Abstract
Bakgrunn
Femti prosent av pasienter med muskel-invasiv blærekreft (MI-BC) dør av sin sykdom og dagens cellegift behandling bare marginalt øker overlevelse. Nye behandlingsformer rettet mot reseptortyrosinkinaser eller aktiverte onkogener kan forbedre utfallet. Derfor er det nødvendig å stratifisere pasienter basert på mutasjoner i relevante onkogener. Pasienter med ikke-muskel-invasiv blærekreft (NMI-BC) har utmerket overlevelse, men to tredjedeler utvikle tilbakefall. Tumorspesifikke mutasjoner kan brukes til å oppdage tilbakefall i urinanalysen, presentere et mer pasientvennlig diagnostisk prosedyre enn cystoskopi.
metodikk /hovedfunnene
For å løse disse problemene, har vi utviklet en mutasjonsanalyse for samtidig påvisning av 19 mulige mutasjoner i
HRAS
,
KRAS
, og
NRAS
gener. Med denne analysen og mutasjonsanalyser for
FGFR3 Hotell og
PIK3CA
onkogener, vist vi primære blæren svulster av 257 pasienter og 184 tilbakefall fra 54 pasienter. I tillegg, i primære tumorer p53-ekspresjon ble oppnådd ved immunohistokjemi. Av primære svulster var 64% mutant for
FGFR3
, 11% for
RAS
, 24% for
PIK3CA
, og 26% for p53.
FGFR3
mutasjoner var gjensidig utelukkende med
RAS
mutasjoner (p = 0,001) og co-forekommet med
PIK3CA
mutasjoner (p
=
0,016). P53 overekspresjon var gjensidig utelukkende med
PIK3CA Hotell og
FGFR3
mutasjoner (p≤0.029). Mutasjoner i
RAS Hotell og
PIK3CA
gener var ikke prediktorer for tilbakefall-fri, progresjonsfri og sykdomsspesifikk overlevelse. Hos pasienter med NMI-BC grad 3 og MI-BC, 33 og 36% av de primære svulster var mutant. Hos pasienter med lavgradig NMI-BC, 88% av de primære svulster gjennomført en mutasjon og 88% av tilbakefallene var mutant.
Konklusjon /Betydning
De mutasjonsanalyser presentere en følges diagnostisk å definere pasienter for målrettet terapi. I tillegg analysene er en potensiell biomarkør for å detektere tilbakefall under overvåking. Vi viste at 88% av pasienter med lavgradig NMI-BC er kvalifisert for en slik oppfølging. Dette kan bidra til en reduksjon i antall cystoscopical undersøkelser
Citation. KOMPIER LC, Lurkin jeg, van der Aa MNM, van Rhijn BWG, van der Kwast TH, Zwarthoff EC (2010)
FGFR3
,
HRAS
,
KRAS
,
NRAS Hotell og
PIK3CA
Mutasjoner i blærekreft og deres potensial som Biomarkører for overvåking og terapi. PLoS ONE 5 (11): e13821. doi: 10,1371 /journal.pone.0013821
Redaktør: Venugopalan Cheriyath, Cleveland Clinic, USA
mottatt: 18 juli 2010; Godkjent: 13 oktober 2010; Publisert: 03.11.2010
Copyright: © 2010 KOMPIER et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av en Erasmus MC Breedtestrategie Grant (2002-2006) og Nederland Organisasjonen for Health Research and Development (ZON-MW, 945-02-046). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blærekreft er den femte vanligste kreftformen i den vestlige verden [1]. Av blæren svulster 15-20% presenterer som muskel-invasiv sykdom (MI-BC), de resterende gruppen som ikke-muskel-invasiv tumorer (NMI-BC). MI-BC er en ødeleggende sykdom fordi over 50% av pasientene vil dø av metastatisk sykdom. Nylig har nye utbygginger i målrettet terapi ved hjelp av reseptor tyrosin kinase hemmere i andre krefttyper inspirert mulig behandling av pasienter med MI-BC med liknende adjuvant stoffer [2]. For muskel-invasiv blære svulster FGFR3 målrettet terapi blir vurdert [3], [4], [5], [6] og nylig en fase II studie har begynt å undersøke effekten av TKI258, en FGFR3 hemmer, hos pasienter med avansert urothelial kreft (www.ClinicalTrials.gov NCT00790426). Likeledes er den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR) ofte overuttrykt i blærekreft, og kan derfor være et viktig terapeutisk mål for MI-BC [7], [8], [9]. Foreløpig er EGFR målrettet behandling under etterforskning for blærekreft i flere kliniske studier (CALBG-90102, NCT00088946, NCT00380029). Imidlertid har det nylig blitt klart at terapier som målretter reseptortyrosinkinaser ikke kan være effektive når tumorer havnen mutasjoner i RAS-MAPK, eller PIK3CA-AKT baner nedstrøms av reseptorer [10], [11], [12], [13] , [14]. Likevel, medikamenter som hemmer mål nedstrøms i disse banene er i kliniske studier. Dette tyder på at screening blæren svulster for mutasjoner i gener som
FGFR3
,
RAS Hotell og
PIK3CA
kan være av betydning for fremtidige terapi beslutninger. En enkel test som kan implementeres i klinikken vil derfor være ønskelig.
