Abstract
Rapid fremskritt i massespektrometri har tillatt for beregninger av absolutte konsentrasjoner over hele proteom, tillater avhør av mange viktige biologiske spørsmål. Her fokuserer vi på en kvantitativ aspekt av menneskelig kreft celle metabolisme som er begrenset av en mangelen på tilgjengelige data om overflod av metabolske enzymer. Vi integrere data fra de senere målinger av absolutt proteinkonsentrasjon for å analysere statistikken for protein overflod på tvers av human metabolske nettverket. På et globalt nivå, finner vi at enzymene i glykolysen utgjør omtrent halvparten av den totale mengden av metabolske proteiner og kan utgjøre inntil 10% av hele proteomet. Vi bruker da denne analysen for å undersøke flere utestående problemene i kreft metabolisme, inkludert spredning av glycolytic flux for biosyntese, det relative bidraget av nitrogen assimilere trasé, og opprinnelsen til mobilnettet redoks potensial. Vi finner mange konsistenser med dagens modeller, identifisere flere uoverensstemmelser, og finne alminnelig som strekker seg utover nåværende forståelse. Sammen våre resultater viser at en relativt enkel analyse av overflod av metabolske enzymer var i stand til å avdekke mange innsikt i organiseringen av den menneskelige kreftcelle metabolske nettverk
Citation. Madhukar NS, Warmoes MO, Locasale JW (2015 ) Organisering av enzymkonsentrasjon over Metabolsk Network i kreftceller. PLoS ONE 10 (1): e0117131. doi: 10,1371 /journal.pone.0117131
Academic Redaktør: Vasu D. Appanna, Laurentian University, CANADA
mottatt: 16 september 2014; Godkjent: 19 desember 2014; Publisert: 26 januar 2015
Copyright: © 2015 Madhukar et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: CPC, Kinetic og Gibss frie energier leveres som supplerende materiale i S1 og S2 tabeller. LTQ protein kvantifisering av data som CPC-dataene som brukes i dette manuskriptet er avledet er tilgjengelig på: https://wzw.tum.de/proteomics/nci60
Finansiering:. JWL erkjenner støtte fra National Institutes of Health ( https://www.nih.gov/) awards CA168997 og AI110613 og International Life Sciences Institute. NSM ble støttet av Tri-institusjonelle Training Program i Computational Biology og Medicine (https://www.triiprograms.org/cbm/) Program nummer: 1T32GM083937. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Metabolisme utgjør en fundamental del av cellefysiologi. Det gir mulighet for behandling av næringsstoffer gjennom kjemisk reaksjon nettverk, noe som resulterer i produksjon av energi og biosyntetiske komponentene og regulering av signaloverføringsprosessene ved å påvirke nivåene av metabolitter som kontrollerer aktiviteten av proteiner. Dens funksjon er viktig for menneskers helse og dens avvikende status er et kjennetegn på mange sykdommer [1,2]. En kvantitativ, prediktiv forståelse av metabolisme har utallige muligheter [3-5], men har vært begrenset av mangel på tilgjengelige data på nivået av metabolitter, enzym uttrykk, og forandring.
En viktig begrensning i denne systemer nivå forståelse stammer fra mangelen på kvantitative målinger av protein overflod [6]. Den absolutte proteinkonsentrasjonen er vesentlig for forståelse enzymkinetikk og derfor fluks gjennom en metabolsk reaksjonsvei [7]. For en hvilken som helst kjemisk reaksjon som involverer et enzym, er frekvensen av den reaksjonen proporsjonal med enzymet overflod, og dermed den absolutte konsentrasjon av et enzym steder avgrenser på metabolsk fluks og tjener som et rimelig estimat av dens aktivitet og, når sammenlignet med andre enzymer i konkurranse for et substrat, kan benyttes som et estimat av den relative bruken av det substrat. Andre faktorer som for eksempel Michaelis konstant og omsetningspriser er også viktig, men hver av disse parametrene er uavhengig av enzymkonsentrasjon. Således en analyse av proteinkonsentrasjoner på tvers av og innenfor trasé og, i forhold til enzymer som utnytter det samme substratet, kan gi anslag for relativ flukser som utgår fra de sammenlignede enzymer.
