Abstract
Mål
Fordi leverkreft stamceller (HCSCs) antas å stamme fra konvertering av lever normale stamceller (HNSCs), identifisering av forskjellene som skiller HCSCs fra HNSCs er viktig.
Metoder
HCC modellen ble etablert i F344 rotter ved DEN induksjon. Ved hjelp av FACS-analyse, side populasjonsceller fra HCC (SP-HCCs) ble isolert fra de epitele-lignende celler av HCC vev, og de sidebefolknings celler fra normal lever (SP-NLCS) ble isolert fra syngeniske normale leverceller. Uttrykket av stamcellemarkører ble påvist i både fersk isolert og forsterket subpopulasjoner. Etter induksjon med HGF, ble differensieringen av hver undergruppe analysert ved påvisning av tidlige og sene lever markører. In vivo, ble de biologiske egenskapene til SP-HCCs og SP-NLCS analysert ved å reparere skadede lever eller danne tumorer i nakne mus. I tillegg ble et uttrykk for miRNAs undersøkt i begge populasjoner av miRNA matrise og QRT-PCR.
Resultater
SP-NLCS og SP-HCCs var 4,30 ± 0,011% og 2,100 ± 0,010% av hele befolkningen, henholdsvis. Både SP-NLCS og SP-HCCs vises større uttrykk for stamcellemarkører (CD133 og EpCAM) enn NSP-NLCS og NSP-HCCs henholdsvis (
P
0,01), både etter fersk isolering og forsterkning. Ved HGF induksjon, SP-NLCS generert mange ALB positive celler og noen CK-7 positive celler, men NSP-NLCS kan generere bare ALB positive celler. I motsetning til dette, SP-HCCs ga opphav til kun AFP-positive celler. Så få som 5 x 10
5 SP-NLCS var i stand til å reparere leverskade, mens det samme antall NSP-NLCS ikke kunne reparere leveren. Videre er bare en x 10
4 SP-HCCs var nødvendig for å initiere en tumor, mens NSP-HCCs ikke kan danne en svulst. Sammenlignet med SP-NLCS, 68 oppregulert og 10 nedregulert mirnas var tilstede i SP-HCCs (
P
0,01).
Konklusjon
Basert på de avgjørende roller noen mirnas i tilblivelsen av HCSCs, kan mirnas bidra til de forskjellige egenskapene som skiller SP-HCCs fra SP-NLCS
Citation. Liu Wh, Tao Ks, Du N, Liu Zc, Zhang Ht, Dou Kf (2011) Forskjeller i Egenskaper og Mirna Expression profiler mellom Side pasient fra leverkreftceller og normale leverceller. PLoS ONE 6 (8): e23311. doi: 10,1371 /journal.pone.0023311
Redaktør: Xin Wei Wang, National Cancer Institute, USA
mottatt: 02.09.2010; Godkjent: 15 juli 2011; Publisert: 03.08.2011
Copyright: © 2011 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Natural Science Foundation National of China (nr 30772102) og Science Foundation Nature of Shaanxi-provinsen (No. 2007K09-05 (7)). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Økende bevis har vist at kreftformer inneholde en liten del av sin egen stilk-lignende celler, som kalles «kreft stamceller» (cscs) [1], [2], [3], som er mest påvirket av både tumor-suppressorer og kreftinduse [4], [5], [6]. HCC inneholder også lever cscs (HCSCs), som har størst potensial til å spre seg og invadere omkringliggende vev [7]. Nyere publikasjoner har vist at HCSCs kan stamme fra lever normale stamceller (HNSCs) [8]. Selv den første hendelsen som forvandler HNSCs til HCSCs er foreslått å være en form for deregulering av HNSCs selvfornyelse [9]. Således sammenligner egenskapene til HNSCs og HCSCs er viktig. Normal lever er rik på HNSCs [10], og den forslag om at disse HNSCs kan tjene som en optimal kontroll for å studere egenskapene av HCSCs er rimelig. Men molekylære markører som definerer både HCSCs og HNSCs forbli kontroversiell; Derfor har isolering av side populasjon (SP) celler blitt mye brukt for å berike begge typer av stamceller [11]. SP-celler har vist seg å være umodne og udifferensierte celler og til å uttrykke høye nivåer av noen spesifikke stamcellemarkører [12]. Således er isolasjonen av SP-celler en alternativ kilde til stamceller, noe som er spesielt nyttig i situasjoner hvor stamcelle markørene er ukjent [12]. Hos mus og rotter, vises SP fenotypen til å være et felles trekk ved stamceller som omfatter normale og kreft stamceller [13], [14], [15]. I leveren, har disse SP-celler blitt vist å tjene en sentral rolle i leveren regenerering og leverkreft [16]. Derfor kan SP celler anses hensiktsmessige alternativer for å studere HNSCs og HCSCs.