For ikke-muskel-invasiv blærekreft (NMI-BC), er det store problemet at etter første transuretral reseksjon av blæren (TURB) 50-70% av pasientene utvikle flere tilbakefall, med en sjanse på 10-20% som disse vil utvikle seg til MI-BC [15], [16], [17]. Gjentakelse risiko og risikoen for utvikling nødvendiggjøre en livslang oppfølging av cystoskopi. Den gjeldende standarden er å utføre en cystoskopi sammen med urin cytologi hver 3-4 måneder i de første 2 årene og to ganger per år etterpå [18]. Vi har nylig vist at i Nederland pasienter med NMI-BC gjennomgå på gjennomsnittlig 20 cystoskopier løpet av de første 9 års oppfølging [17], med en gjentakelse påvist i bare én av sju av disse oppfølgings øyeblikk. For USA og Europa med bestander av 300 og 450 millioner kroner, vil dette beløpe seg til 1 og 1,5 millioner cystoskopier årlig. Reduksjon av antall cystoskopier ved, for eksempel, er en urin-basert test et viktig mål for å forbedre kvaliteten på levetiden [19], [20], [21]. I tillegg kan det føre til kostnadsreduksjoner. Foreløpig er blærekreft den dyreste krefttypen for behandling per pasient [22], [23]. Imidlertid cytologi og mange av de for tiden utviklet urin biomarkører har begrenset sensitivitet for påvisning av lave stadium og grad av svulster som danner hovedgruppen som gjentas (oversikt i [24], [25], [26], [27], [28 ]). Derfor er det behov for mer følsomme urin biomarkører som kan implementeres i molekylære diagnostiske laboratorier.
NMI-BC og MI-BC er genetisk forskjellige [29], [30]. NMI-BC tumorer er kjennetegnet ved en høy frekvens av mutasjoner i
FGFR3
oncogen [31], [32] som fører til konstitutiv aktivering av RAS-MAPK-reaksjonsveien [33], [34], [35] , [36], [37]. I MI-BC, mutasjoner i
TP53
genet råde. Mutasjoner i
FGFR3 Hotell og
TP53
i stor grad er gjensidig utelukkende som tyder på at NMI-BC og MI-BC utvikle sammen ulike Oncogenesis trasé [38], [39]. Men i scene PT1 tumorer invadere at bindevevet lag som ligger under urothelium, de ofte opptrer sammen [32], [38], [39]. Nylig, somatiske mutasjoner i
PIK3CA
onkogen, som koder for den katalytiske subenhet p110α av klasse-IA PI3-kinase, ble beskrevet i 13-27% av blæren svulster [40], [41]. Disse mutasjonene ofte falt sammen med
FGFR3
mutasjoner. Mutasjoner i
RAS
onkogener (
HRAS
,
KRAS
,
NRAS
) har også blitt funnet i 13% av blæren svulster og oppstod i all scener og karakterer [41], [42]. De var gjensidig utelukkende med
FGFR3
mutasjoner. Men ingen data finnes om prognostisk verdi, i form av tilbakefall-fri, progresjonsfri og sykdomsspesifikk overlevelse, av
RAS Hotell og
PIK3CA
mutasjoner i blærekreft enten alene eller i kombinasjon med andre endringer. I enkelte krefttyper
PIK3CA
mutasjoner har blitt assosiert med invasivitet og en dårligere prognose [11], [43], [44], [45], [46]. På den annen side, finnes det eksempler på somatiske mutasjoner i godartede hudlesjoner som ikke fremgang [47], [48]. Når det gjelder endringer i RAS og prognose, de siste studier har blitt utført på den prognostiske verdien av uttrykk for RAS p21 protein, men resultatene var ikke konkordant [49], [50], [51]. En fersk studie på uttrykk for
HRAS
i 48 PTA blæren svulster viste en invers korrelasjon uttrykks verdi med tilbakefall og progresjon [52]. Det er imidlertid ingen informasjon om den prognostiske verdien av mutasjoner i tre
RAS
gener i blærekreft.