Tidligere studier har foretatt omfattende analyser av den transkripsjonelle overflod av metabolske gener [3]. Disse studiene har fokusert på endringene som følger onkogene transformasjon og har avdekket innsikt i pathways, gener, og reaksjoner som er endret [1,3,8-11]. Ikke desto mindre har det også blitt vist at det er i mange tilfeller, bare en beskjeden korrelasjon mellom transkripsjon og protein overflod på grunn av mange faktorer, for eksempel translasjonell regulering og proteinstabilitet-som påvirker forholdet mellom mRNA og protein [12-14]. Videre har disse studiene fokusert på tumor normal sammenligninger i stedet for konsentrasjons utdelinger over nettverket, som har en annen, men likevel relevant, biologi assosiert med sin analyse.
Advances in massespektrometri basert proteomikk har tillatt for i dybden identifisering og kvantifisering av pattedyr proteom fra biologiske prøver [15-17]. Disse teknologiene har også tillatt for estimater av protein overflod fra biologiske prøver ved hjelp av regresjon modellering. Med disse data for hånden, er det da mulig å vurdere fordelingen av proteinkonsentrasjoner på tvers av metabolske nettverket, og å gjøre kvantitative vurderinger av enzymet overflod på tvers av banene, ved forgreningspunkter der metabolske flukser divergere, og for enzymer som utnytter vanlige underlag. Vi gjennomførte derfor denne analysen og avdekket flere overraskende resultater knyttet til organiseringen av proteinkonsentrasjoner over den menneskelige metabolske nettverk.
Metoder
Curation av en Metabolsk, Pathway-basert, Proteome
til å begynne analysen vi vurderte NCI-60 cellelinje panel som er et sett av cellelinjer utviklet og vedlikeholdes av National Cancer Institute som har blitt brukt i stor utstrekning for integrerte molekylære analyser og narkotika følsomhet profilering [18]. Den proteomikk kvantifisering for NCI-60 panel gjør bruk av en standardisert celle protein kopiantall (CPC) beregning (se S1 tabell), som er avledet fra etikett Gratis Kvantifisering (LFQ) kvantifisering fra Gholami et al. [19]. NCI-60 proteom- datasett som inneholder LFQ data er fritt tilgjengelig på https://wzw.tum.de/proteomics/nci60. Vi begynte med å filtrere ut proteiner i CPC datasettet som ble påvist i bare en prøve eller vevstype. Disse prøve proteinene inneholdt også en langt lavere gjennomsnittlig CPC enn alle andre prøver (~ 3000 CPC vs 71000 CPC) som indikerer at de ikke kan være relevant for å lage globale anslag på stoffskiftet. Hvert protein i denne listen ble kartlagt til 86 kjente metabolske veier ved hjelp av Kyoto Encyclopedia of gener og genomer (KEGG, Versjon 69.0, 1 januar 2014) kartlegging av gener til veier. Hvilket som helst protein som var inkludert i det minste ett reaksjonsvei var inkludert som en del av den metabolske proteome. De gjennomsnittlige CPC-verdier på tvers av alle cellelinjer for hver metabolske og ikke-metabolske protein, ble anvendt for å beregne den metabolske prosent. Den veien prosenter ble beregnet på en lignende måte, selv om, kan en protein være involvert i flere reaksjonsveier, og således summen av alle prosenter ikke nødvendigvis er lik 100%. For å beregne de ulike sannsynlighetsfordelingsfunksjoner i ulike protein klasser, ble alle de CPC målinger på tvers av cellelinjer matet inn PRISM (versjon 6.03), med en standardisert analyse computing bin sentre.