mirnas er fremstår som viktige regulatorer av post-transcriptional genregulering. Betydningen av mirnas understrekes av det faktum at de ofte er deregulert i løpet av karsinogenese [17], [18], [19], [20]. Noen mirnas kan fremme tumorvekst gjennom felles mekanismer som bidrar til miRNA-regulert cellesykluskontroll [21]. I tillegg har mirnas blitt vist å være en integrert del av stamcelle regulering, herunder normale stamceller (NSC) og cscs [22]. En forstyrrelse av nøkkel miRNA-mRNA nettverk i NSC har blitt foreslått å være et kjennetegn på cscs [23]. Faktisk har en enkelt onkogen (miRNA-145) blitt vist å omprogrammere primære celler for å vise en cscs fenotype [24]. Dermed er identifisering av felles og unike uttrykk mønstre av mirnas mellom HCSCs og HNSCs avgjørende.
I denne studien har vi brukt SP analysen til to forskjellige populasjoner av primære dyrkede epitelceller. En celletype ble isolert fra rotte HCC vev indusert av diethylinitrosamine (DEN) og den andre celletypen ble isolert fra syngene rottelevervevet. Side populasjoner fra normale leverceller (SP-NLCS) og fra HCCs (SP-HCCs) sterkt uttrykt stamcellemarkører.
In vitro
, både SP celler hadde høye kapasiteter til å formere seg og kan differensieres til modne celler ved induksjon med hepatocytter vekstfaktor (HGF).
In vivo
, SP-NLCS kan i stor grad hjelpe til med å reparere en skadet rottelever. I kontrast, kan SP-HCCs initiere svulster både i underhud og lever vev av ikke-overvektige diabetikere /alvorlig kombinert immunsvikt (NOD /SCID) mus. Forutsatt at disse forskjellene var knyttet til de svært ulike uttrykk mønstre av mirnas mellom disse to cellepopulasjoner, undersøkte vi de miRNA profiler av SP-NLCS og SP-HCCs. Fordi HCSCs foreslås HCC initiere celler, identifisere forskjellene mellom SP-HCCs og SP-NLCS, inkludert deregulerte mirnas, kan i stor grad hjelpe til å forstå opprinnelsen til HCSCs og tumorigenesis av HCC.
Materialer og Metoder
1. Prøvetaking
Tretti mannlige Fisher 344 rotter (fra Nasjonal gnagere Laboratory Animal Resource, Shanghai, Kina) ble tilfeldig delt inn i kontroll- og prøvegrupper. Rotter i prøvegruppen ble behandlet med 0,05% DEN (Sigma Co., USA) i drikkevannet i 6 uker og ble deretter endret til vanlig drikkevann [25], mens rottene i kontrollgruppen ble gitt en normal diett. Tre rotter fra hver gruppe ble avlivet under bedøvelse ved 2, 6, 10, 14 og 18 uker etter induksjon DEN. Begge HCC noduler fra prøvegruppen og normal lever fra kontrollgruppen ble oppsamlet. Deler av disse vevene ble fiksert i 10% fosfatbuffret formalin nøytral og behandles rutinemessig og farget med Hematoxylin og Eosin (H Santa Cruz, California) ble valgt. I korthet med kulturmediet fjernet, cellene i kulturen lysbilde ble skylt to ganger med PBS, fiksert med 4% paraformaldehyd i 20 minutter og deretter senket ned i PBS i 10 minutter, etterfulgt av eksponering til 0,01% Triton X-100 ved romtemperatur i 10 min. For å blokkere ikke-spesifikke immunreaksjoner, ble cellene behandlet med 6% geiteserum (Santa Cruz, CA) ved romtemperatur i 30 min. Cellene dyrkes i hvert lysbilde ble utsatt for primære antistoffer ved 4 ° C over natten og ble vasket tre ganger med kald PBS. Det fluorescerende FITC-konjugert geite-anti-kanin-sekundært antistoff (fortynning 1:100, Santa Cruz, CA) ble tilsatt og inkubert i 2 timer. Deretter ble cellene behandlet med 2- (4-amidinofenyl) -6-indolecarbamidine dihydroklorid (DAPI) (fortynning 1:100; Sigma) i 15 min. Fluorescensen ble observert gjennom et passende filter ved hjelp av et fluorescens mikroskop (FV1000MPE, Olympus Co., Tokyo, Japan).