Vi har nylig vist at med
FGFR3
mutasjonsanalyse på urin prøver fra pasienter med blærekreft det var mulig å detektere tilbakevendende tumorer [53], [54]. Den tekniske utførelsen av
FGFR3
mutasjonsassay i disse studiene var utmerket. Sekstitre prosent av pasienter med NMI-BC er mutant for
FGFR3
. En ekstra mål med denne studien var å undersøke om å legge til
RAS Hotell og
PIK3CA
mutasjon analysen til
FGFR3
mutasjonsdeteksjon kan potensielt øke andelen av pasienter som kan være overvåket ved bruk av urin-baserte analyser for disse mutasjonene. I tillegg kan disse analysene være til nytte i klinikk for å definere pasienter som kan dra nytte av målrettet terapi. Vi har derfor utviklet en multiplex mutasjonsanalyse for påvisning av de hyppigst forekommende
HRAS
,
KRAS
, og
NRAS
mutasjoner i blærekreft. Denne analyse er basert på analyser som vi tidligere utviklet [53], [55], [56]. I vår erfaring, disse analysene er følsom, lett å utføre og å tolke, og krever bare noen få nanogram DNA. Analysene er også vellykket på DNA fra formalinfiksert parafin innebygd (FFPE) vev eller urin [53], [54], [56].
Vi har senere undersøkt mutasjon spekteret av
FGFR3
,
HRAS
,
KRAS
,
NRAS Hotell og
PIK3CA
i en stor serie av primære svulster i 257 pasienter med NMI-BC og mikro BC. Mutasjon status ble også sammenlignet med p53 uttrykk. Fordelingen av endringer i disse seks gener sammen ikke har blitt undersøkt i blæren svulster før. Vi har videre vist 184 tilbakefall av 54 pasienter for å bestemme hvorvidt mutasjonstatus er konsistent i tilbakefall med det formål å undersøke om det er nyttig å starte en langsgående studie på overvåking med disse mutasjonsanalyser for påvisning av tilbakevendende blærekreft i annulleres urinprøver fra pasienter . Hyppigheten av mutasjoner i
RAS Hotell og
PIK3CA
i en langsgående innstilling inneholder flere tilbakefall av samme pasient har også ennå ikke før undersøkt.
Vi konkluderer med at mutasjonen analyser presentere en følges diagnostisk å stratifisere pasienter med MI-BC for målrettet terapi. I tillegg, siden 88% av de primære svulster i pasienter med lavgradig NMI-BC gjennomført en mutasjon i
FGFR3
,
RAS
, og /eller
PIK3CA
gener og 88% av tilbakefallene ble mutant, analysene er en potensiell verktøy for å detektere tilbakevendende i DNA erholdt fra urinprøver under overvåkning, noe som kan bidra til en reduksjon i antallet cystoscopical undersøkelser og er verdt å undersøke.