Glycolysis Pathway Analysis
For hvert protein involvert i glykolyse /glukoneogenesen sti fra KEGG databasen, ble fordelingen klassifisert som CPC-verdier på tvers av alle cellelinjer. Kjernen glykolysen ble definert som progressive trinn der glukose kommer inn glykolysen omdannes til laktat eller kan viderekobles til flere ulike biologiske veier. For å visualisere forskjeller i protein tellinger i hele kjernen glykolyse, ble en bane laget i CytoScape (versjon 3.1.1) med størrelsen av noder som tilsvarer den gjennomsnittlige CPC av de respektive proteiner [20,21].
Branch Point Analyse
for å isolere metabolske veier som inneholder forgreninger skritt, vi utnyttet Recon 2,2 støkiometri matrise til separate veier der en enkelt metabolitt fungerte som en reaktant til flere forskjellige reaksjoner-disse ble definert som våre avdelinger [ ,,,0],22]. Siden noen grener kan innebære mer enn en reaktant metabolitt, ekskluderte vi noen gjentar vårt søk produsert. For hvert sett av grener (hvert sett har det samme reaksjons metabolitten) vi bare inkludert de hvor alle katalyserer enzymer ble inkludert i vår metabolske proteom. Vi beregnet to beregninger fra CPC av disse forgrening enzymer, hver basert på antall anses enzymer. For alle forgreninger trasé rangeres vi de involverte enzymene basert på deres gjennomsnittlige CPC på tvers av alle cellelinjer, med forgrening divergens (BD) score definert som: For grenpunkt hvor det var minst tre forskjellige produktmuligheter, vi gjorde om denne beregningen, denne gangen inkludert de tre beste rangert enzymer i stedet for bare de beste 2.
Vi deretter separert grenene inn i 2 flere kategorier-en måte lener trasé hvor forgrening score produsert en score over. 8, og likt fordelt trasé der den øverste 2 BD poengsum var mindre enn. 2 eller topp 3 BD poengsum var mindre enn 0. Grener ble filtrert for å sørge for at ingen reaksjoner ble gjentatt i hvert sett. For begge settene med grener, enten de øverste 2 eller topp tre involverte enzymer avhengige av hvilken type Poengsummen ble brukt til å skille dem, ble separert og kartlagt til sine respektive KEGG veier. For hvert sett, ble antall enzymer som faller inn i hver vei summert og en Fischer eksakte test ble utført for å se om det var noen veier som avvek betydelig over de to grensett. Prosenter av tellinger ble beregnet ved å dividere antall involvert One Sided enzymer med antall likt fordelt Enzymer for hver av de KEGG trasé.
kofaktor Analyse
Vi definerte oxidoreductases som proteiner som enten hadde NADP + /NADPH eller NAD + /NADH som reaktantene eller produktene. Både reaktanter og produkter ble inkludert for derved å tillate proteiner med reversible reaksjoner. EF Numbers av passende reaksjoner ble hentet ved hjelp av Braunschweig enzymet Database (Brenda, Versjon 2014,2, juli 2014) database og deretter tilordnet sin passende Uniprot (Slipp 2013_11) eller Entrez (utgivelsesdato 15. desember
th 2013) identifikatorer [22] . Vi utførte en tilsvarende analyse for aminotransferase, erstatte NAD forbindelser med α-ketoglutarat for å spore bruken av nitrogen gjennom hele cellen. En grafisk rik representasjon av kofaktor bruk ble opprettet ved hjelp CytoScape.
Kinetic Parameter Analyse
For hver metabolske protein vi brukte Brenda Database å trekke ut alle eksperimentelt rapportert K
M verdier. The Simple Object Access Protocol (SOAP) grensesnitt ble brukt for å få kinetiske egenskaper for alle metabolske proteiner. Vi ekskluderte alle verdier som ikke er referert som en vill-type eksperiment (som K
M verdiene oppnådd etter en protein mutasjon) og videreutviklet listen ved å utelukke eventuelle uteligger målinger. Vi brukte en tidligere publisert liste over tilgjengelige ΔG ° verdier [23] plottet loggen
10 (CPC), log
10 (K
M), ΔG ° verdier for proteiner som vi hentet alle tre av disse variablene (se S2 tabell). For tilkobling analyse, CPC, ΔG ° og K
M-verdiene ble skalert mellom 0 og 1, deretter visualisert i CytoScape og manuelt fordelt i fire grupper.
