådd fra regresjon tre analyser [42]. Den log-rank test ble brukt for å sammenligne overlevelses fordelinger mellom gruppene. Den proporsjonale farer modellen ble brukt til å vurdere virkningene av flere markører og tumorstadium på DSS og OS. Vi utførte en logaritmisk transformasjon av MMP9 uttrykksverdier på grunn av skewedness av dataene. Alle p-verdier som presenteres er to-sidig.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