Metoder
Pasient egenskaper og etikk Vern
Formalin fiksert parafin innebygd (FFPE) prøver av primære svulster i en uselektert gruppe av 257 pasienter ble hentet fra Erasmus MC og St Franciscus Gasthuis, Rotterdam, Nederland. Tumorprøvene representerer en undergruppe av 286 prøver som vi tidligere beskrevet [32]. Ingen vev var tilgjengelig lenger for de 29 savnede prøvene. Gjennomsnittsalderen for denne gruppen av pasienter ved diagnose var 65,7 år og mannlig /kvinnelig forholdet var 3/1. Svulster ble iscenesatt i henhold til Tumor metastaser klassifisering av 1997 [57] og karakterer ble klassifisert i henhold til Verdens helseorganisasjon kriteriene for 1973 [58]. Blant de primære svulster, var det 166 PTA, 57 PT1, og 34 pT2-4 svulster. Karakteren fordelingen var 84 klasse 1, 117 grad 2 og 56 klasse 3 svulster. Av 54 pasienter som ble behandlet ved Erasmus MC og hadde utviklet en eller flere tilbakefall, ble formalinfiksert parafin innebygd vev samlet inn fra 184 påfølgende tilbakefall. Kliniske data av tumorene ble oppnådd fra pasientens sykdomshistorie. Data ble analysert anonymt. FFPE-prøver ble brukt i henhold til de standarder som presenteres i «The Code for riktig sekundær bruk av menneskelig vev i Nederland» (https://www.federa.org/). Informert samtykke ble derfor ikke nødvendig å bli erholdt. Dette ble godkjent av vår Institutional Review Board. En tilbakefall ble definert som en svulst fjernet ved transuretral reseksjon som senere ble bekreftet å være tumorvev av en patolog. Svulster fjernet innen tre måneder etter transuretral reseksjon ikke ble betraktet som en gjentakelse. Progresjon ble definert som progresjon i scenen og /eller å gradere 3. sykdomsspesifikk overlevelse ble definert som tiden fra diagnose til død av blærekreft. Oppfølgingsperiode ble regnet fra tidspunktet for diagnosen. Sensurere pasienter skjedde på deres siste kliniske besøk eller når en pasient døde. Vanligvis ble pasientene fulgt og behandlet i henhold til retningslinjene fra European Association of Urology [18]. Den medisinske etiske komité av Erasmus University og University Hospital Rotterdam godkjent studiet (METC 168,922 /1998/55).
DNA og mutasjonsanalyse
haematoxylin-eosin fargede objektglass ble brukt for histologisk diagnose og fungerte som maler for manuell mikro disseksjon fra de respektive vevsblokker. De dissekerte tumorprøver inneholdt et minimum av 70% tumorceller. Tumorprøver ble hentet fra Formalin fiksert parafin innebygd svulstvev ved de-voksing med xylen og etanol. DNA ble isolert ved anvendelse av DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland), i henhold til protokollen. P53, MIB-1 og p27
Kip1 immunfarging ble oppnådd fra van Rhijn
et al.
[32].
Primere for multipleks RAS-BC-analysen ble utformet på en slik måte at de enkelte tråder av PCR-produktene inneholdt så lite potensiell sekundær struktur som mulig for å lette effektiv gløding av de mutasjon deteksjonsprober. Primer motivet er videre rettet mot å oppnå identiske annealing temperaturer for å tillate samtidig amplifisering av de relevante eksoner på de tre
RAS
gener i en PCR-reaksjon. Videre er områdene som skal forsterkes ble undersøkt for tilstedeværelse av polymorfismer i databasen til National Center for Biotechnology Information. Ingen polymorfismer i disse regionene ble observert. Mutasjon deteksjon prober for multipleks påvisning av
HRAS
,
KRAS Hotell og
NRAS
mutasjoner ble utformet for å binde til enten forover eller bakover strand rett ved siden av potensialet mutasjon nettstedet . Med analysen, 19 mulige mutasjoner i 10 kodoner i 3
RAS
gener kan påvises. Sammen utgjør disse 96% av all somatisk
HRAS
,
KRAS Hotell og
NRAS
mutasjoner funnet i uroteliale cellekreft ved Sanger Institute (www.sanger.ac.uk /genetikk /CGP /kosmisk). Hvis du vil aktivere for å skille sondene etter størrelse, ble poly (dT) haler av forskjellige lengder lagt. Alle prober ble konstruert for å ha lignende annealing temperaturer, og ble utvalgt for fravær av sekundære strukturer og baseparing med andre prober. Primer og probe sekvenser og konsentrasjoner for de tre multipleks mutasjonsanalyser for
FGFR3, NRAS, HRAS, KRAS Hotell og
PIK3CA
er avbildet i figur 1 og 2.