8. Påvisning av lever markører av western blotting
Etter induksjon av HGF, western blotting ble utført for å kvantitativt påvise spesifikke levermarkører i de induserte celler. ALB og CK-7 ble undersøkt i SP-NLCS, NSP-NLCS og SSP-NLCS; AFP og CK-19 ble analysert i SP-HCCs, NSP-HCCs og SSP-HCCs. Cellene ble lysert i hel-celle utvinning buffer (RIPA buffer) som inneholder en proteasehemmer cocktail tablet (Complete-Mini, Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland). Homogenatene ble sentrifugert ved 3000 x g i 20 minutter ved 4 ° C, og supernatantene ble samlet. Proteinene ble separert på 12% SDS-polyakrylamid-gel og overført til en Immobilon-P PVDF (polyvinylidenfluorid) membran (Millipore, Billerica, MA, USA). Blottene ble mettet med blokkeringsbuffer (5% skummet melk i TBS-T) i 1 time ved romtemperatur og deretter inkubert over natten ved 4 ° C med kanin-anti-human /rotte /mus monoklonale antistoffer (1:600; Santa Cruz Biotechnology , Inc., Santa Cruz, CA) og et glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) antistoff (1:600, Sigma, St. Louis, MO). Etter å ha vasket i TBS-T, ble membranene inkubert i 1 time ved romtemperatur med HRP-geit-anti-kanin IgG (1:2000; Perkin Eimer, Inc., Waltham, MA). Påvisning av proteiner ble utført ved anvendelse av et ECL-system (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). De gråtone verdiene for hvert bånd på de blotter ble målt ved hjelp av BandScan4.3.
9. Leverskade modell og celletransplantasjon
SP-NLCS og NSP-NLCS ble uavhengig av hverandre vasket med PBS i mørket og resuspendert i 2 ml fargeløsning for å merke cellemembranen med rød fluorescens ved 37 ° C, i henhold til protokollen som følger med PKH26 røde fluorescerende celle linker kit (Sigma Corp., USA). Serumholdig medium ble tilsatt til fargeløsning for å avslutte fargingen 5 min senere. Fargede celler ble vasket tre ganger med PBS og suspendert i 0,5 ml PBS for transplantasjon. Å indusere leverskade, 20 normale F344 rotter (10 for SP-NLCS transplantasjon, 10 for NSP-NLCS injeksjon) ble administrert CCI
4 intraperitonealt i en dose på ml /kg kroppsvekt 1,2 og fått to tredjedels delvis hepatectomy (2/3 PH) i tre dager senere. Umiddelbart etter PH, de preparerte celler (5 × 10
5 celler per rotte) ble separat injisert inn i disse rottene gjennom portvenen.
For hver leveren, vi tilfeldig kuttet fire frysesnitt. For å vurdere kolonisering effektene av SP-NLCS og NSP-NLCS ble restaurert leversnitt sett under en invertert mikroskop. Når ble observert røde områder i avsnittene ble resultatet identifisert som positive. Under hvert synsfelt, ble de positive områder telles, og prosentandelen av positive område i forhold til hele området ble beregnet. En prosent av rødt område på mindre enn 5% ble definert som negativ (-), 5-25% som positive (+), 25-50% som moderat positive (++) og 50% så sterkt positive (++ +).