Resultater
Globalt Analyse av metabolsk Proteome
for å undersøke uttrykk og kvantifisering av metabolske proteiner vi først samlet undergruppe av proteiner involvert i stoffskiftet. Vi vurderte en siste datasett som benyttes dype proteomikk målinger over NCI-60 cellelinje panel og en regresjon modell for å beregne protein overflod fra massespektrometri data (S1 Table) [19]. Vi definerte metabolske proteiner som hvilket som helst protein som er tilordnet en kjent metabolsk reaksjonsvei i KEGG databasen [3,24]. Kvantifisere den relative størrelsen på denne undergruppen, fant vi at i gjennomsnitt over 59 cellelinjer målt, utgjorde den metabolske komponenten for ca 18,5% av den totale proteomet (Fig. 1a). Ved å undersøke fordelingen også observerte vi en omtrent log-normalfordeling, og funnet at fordelingen av metabolske proteiner etterfulgt omtrent det samme mønster som det av den samlede proteinfordeling (fig. 1b).
(a) Pie diagram diagraming den totale andelen av metabolske proteiner på tvers av alle cellelinjer. Metabolske proteiner er differensiert etter en annen farge innfelt. (B) Sannsynlighetsfordeling funksjon av celleprotein kopi (CPC) verdier for alle proteiner og metabolske undergruppe-forskjellige undergrupper er merket med forskjellige farger. Logg
10 verdier ble binned med en bin forskjell på 10
0,3 og den relative frekvens, eller prosentandel av verdiene faller i at bin, ble plottet.
Undersøke proteiner omfattende metabolske enzymer vi sortert proteiner i henhold til de 86 metabolske KEGG metabolske veier de ble tildelt. Fordi en enkelt protein er ofte involvert i flere biokjemiske reaksjoner, hadde vi ikke begrense hvert protein til én vei, men telles hvert protein over hver av banene som enzymet tilhørte. Av de 86 KEGG trasé, fant vi 6 trasé ikke inneholdt noen oppdaget proteiner og ikke lenger anser disse veiene. Basert på denne divisjonen var vi i stand til å kvantifisere den totale protein teller og brøkdel av alle proteiner som var involvert i en bestemt vei over sett av cellelinjer (fig. 2). Ganske dramatisk, ble konsentrasjonene av glykolytiske enzymer funnet å være meget stor, og i total resulterte i nesten halvparten av den totale mengden av protein oppdelt i metabolske enzymer i celler. Dette funnet bekrefter sannsynlig antagelsen om at mesteparten av metabolsk forandring skjer innenfor glykolyse og sentrale karbon metabolisme [1,25-29]. Viktigere enzymer involvert i sitronsyresyklusen (TCA) ble vanligvis en størrelsesorden eller to lavere ekspresjon enn de i glykolysen og disse tallene sted grenser på den flux som kan opprettholdes i hver av disse banene. Andre veier som underlag blir umiddelbart hentet fra glycolytic karbon som pentosefosfateveien veien og de som involverer fettsyrer-også hadde mye lavere protein konsentrasjoner enn de av glykolyse.
For hver distribusjon median, standardavvik, max og min er indikert. Inset inneholder en forstørret titt på veier med høyest andel av metabolsk proteomet.