Hver multipleks PCR-reaksjon ble utført i et totalvolum på 15 pl inneholdende 0,17 mM dNTPs (Roche, Basel, Sveits), 1,5 mM MgCl2, 5% glycerol (Fluka, Buchs SG, Sveits), 0,3 til 1,2 pM passende primer-kombinasjonen (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 x PCR-buffer, og 0,5 enheter av Go Taq DNA-polymerase (Promega, Madison, WI), ved hjelp av 5 ng genomisk DNA som templat. Termiske sykluser besto av innledende denaturering ved 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 35 sykluser på hver 95 ° C i 45 sekunder, 55 ° C i 45 sek, og 72 ° C i 45 sek. Den endelige forlengelse trinnet var 72 ° C i 10 min. Unincorporated primere og deoksynukleotidtrifosfatene ble fjernet fra PCR produktene ved tilsetting av 2 enheter Eksonuklease I (ExoI) og 3 enheter reker alkalisk fosfatase (SAP, USB, Cleveland, Ohio USA).
PCR produktene ble deretter analysert for mutasjoner ved hjelp av sonder for hver av de mulige mutasjon områder og SNaPshot® Multiplex Kit (Applied Biosystems, Foster City, California). Mutasjons- deteksjons reaksjoner ble utført i et totalvolum på 10 pl inneholdende 2,5 ul av øyeblikksbilde Multiplex Ready Reaction Mix, 2 ul BigDye sekvense buffer, 1 ul av probe blanding og 1 ul av SAP /ExoI behandles PCR-produkt. Forlengelses reaksjoner som består av 25 sykluser med denaturering ved 96 ° C i 10 sek og gløding /forlengelse ved 58,5 ° C i 40 sekunder, ble utført i en termosykler. Etter forlengelse ble overskudd av merkede dideoksynukleotid-trifosfater ble fjernet ved behandling med en enhet reker alkalisk fosfatase ved 37 ° C i 60 min og 72 ° C i 15 min. Utvidede primere ble denaturert ved 95 ° C i 5 minutter og separert ved kapillær elektroforese på en automatisk sekvensdanner (ABI PRISM 3130 XL Genetic Analyzer, Applied Biosystems, Foster City, CA), og tilstedeværelse eller fravær av en mutasjon ble indikert ved den fluorescerende merke på innlemmet nucleotide. Detaljer om fargene på mutant og villtype topper er gitt i figur 2. Data ble analysert ved bruk av Genescan Analysis Software versjon 3.7 (Applied Biosystems) og GeneMarker Software versjon 1.7 (SoftGenetics LLC, State College, USA).
statistisk analyse
statistiske analysene ble utført ved hjelp av SPSS statistikkpakke (versjon 15.0, SPSS, Inc., Chicago, IL, 2003). Forskjeller ble betraktet som signifikant hvis p
0,05. Sammenhengene mellom mutasjonsstatus og patologiske og kliniske variabler ble analysert av t-test, Chi-kvadrat test og tosidige Fisher nøyaktige tester. Tilbakefall-fri, progresjonsfri, og sykdomsspesifikk overlevelse av mutasjonsstatus ble analysert ved hjelp av Kaplan-Meier-kurver. De to-sidig log-rank test ble utført for å sammenligne kurvene.
Resultater
Blærekreft konkrete RAS-BC mutasjonsassay
Somatiske mutasjoner i
HRAS
,
KRAS Hotell og
NRAS
gener i blærekreft påvirke kodon 12, 13 og 61. for å lette påvisning av
RAS
mutasjoner har vi utviklet en multiplex RAS-BC mutasjonsanalyse som skjermer for 19 mutasjoner samtidig, som representerer 96% av alle mulige kjente mutasjoner i tre
RAS
gener i blærekreft (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic). Analysen krever bare noen få nanogram DNA og fungerer godt på DNA fra formalinfiksert vev. Figur 3 viser eksempler på RAS-BC-analysen med panel A representerer villtype-situasjon og med spesifikke mutasjoner avbildet i panel B-D
Panel A:. Vill-type prøve, panel B-D: prøvene med mutasjoner. Plassering av forhørt kodon, nukleotider og gener er avbildet nederst.