10. NOD /SCID xenograft transplantasjonsforsøk
Ulike tall (1 × 10
7, 1 x 10
6, 1 x 10
5 og 1 x 10
4) av SP- HCCs eller NSP-HCCs ble injisert i NOD /SCID mus ved subkutan injeksjon. Hver gruppe inneholdt 4 mus; Således ble 32 mus anvendt for xenotransplantasjon. Hver mouce ble gjort med 4 injeksjoner, symmetrisk to injeksjoner i venstre back og 2 injeksjoner i rett tilbake. Tumorvekst ble overvåket hver 2 dager etter den andre uken av vaksinasjon. Alle mus ble avlivet på dag 60. Alle de tumorvev ble oppsamlet, fiksert i 4% formaldehyd, og innstøpt i parafin for H E farging for å vurdere tumorhistologi. Alle resultatene ble bedømt av tre forskjellige forskere uavhengig av hverandre. Vi oppsummerte data og beregnede midlere diameter av tumorer i hver gruppe (for eksempel 1 x 10
7 SP-HCCs gruppe). I henhold til den gjennomsnittlige størrelsen av svulster, ble de delt inn i fire forskjellige graderinger: klasse 1 (-), ingen makroskopisk tumor; klasse 2 (+), diameteren av tumor 0,2 cm; klasse 3 (++), 0,2-0,5 cm; grad 4 (+++), . 0,5 cm
11. Uttrykket av miRNAs i SP celler
Totalt RNA ble hentet fra både SP-NLCS og SP-HCCs av Totally RNA isolering kit (Ambion, Austin, TX). Kvaliteten og kvantiteten av det totale RNA ble kontrollert ved 1,5% agarose-gel-elektroforese og ultrafiolett kvantifisering. Uttrykket profiler av mirnas ble så oppdaget av miRCURY LNA ™ (låst nukleinsyre) mikroRNA Arrays Kit (Exiqon Co, Danmark), som dekker alle menneske, mus og rotte miRNA antisense sekvenser. I tillegg settet også innlemmet 144 miRPlus ™ sonder, som ble gitt av Exiqon Corporation for romanen miRNA deteksjon. En mikrogram av RNA fra SP-HCCs, SP-NLCS og referanse bassenger var co-hybridisert på Exiqon miRNA Array i 16 timer ved 56 ° C. Etter inkubasjon med Cy3-merket dendrimerer (Genisphere Inc, Hatfield, PA) [29] ble microarrays vasket etter hverandre med vask buffere A, B og C. De fluoriserende signaler på den hybridiserte matrisen ble fanget av en GenePix 4000B skanner og kvantifisert ved hjelp GenePix Pro4.0 (Axon Instruments, Burlingame, CA). Datamanipulasjon ble tilrettelagt med Normalisering Suite v1.63 (Ontario Cancer Institute, Toronto, Canada) [30]. Testen til referanseforhold for hver miRNA ble i gjennomsnitt fra tre eksemplarer flekker og mellom replikere eksperimenter. Prosenter større eller mindre enn to ganger ble ansett for å være oppregulert eller nedregulert, henholdsvis.
To svært oppregulert mirnas, tre litt opp-regulerte mirnas, en kraftig nedregulert miRNA og en moderat nedregulert miRNA ble valgt som representative mirnas som skal godkjennes av kvantitativ real time polymerase chain reaction (QRT-PCR). Total RNA ble revers-transkribert ved MultiScribe (Applied Biosystems) i reaksjonsblandinger inneholdende MIR-spesifikke stem-loop revers-transkripsjon (RT) primere (tabell 1). PCR-primere er oppført i tabell 1, og syklusparameterne for PCR-reaksjonen var 95 ° C i 15 minutter etterfulgt av 40 sykluser med et denatureringstrinn ved 95 ° C i 15 sek, og en gløde /forlengelsestrinn ved 60 ° C i 60 sek. Alle reaksjoner ble kjørt i triplikat. Den relative mengde av hver miRNA til U6 RNA ble beskrevet av ligningen A C
T = (C
TmiRNA-C
TU6) [31]. The ganger endring i mirnas fra SP-HCCs sammenlignet med SP-NLCS vises ved hjelp av ligningen 2
-ΔΔCT, hvor ΔΔC
T = (A C
T SP-HCCs-A C
T SP- NLCS).