Analyse av glykolyse
Vi har observert at andelen av proteomet at kreftceller vie til glykolyse dverger mengden protein som er viet til andre metabolske baner (fig. 2). Dette er spesielt bemerkelsesverdig med tanke på at de eneste 32 proteinene ble tildelt til glykolysen mens trasé som purinmetabolismen, pyrimidin Metabolism, og oksidativ fosforylering ble tildelt i overkant av 60 proteiner. Selv om variasjoner eksisterer på tvers av cellelinjer, tyder dette på at analysen glykolytiske proteiner kan utgjøre opp til 10% av alle proteinene i en kreftcelle. Vi ser også en bimodalitet til fordelingen av alle glykolytiske proteiner som oppstår fra en overflod av høyt uttrykte proteiner og noen isoformer stiller mindre uttrykket nivåer (Fig. 3b). Denne observasjonen så motivert oss til å undersøke organiseringen av protein uttrykk i glykolyse. Vi undersøkte enzymer langs veien i den rekkefølgen de enzymatiske reaksjoner oppstå. Interessant, fremkommer en ikke-monoton mønster i progresjonen av enzymnivåer som glukose metaboliseres gjennom glykolysen å gi laktat, med en topp ved fosforylering av glyceraldehyd-3-fosfat til 1,3-biphosphoglycerate-katalysert av glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) -og ytterligere senere topp som opptrer ved omdannelsen av 2-phosphoglycerate til fosfoenolpyruvat-katalysert av enolase (fig. 3c). Denne tilsynelatende ikke-tilfeldig mønster har sannsynligvis biologiske konsekvenser i hvordan metabolsk kontroll fordelt over hele veien og eventuelt hvordan avdelings punkter i veien koordineres. Vi har derfor forsøkt å undersøke dette hypotetiske forholdet ytterligere.
(a) Fordeling av celle protein kopi (CPC) verdier for alle glykolytiske /gluconeogenic proteiner på tvers av alle cellelinjer. For hvert protein median, standardavvik, maks, og min er indikert. (B) Sannsynlighetsfordeling funksjon av CPC-verdier for alle metabolske proteiner og glycolytic /gluconeogenic undergruppe-forskjellige undergrupper er merket med forskjellige farger. Verdier ble binned med en bin forskjell på 10
0,2 og den relative frekvens, eller prosentandel av verdier som faller inn i den bin, ble plottet. (C) Fordeling av 11 glykolytiske proteiner i en sekvensiell orden pathway. Senter prikk indikerer gjennomsnittlig CPC verdi for hvert protein med barer som angir maks og min målinger på tvers av alle cellelinjer. (D) Pathway diagram av glykolyse aktivitet. Blå firkantene viser forgreninger til andre biologiske pathways, blå sekskanter indikerer middels metabolitter, og lilla sirkler indikerer reagerer enzymer. Størrelse på lilla sirkel er proporsjonal med gjennomsnittlig CPC verdi for at enzymet tvers av alle cellelinjer.
Mange steder langs konvertering av glukose til laktat oppstå der underlaget kan viderekoblet til en annen sti og dermed en annen sluttprodukt. Faktisk er mange har foreslått at forbedret glukosemetabolisme observert i kreftceller er en følge av en metabolsk tilpasning for å øke spredningen av glykolytiske mellomprodukter til biosyntetiske reaksjonsveier [1,3,30,31]. For å undersøke i hvilken grad glycolytic flux kan bli viderekoblet til en annen enn laktat produkt, vi sammenlignet de glykolytiske enzymet intensitetsnivåer med nivåene av forgreningspunkt (BP) enzymer som virker på samme substrat (Fig. 3d). Vi fant at hele glykolyse uttrykket nivåer av BP enzymene var betydelig lavere enn de tilsvarende enzymene til hovedbanen. Interessant var imidlertid at på visse forgreningspunkter, for eksempel en som strømmer ut fra 3-fosfoglycerat, ekspresjonen av enzymet som katalyserer den engasjerte trinn til forgrenings anabole sti var sammenlignbare, og i enkelte tilfeller i samsvar med ekspresjonen av det tilsvarende enzym i glykolysen . Spesielt dette skjer på phosphoglyceromutase (PGAM) steg i glykolysen der 3PG kan fortsette å bli metabolisert sammen glykolyse eller det kan bli viderekoblet til de novo serin syntese ved oksidasjon via phosphoglycerate dehydrogenase (PHGDH). Selv i gjennomsnitt av konsentrasjonen av PHGDH var lavere, i mange cancercellelinjer, er konsentrasjonen av PHGDH var sammenlignbar eller til og med høyere enn for PGAM i noen tilfeller.