Mutasjoner i primære svulster
Med RAS-BC analyse og mutasjonsanalyser for
FGFR3
og
PIK3CA
, vist vi primære blæren svulster av 257 pasienter for mutasjoner (figur 4A). Overall, 64% (164/257) av svulstene inneholdt en
FGFR3
mutasjon, totalt 28 (11%) prøvene var mutant for en av de
RAS
gener og 61 (24 %) hadde en
PIK3CA
mutasjon. Tabell 1 viser den type av de identifiserte mutasjoner. Den hyppigste
RAS
mutasjoner var
KRAS
G12D og
HRAS
Q61R.
KRAS Hotell og
HRAS
mutasjoner skjedde med lik frekvens, mens
NRAS
mutasjoner var ikke hyppig i blærekreft. I
PIK3CA
genet, mutasjonene forekom hovedsakelig i de spiralformede domene kodon E545K og E542K. Overall, 18% (11/62) av
PIK3CA
mutasjoner hadde skjedd i kinase domener og 82% i de spiralformede domener. Vi gjorde ikke oppdage endringer E545A veiledende for en polymorfisme i
PIK3CA
pseudogen hvor funksjonen er ukjent [59]. I tre primære svulster, to forskjellige
FGFR3
mutasjoner var tilstede (S249C sammen med A393E, G372C eller R248C). En primærtumor inneholdt to forskjellige
PIK3CA
mutasjoner i de spiralformede domener (E542K og E545K). Det var ingen åpenbare co-forekomst eller gjensidig eksklusivitet mellom de ulike typene av
RAS Hotell og
PIK3CA
mutasjoner.
Frekvenser i alle primære blæren svulster (A) (n = 257) og i bestemte kreftstadier:. PTA /T1-G1 /G2 (B) (n = 194), PTA /T1G3 (C) (n = 29) og muskel-invasive svulster (D) (n = 34)
den primære svulster ble deretter delt i tre undergrupper basert på scenen og karakter; NMI-BC svulster lavgradig (pTaG1-2 og pT1G2), høy grad av NMI-BC (pTaG3 og pT1G3), og muskel-invasive tumorer (≥pT2). I figur 4B-D, fordelinger av
FGFR3
,
PIK3CA Hotell og
RAS
mutasjoner i disse undergruppene er illustrert. I PTA-T1G1-2 gruppe 88% av de primære tumorer havn en mutasjon i minst ett av de fem undersøkte onkogener. Screening for
PIK3CA Hotell og tre
RAS
gener økte prosent muterte tumorer med 10% sammenlignet med
FGFR3
alene. I karakteren 3 og muskel-invasiv tumor grupper, er den totale prosentandel av mutasjoner i de oncogenes mye lavere med henholdsvis 33% og 36%. I klasse 3 svulster, andelen av
RAS
mutasjoner er relativt stor, mens
PIK3CA
mutasjoner er mer fremtredende i muskel-invasiv svulster. Tillegg av
PIK3CA Hotell og
RAS
analyser resulterer i påvisning av 13% ekstra mutant primære svulster i klasse 3-gruppen og 15% i muskel-invasiv gruppe.
Samtidig forekomst av mutasjoner
av de 257 primærtumorer, 26% hadde overekspresjon av p53, som er et tegn på missense mutasjoner. Når vi kombinerer onkogene mutasjoner med de i
TP53
tumor suppressor gen (tabell 2), viser det seg at bare 27 svulster (11%) var vill-type for alle undersøkte gener. Det var 9 primære svulster med en co-forekomst av 3 endringer. Det var en positiv sammenheng av mutant
FGFR3
med
PIK3CA
mutasjoner (p
=
0,016), med 77% av
PIK3CA
mutasjoner co- forekommer med
FGFR3 plakater (figur 5).
FGFR3
mutasjoner var sterkt gjensidig utelukkende med
RAS
mutasjoner (p
=
0,001). Kun 3,5% av de primære tumorer inneholdt en mutasjon i begge genene. Interessant, gjensidig eksklusivitet av
FGFR3 Hotell og
RAS
mutasjoner forble signifikant i undergruppen av PTA /T1 G1 /2 primære svulster, mens
PIK3CA Hotell og
FGFR3
mutasjoner er betydelig co-truer i klasse 3 svulster. Begge
FGFR3 Hotell og
PIK3CA
mutasjoner var gjensidig utelukkende med p53 overekspresjon (p
0,001 og p
=
henholdsvis 0,029,).