12. Mål av deregulerte mirnas
12.1. . Prediksjon av potensielle mål for deregulerte mirnas
De potensielle mål for deregulerte mirnas funnet av de ovennevnte metoder ble spådd av to offentlig tilgjengelige algoritmer, mål inkludert MiRBase versjon 5 (tilgjengelig på: http: //microrna.sanger .ac.uk /) og Targetscan versjon 4.2 (https://www.targetscan.org/).
12,2 Klassifisering av mål ved semi-kvantitativ sanntid polymerasekjedereaksjon (sqrt-PCR).
Vi oppsummerte påvist målene for sju validerte deregulerte miRNAs. Blant disse målene, ble Mir-200a * målgener ZEB1 og ZEB2 [32], [33] analysert i både SP-HCCs og SP-NLCS av sqrt-PCR. Total RNA ble ekstrahert fra celler ved hjelp Trizol reagens (Molecular Research Center, Cincinnati, OH), og omvendt transkribert til cDNA ved Super II revers transkriptase henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen, Carlsbad, California). Like mengder av cDNA fra disse to prøver ble amplifisert med de følgende spesifikke primere: ZEB1 (Sense 5′- AAGAAAGTGTTACAGATGCAGCTG-3 «, 5′-Antisense CCCTGGTAACACTGTCTGGTC-3′); og ZEB2 (Sense 5»-ATACCAGCGGAAACAAGGATTTCA-3 «, 5’Antisense-CAGGAATCGGAGTCTGTCAAGTCA-3»). Antall PCR-sykluser var 35. Hver syklus besto av denatureringstrinn ved 95 ° C i 30 s, primersammensmeltning trinn ved 65 ° C i 30 s og forlengelsestrinn ved 72 ° C i 45 sek. PCR-produktene ble analysert ved 1,5% agarose-gelelektroforese farget med etidiumbromid.
13. Statistiske analyser
Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standard feil fra minst tre separate forsøk utført i tre eksemplarer. Forskjeller mellom gruppene ble analysert med SAM programvareversjon 3.0 ved hjelp av en dobbeltsidig Student
t
-test når bare to gruppene var til stede, og nullhypotesen ble avvist på 0,05 nivå.
Resultater
1. Vev fremstilling og cellekultur
NL vev oppnådd fra kontrollgruppen var lyse rødt og vises glatte overflater (figur 1 A-i). Når disse lever ble skåret i tynne seksjoner, ble helt normalt levervev avslørt (figur 1A-ii). Ved H E farging ble leveren lobules observert å være i orden (figur 1A-iii). Små NLCS ble valgt av Percoll diskontinuerlige gradient sentrifugering (PDGC) og kultivert. NLCS dannet kloner etter ca 8 dager med kultur (Figur 1A-IV). Etter dyrking i 15 dager, er disse små celler dekket ca. 65% av platens (figur 1A-v). Etter 25 dager, disse homogene cellene nesten fullstendig dekket platene (figur 1A-vi).
(Ai) Morfologi av lever i den ikke-den behandlede gruppe, (A-II) Tynne skiver seksjoner avsløre fullstendig normalt levervev, (A-iii) Histologiske trekk ved normal lever med en regelmessig struktur. Primære dyrkede NLCS for (A-iv) 4 dager, (A-V) 15 dager og (A-VI) 25 dager. Midtre panelet: primære HCC vev segregering og cellekultur. (Bi) Multiple primære HCC knuter i rottelever, hvorav den ene er antydet med en pil, (B-ii) Metastatisk HCC knuter i rotte lungene, som er angitt med piler, (B-iii) Histologiske trekk ved metastatisk HCC vev , hvori normale lunge lobules ble erstattet med karsinom masser; Primære dyrkede HCC celler for (B-iv) 4 dager, (B-v) 15 dager og (B-vi) 30 dager. Nedre panel: isolering av forskjellige subpopulasjoner. (C-i) Uten verapamil: SP-celler ble vist som en prosentandel av NLCS; (C-II) med verapamil: profilen til SP-celler reduseres sterkt. (C-iii) Uten verapamil: SP celler ble vist med lav fluorescens i HCCs; (C-IV) med verapamil: fluorescensen av SP-celler fraksjon forskjøvet til et høyere nivå. (C-v) prosenter av SP celler i ulike grupper er reflektert i et stolpediagram. Opprinnelig forstørrelse 200 x (A, B-iii), 100 x (A, B-iv, v, vi).