Global Branch punkt Analysis
Gitt de interessante funnene vi observert i glykolyse, ved siden søkte vi å systematisk vurdere proteinkonsentrasjonen struktur over den menneskelige metabolske nettverk. For å analysere relative nivåer av BP enzymer utenfor kjerne glykolysen, benyttet vi den Recon 2 databasen til å trekke ut alle punkter i de kjente metabolske veier hvor en BP oppstått. BPS ble filtrert for å inkludere bare de som inneholdt proteiner oppdaget i den kvantitative proteomikk datasett. Denne filtreringen ga 251 BPs med minst to målte enzymer, og 105 med i det minste tre. For hver BP beregnet vi to separate Branch Divergence score (Fig. 4a, se Methods) basert på enten de beste to eller tre mest aner uttrykt proteiner som er involvert i den grenen. Den første stillingen anses som den fraksjon av proteinkonsentrasjonen ved den høyeste tallrike protein som er involvert i den gren i forhold til den nest høyeste protein. Den andre anses som den fraksjon av proteinkonsentrasjonen ved den høyeste tallrike protein som er involvert i den gren i forhold til den andre og tredje høyeste protein. En inspeksjon av disse score (fig. 4c) viste et ikke-gaussisk fordeling med en topp i nærheten av en for første beregningen (Fig. 4b). For at resultatet som anses de to høyeste uttrykte proteiner, ble det funnet at fordelingen nådde en indikerer at den mest vanlig foreteelse i tilfeller BPs langs den humane metabolske nettverket var da proteinnivåer ble konsentrert langs en fremherskende rute i stoffskiftet. Det ble imidlertid også observert at mange unntak eksistere som fordelingen oppviste en lang hale med tilstrekkelig tetthet nær null. En inspeksjon av histogrammet for den andre metriske (fig. 4c) avslørte en lignende struktur med det klare skillet viser at i halen, er proteinkonsentrasjonen fordelt langs flere enzymer og dermed gjennom flere ruter. Vi neste undersøkt hvilke veier har en tendens til å ha proteiner jevnt fordelt mellom avdelings poeng og som hadde tendens til å ha uttrykket forekommer på en enkelt rute. Det ble funnet at for grenpunkter med en dominerende rute, baner som involverer fettsyre biosyntesen, fettsyremetabolisme, og alanin metabolisme ble hyppigst observerte. Denne observasjonen er tydelig i begge statistikken (fig. 4d) og forholdet mellom tellinger (fig. 4e). For veier med protein fordelt jevnt over avdelings poeng, observerte den eneste statistisk signalet var i purinmetabolismen, med ingen andre statistiske signaler for vanlige veier observert-tyder på at disse navene ble spredt tilfeldig over hele metabolske nettverk.
( a) Diagram oppklarende metode for å beregne ulike Branch Divergence score i 2 forskjellige omstendigheter. Orange firkanter angir reaktant og produkt metabolitter med blå ovaler som viser de reagerende enzymer. (B) Histogram av Branch Divergence Poeng basert på 2 øverste verdier. Hver bin er nedre enden inkluderende med en bin størrelse på 0,1. (C) Histogram av Branch Divergence Poeng basert på topp 3 verdier. Hver bin er nedre enden inkluderende med en bin størrelse på 0,1. (D) Plot indikerer p-verdiene for veier som har vesentlig forskjellige punkter i ensidige og likt fordelte trasé (definert som en p-verdi 0,05). (E) Forholdet mellom ensidige teller til likt fordelt teller for betydelige trasé.
kofaktor Analyse
En annen verdifull konklusjon som kan trekkes fra denne typen datasettet ville være hvordan visse kofaktorer eller viktige substrater er fordelt over visse enzymatiske reaksjoner. Vi undersøkte fordeling av enzymer som brukes visse kofaktorer, og regnes som en analyse av viktige cellulære metabolske funksjoner, inkludert vedlikehold av redokspotensial involverer både viktige kofaktorer NADH og NADPH og assimilering av nitrogen.