RAS
mutasjoner var ikke gjensidig utelukkende med
PIK3CA Kjøpe og p53 mutasjoner i total kohorten, og heller ikke i ulike tumor stadium og grad av undergrupper.
Korrelasjoner av mutasjoner med stadium, grad
Vi har senere undersøkt forholdet mellom scene og karakter, og de forskjellige mutasjoner (figur 6). I primære svulster var det en signifikant korrelasjon av
FGFR3
med lav scene og klasse og en korrelasjon på p53 overekspresjon med høy scene og klasse, som vist tidligere [39]. Imidlertid ble det observert noen signifikant sammenheng mellom
RAS
mutasjonsstatus og scene eller karakter. Fordelingen ifølge trinn var 10% PTA (16 av 166), 18% PT1 (10 av 57), og 6% muskel-invasive tumorer (2 av 34). Angå
PIK3CA
, utbredelsen av mutasjoner var høyere i lavgradige svulster: 30% klasse 1 (25 av 84), 23% grad 2 (27 av 117), og 16% grad 3 (9 av 56 ), men dette krets var ikke statistisk signifikant (p = 0,061). Ingen sammenheng med scenen ble observert.
Korrelasjonen av disse endringene i barne blæren svulster av 257 pasienter med stadium (A) eller klasse (B) er angitt med p-verdier (χ
2).
prognostisk verdi
Femtini prosent (154/257) av pasientene i vår studie utviklet en eller flere tilbakefall, 10% hadde progresjon i scenen og /eller til grad 3, 19% døde av sykdom. Ingen av de undersøkte endringer i
FGFR3
,
RAS
,
PIK3CA Hotell og p53 i primærtumor var en prediktor for utvikling av et tilbakefall (residiv overlevelse p 0,05). Mutasjon hyppigheten av
PIK3CA
hos pasienter med tilbakefall var lik sammenlignet med pasienter uten tilbakefall 24% (37/154) versus 23% (24/103). For
RAS
mutasjoner, disse frekvensene var 12% og 10%. Det var heller ingen sammenheng mellom mutasjonsstatus av
RAS Hotell og
PIK3CA Hotell og tilbakefall. Som vi viste tidligere, pasienter med en
FGFR3
mutant primære svulsten har en lavere risiko for progresjon og en bedre sykdomsspesifikk overlevelse, mens pasienter med p53 overekspresjon har høy risiko for progresjon og lav sykdomsspesifikk overlevelse [32 ], [39]. Men
PIK3CA
eller
RAS
mutasjoner ble ikke signifikant assosiert med progresjon (p
=
0,129, p
=
0,694) eller sykdomsspesifikk overlevelse (p
=
0,205, p
=
0,447) i hele kullet, eller i forskjellige tumor stadium og grad av undergrupper. Kombinere
RAS Hotell og
PIK3CA
mutasjonsstatus gitt lignende resultater. Videre legger
RAS
eller
PIK3CA
mutasjonsstatus til
FGFR3
eller p53 ikke resultere i en bedre prediksjon av tilbakefall-fri, progresjonsfri eller sykdomsspesifikk overlevelse sammenlignet med
FGFR3
eller p53 alene. Det var heller ingen signifikant korrelasjon av individuell
RAS
isoformer og
PIK3CA
mutasjoner i spiralformede eller kinase domener med scene, klasse eller recurrence-, progression-, og sykdomsspesifikk overlevelse. Videre ble ingen signifikant korrelasjon finnes mellom
RAS
eller
PIK3CA
mutasjoner og endret Ki-67 (p = 0,413, p = 0,227) eller p27
Kip1 (p = 0,126 og p = 0,580) uttrykk, markører indikative for en dårligere prognose i blærekreft [60], [61].
Frekvenser av mutasjoner i tilbakefall
fra 54 pasienter som ble behandlet ved Erasmus MC og hadde utviklet en eller flere tilbakefall, vev var tilgjengelig fra 184 tilbakefall (inkludert multifokale tilbakefall). Her ønsket vi å undersøke om mutasjonsstatus vedvarer i flere tilbakefall av de samme pasientene med det formål å undersøke om det er verdifullt å starte en fremtid longitudinell studie om overvåking med mutasjonsanalyser ved å analysere urinprøver. Vi bare undersøkt mutasjonsstatus av genene som vi har utviklet øyeblikksbildet basert mutasjonsanalyse (dvs.