Små tumorer ble først funnet i rotter avlivet 8 uker etter DEN induksjon. Etter ytterligere 10 uker, to tredjedeler av de lever inneholdt tumorvev med grove overflater (Figur 1B-i). Vi har også funnet en rekke metastatisk kreft knuter i lungene (Figur 1B-II). Tre forskjellige patologer vurdert H E farging og bekreftet at disse svulstene var alle lever opprinnelse (Figur 1B-iii). Cellene isolert fra den primære HCC vevet økte sakte til å begynne med bare noen få kloner ble dannet (figur 1B-IV). Etter 15 dager ble cellene prolifererte hurtig og dekket 60% av hver plate (figur 1B-v). En måned senere, disse cellene fullt dekket platene (figur 1B-vi).
2. Isolering av SP celler ved FACS
I NLCS gruppen har andelen av SP celler var 4,300% ± 0,011% (figur 1C-i). Når utelukkelse av fargestoffet ble inhibert ved verapamil i kontrollgruppen, SP-celler var nesten identisk med resten av cellene (figur 1C-II). Prosentandelen av SP-celler i HCCs gruppen var 2,100% ± 0,010% (figur 1C-iii). Når utelukkelse av fargestoffet ble inhibert av verapamil, disse SP cellene også kunne ikke skjelnes fra eventuelle kontrolldyr (figur 1C-IV). Profilen på SP-celler i NLCS var signifikant høyere enn i HCCs (
P
0,05). (Figur 1C-v)
3. Selvfornyelse av SP celler
To standard funksjoner kjennetegner stamceller: selvfornyelse og multipotency. For selvfornyelse, SP-HCCs proliferated den raskeste i løpet av 7 dager kultur, etterfulgt av SP-NLCS, SSP-HCCs, SSP-NLCS og NSP-HCCs (som proliferated tilsvarende), og, til slutt, NSP-NLCS (Figur 2A ). Generelt sett, SP cellene proliferated mye raskere enn både NSP celler og SSP celler (
P
0,01), og HCCs proliferated litt raskere enn NLCS. Fordi det opprinnelige antallet av hver cellepopulasjonen var den samme, helt forskjellig celleantall var tilstede i hver gruppe ved slutten av dyrkningsperioden (figur 2B). SP-celler (figur 2B-i, iv) ble funnet å være mer homogen og mye mindre i størrelse enn begge NSP-celler (figur 2B-ii, v) og SSP-celler (figur 2B-iii, vi) (
P
0,01). Imidlertid ble det ikke observert noen signifikante morfologiske forskjellene mellom SP-NLCS (figur 2B-i) og SP-HCCs (figur 2B-iv). Således er disse to populasjonene kunne ikke skjelnes fra hverandre under en invertert mikroskop.
(A) Et cellevekstkurve i løpet av 7 dager i kultur. (B) Etter amplifikasjon ble distinkte celletettheter observert i de forskjellige undergruppene. (C) Et uttrykk for stamcellemarkører (CD133 og EpCAM) var forskjellig i hvert ferskt isolert og amplifisert subpopulasjon av FACS. (D) Den eksakte data ble reflektert av et stolpediagram. CD133 /EpCAM-Fresh indikerer uttrykk for CD133 /EpCAM i nylig isolerte subpopulasjoner, og CD133 /EpCAM-Amplified betyr uttrykket av CD133 /EpCAM i forsterket subpopulasjoner. Original forstørrelse, 100 × (B).