Vi først forsøkt å analysere den relative bruk av nitrogen, eller som transaminaser var mest utbredt innenfor en celle. Bruke Brenda databasen vi isolert alle naser som ble oppdaget i datasettet, og fant at blant de mest tallrike enzymer var GOT2, GLUD1, og IDH2 (Fig. 5). Sammen dette funnet identifiserer viktige noder i nitrogen assimilering. Vi neste anses utnyttelse av kofaktorer involvert i oksidasjon og reduksjon, NADP
+ /NADPH, og NAD
+ /NADH. Vi først ansett NAD
+ /NADH og funnet, i samsvar med vår observasjon at glykolytiske enzymer utgjør de mest tallrike enzymer i celler, at GAPDH og LDH består mesteparten av proteinkonsentrasjonen som brukes for NADH-mediert redoks-koplet reaksjoner i cellene. Av lavere overflod var de enzymer involvert i TCA syklus og biosyntetiske og vedlikeholds reaksjoner i sekundær metabolisme. For NADPH, i samsvar med nyere funn som har identifisert oksidasjon av folater som en viktig kilde til celle NADPH, er enzymet MTHFD en av de mest tallrike enzymer som syntetiserer NADPH [32]. En stor forbruker av NADPH var fettsyre syntase (FASN), som er i tråd med behovet for
de novo
lipid syntese brukes i plasmamembranen Formasjonen i hurtig spredning celler. Begge storforbrukere (LDHA, FASN) og produsenter (GAPDH, MTHFD og MDH2) av NAD (P) H er gjenstand for store forskningsinnsatsen som narkotika mål mot kreft [11,33-36].
Nettverk diagram av glykolyse illustrerer overflod aminotransferase og enzymer som utnytter NAD (P) /NAD (P) H som en kofaktor. Størrelsen av nodene tilsvarer gjennomsnittlig overflod av proteiner.
Korrelasjoner med kinetiske parametre
Til slutt ser vi at at reaksjonshastigheten eller fluksen gjennom et punkt i stoffskiftet innebærer ikke bare den enzymkonsentrasjon, men kinetiske parametere og termodynamikken i de kjemiske forbindelsene som er involvert i reaksjonen i tillegg. Disse parametrene inkluderer Michaelis konstant (K
M) og standard Gibbs Gratis energi (ΔG °) av reaksjonene (S2 tabell). Vi undersøkte derfor forholdet mellom disse tre grunnleggende parametrene. Overraskende ingen sammenheng mellom gjennomsnittlig proteinnivå og ΔG ° (Fig. 6a), K
M verdier og ΔG ° (Fig. 6b), og gjennomsnittlig proteinnivå og K
M-verdier (Fig 6c.) Ble observert. For å få ytterligere innsikt i forholdet mellom disse tre variablene, vi også visualisert disse tre variablene sammen for hvert enzym. Ved hjelp av denne tilnærmingen vi skilles 4 grupper (Fig. 6d). Hovedtyngden av enzymene visualisert på denne måten hadde moderat ΔG °, K
M verdier og protein kopiantall (gruppe 1) og var dermed ansvarlig for den generelle mangelen på korrelasjon mellom disse tre variablene. Dette funnet er i motsetning til en tidligere hatt antagelse at større proteinkonsentrasjoner er nødvendige for reaksjoner nær likevekt [37]. Videre tilveiebringer denne analysen også sterke bevis for at hver av disse grunnleggende variabler for en cellulær metabolsk reaksjon er frikoblet slik at for uavhengig justering av disse tre parametre for utviklingen av humane metabolsk nettverket. Også denne mangelen på korrelasjon tyder på at samlet, er illustrerende for reaksjonshastighet siden K