FGFR3
,
PIK3CA Hotell og
RAS
). P53 overekspresjon ble ikke bestemt i gjentakelser. Hyppigheten av p53 overekspresjon var også lav (6/54) i de primære svulster i denne pasientgruppen bestående hovedsakelig av NMI-BC svulster. En detaljert oversikt over scenen, klasse og mutasjonsstatus av disse svulstene er presentert i Figur 7. Hos pasienter med villtype primærtumor, tilbakefall var hovedsakelig villtype (49/54 tilbakefall), mens 5 næret en
FGFR3
mutasjon. En tilbakevendende svulst inneholdt to forskjellige
PIK3CA
mutasjoner (E542K og E545K). Interessant, i tilbakefall
PIK3CA
mutasjoner i tillegg til
FGFR3
mutasjon var assosiert med høyere kvalitet i forhold til tilbakefall huse en
FGFR3
mutasjon alene (p = 0,012). Hvis vi stratifisere for pasienter med en mutant primærtumor, 81% av tilbakefall var også mutant og de enkelte frekvenser var 75% (98/130) for
FGFR3
, 23% (30/130) for
PIK3CA
, og 10% (13/130) for
RAS
. Interessant, var det en 100% konsistens i den type mutasjon for
RAS Hotell og
PIK3CA
mellom ulike svulster i samme pasient. Vi tidligere observert at noen tilbakefall var vill-type når den primære svulsten var mutant for
FGFR3 product: [17]. I denne studien var det 20 av 130 tilbakefall (15%) i pasientgruppen med en mutant primær svulst som hadde kommet til klasse 3, CIS eller muskel-invasiv blærekreft (figur 7). Av disse 90% (18/20) var mutant og derfor kunne påvises med den mutasjonsanalyse. De villtype tilbakefall i denne pasientgruppen ikke fremgang oftere enn mutant tilbakefall; 8% (2/25) av de villtype tilbakefall hadde kommet til CIS og til grad 3 (figur 7), sammenlignet med 17% mutant tilbakefall. En av disse villtype gjentagelse co-forekom sammen med to mutant-tumorer. Vi har fastslått ytterligere tidspunktet ved hvilket villtype gjentagelse oppstod under oppfølging. De fleste av de villtype tilbakefall (18 av 25) co-forekom sammen med en mutant tilbakefall eller ble senere etterfulgt av en mutant tilbakefall, mens syv skjedde som villtype alene på slutten av oppfølgingsperioden da ingen ytterligere data var tilgjengelig
A:. mutant primære svulster og deres tilbakefall; B: villtype primære svulster og deres tilbakefall. Den første kolonnen viser den primære svulsten. De påfølgende boksene indikerer timelig sekvensielle tilbakefall fjernet i forskjellige transuretral resections (angitt med et tall på toppen). Multifokale svulster fjernes på samme transurethral reseksjon er plassert under hverandre. Stage og grad av svulstene, mutasjonsstatus (angitt med en farge) og pasient-ID av de 54 pasientene er indikert.
Et av formålene med denne studien var å undersøke om de mutasjonsanalyser er en potensial verktøy for påvisning av tilbakefall for å redusere antall cystoscopical undersøkelser og om det er nyttig for å initiere en stor langsgående studium med disse mutasjonsanalyser for påvisning av tilbakevendende blæretumorer ved hjelp av DNA ekstrahert fra urin celler. Pasienter som er kvalifisert for en slik oppfølging er de som presenterer med en mutant pTaG1-2 eller pT1G2 primærtumor. For denne gruppen av pasienter hyppigheten av mutasjoner i
FGFR3
,
PIK3CA Hotell og
RAS
gener når regnet per gjentakelse hendelse (i tilfelle av flere svulster fjernes ved transuretral reseksjon, mutasjons data var kombinert) er illustrert i figur 8. figuren viser at det i denne gruppen av pasienter en mutasjon er til stede i 88% av tilbakefall hendelser.