I begynnelsen av kultur, både SP-NLCS og SP-HCCs uttrykte flere av stamcellemarkører enn NSP-NLCS og NSP-HCCs henholdsvis (
P
0,01) (figur 2C). Følgende prosenter av positive celler i hver undergruppe ble observert: CD133 prosenter i SP-NLCS, NSP-NLCS, SSP-NLCS, SP-HCCs, NSP-HCCs og SSP-HCCs var 81,2 ± 7,08, 11,4 ± 1,31, 30,3 ± 3,21 , 86,7 ± 8,32, 12,7 ± 1,39 og 31,6 ± 3,42, henholdsvis; EpCAM prosenter i disse undergruppene var 80,1 ± 8,10, 10,6 ± 1,21, 31,2 ± 3,18, 86,5 ± 3,28, 12,4 ± 1,31 og 32,6 ± 3,67, henholdsvis. Ved slutten av dyrkningsperioden, SP-NLCS og SP-HCCs fremdeles uttrykte mer av stamcelle markører enn NSP-NLCS og NSP-HCCs, henholdsvis (
P
0,01) (figur 2D). Videre er uttrykk for stamcellemarkører redusert mye saktere i SP celler enn i både SSP celler og NSP celler (
P
0,01). Følgende prosentsatser ble observert: CD133 prosenter i SP-NLCS, NSP-NLCS, SSP-NLCS, SP-HCCs, NSP-HCCs og SSP-HCCs var 78,6 ± 6,98, 3,4 ± 0,33, 20,2 ± 2,03, 80,5 ± 7,86, 3,6 ± 0,30 og 20,7 ± 2,38, henholdsvis; EpCAM prosenter i disse undergruppene var 78,1 ± 7,53, 3,5 ± 0,28, 21,5 ± 2,17, 80,3 ± 8,12, 2,3 ± 0,27 og 20,2 ± 2,28, henholdsvis. Under spredning perioden, både SP-NLCS og SP-HCCs opprettholdt den høye uttrykk for stamcellemarkører; i kontrast, både NSP-NLCS og NSP-HCCs gradvis mistet uttrykk for stamcellemarkører. Disse dataene tyder på at SP celler ligner stamceller i sin selvfornyelse kapasitet.
4. Differensiering av SP celler indusert av HGF in vitro
Under induksjon forholdene, hver undergruppe generert forskjellige utvekster. Fordi NLCS bør differensieres til hepatocytter eller galle epitelceller, valgte vi en moden lever markør (ALB) og en galle markør (CK-7) for å identifisere modne celler. De fleste SP-NLCS ekspandert inn ark med tettpakkede celler som viste typiske hepatocytter morfologi og ble identifisert som ALB positive celler (66.9 ± 5.34%). En del av SP-NLCS differensiert i CK-7-positive celler (24,6 ± 2,41%) (Figur 3A). Selv om begge NSP-NLCS og SSP-NLCS kan også generere ALB positive celler, bare flere CK-7 positive celler kan bli funnet i indusert SSP-NLCS, og ingen CK-7 positive celler ble funnet i indusert NSP-NLCS (figur 3A) . Disse data indikerer at kun SP-NLCS hadde et sterkt potensiale til å differensiere i forskjellige typer modne celler. Western blotting viste at selv om cellene generert av NSP-NLCS uttrykt høyere ALB enn cellene fra SP-NLCS og SSP-NLCS, døtre av SP-NLCS uttrykte mye høyere nivåer av CK-7 enn døtre av SSP-NLCS og NSP- NLCS (Figur 3C). Spesielt vises CK-7 nesten ingen uttrykk i døtre NSP-NLCS (Figur 3C). Disse dataene ble konkordant med IF observasjoner.
(A) gjennom IF, ALB positive celler (grønn, kjerner i blått) og CK-7 positive celler (grønn, kjerner i blått) ble ulikt produsert av SP- NLCS, NSP-NLCS og SSP-NLCS. Prosentene av ALB eller CK-7 positive celler er vist i et stolpediagram. (B) I motsetning til dette, kan AFP-positive celler bli funnet etter SP-HCCs, NSP-HCCs og SSP-HCCs induksjon. Dataene er oppsummert i et stolpediagram. (C) Ved western blotting, bretter forskjeller i spesifikke markører forhold til GAPDH ble analysert i indusert SP-NLCS, NSP-NLCS og SSP-NLCS.