M og ΔG ° for hver reaksjon som involverer et gitt protein konsentrasjon synes ukorrelerte protein uttrykk. Det var imidlertid noen unntak fra denne hovedregelen. Først proteinene i gruppe 2 (Fig. 6d) samsvarer i stor grad til de tidligere nevnte glycolytic proteiner med noen åpenbar stor K
M, eller svært lav ΔG ° verdier. Dette samsvarer med den oppfatningen at disse proteinene må være sterkt uttrykt for å sikre en høy glycolytic flux som kan føre til oppbygging av glykolytiske mellom og påfølgende økt flux inn i de ulike biosyntetiske grener. De to andre gruppene (gruppe 3 og 4) inneholdt enzymer med enten svært store K
M verdier eller svært lav ΔG °. Den ekstreme K
M verdier indikerer at disse enzymene trenge en betydelig oppbygging av substrater for å resultere i en merkbar fluks fremover mens reaksjoner med svært lave ΔG ° er meget irreversible reaksjoner. Faktisk tre enzymer med stor K
M-verdier (GNPDA, GPT2 og GART) direkte renne glykolytiske mellom inn biosyntetiske veier mens tre enzymer med svært lav ΔG ° (ATIC, PPAT og qprt) utnytte fosforibosyl difosfat (PRRP) avledet fra pentose-fosfat vei for NAD (P) H og nukleotid-syntese. Også flere enzymer i gruppe 3 (GLS, Nags, OAT, GOT1 og ASL) er involvert i arginin, aspartat, glutamin metabolisme, som metabolittene har noen av de høyeste intracellulære konsentrasjoner og /eller flukser.
( a) Scatter tomt på loggen av gjennomsnittlig K
M og ΔG ° verdi med hver prikk representerer en annen metabolsk protein. (B) Scatter tomt på loggen av gjennomsnittlig celleprotein kopi (CPC) og ΔG ° verdier med hver prikk representerer en annen metabolsk protein. (C) Scatter tomt på loggen for både gjennomsnittlig K
M og gjennomsnittlig CPC verdi med hver prikk representerer en annen metabolsk protein. (D) Tilkobling analyse av CPC, ΔG ° og K
M verdier for de ulike enzymer.
Diskusjoner
Det er viktig å merke seg at disse analysene ble utført på data samlet inn fra et panel av kreftcellelinjer i stedet for menneskelig vev og dermed resultatene av denne analysen er innledet med en rekke advarsler. Mens analyser på cellelinjer kan ofte belyse generelle mobil forståelse, er det stor metabolske mangfold på tvers av forskjellige vevstyper som kan påvirke resultatene av global proteomikk analyse. For eksempel, er kardiomyocytter tenkt å trekke ut et flertall av sin energi fra fettsyreoksidasjon og omtrent 50% av deres volum er okkupert av mitokondriene [39]. I tillegg har det vist seg at papir betingelser som anvendes i vevskultur ha betydelig hvis ikke dominerende virkning på cellemetabolismen og påvirke enzymaktivitet [38-40]. Således betingelser som er spesifikke for cellelinje og mikromiljøet endre fordelingen av proteinene. Likevel, en analyse av protein overflod over nettverket gir innsikt i konkrete eksempler på hvordan pattedyrkreftceller distribuere sine enzymkonsentrasjoner
Totalt vurderte vi en analyse av proteinkonsentrasjonen av metabolske enzymer over den menneskelige kreftcelle metabolske nettverk i et variert antall celler. Denne analysen viser at en forholdsvis enkel beregning og bedømmelse kunne gi flere innsikt i organiseringen av kreft metabolsk nettverket. I motsetning til tidligere holdt forestillinger, trenger metabolske enzymer ikke ut til å bli noe mer høyt uttrykt enn noe annet protein i cellene. Det viktigste unntaket er glykolyse, som sto for opptil 10% av hele mobilnettet proteomet. Den bemerkelsesverdige fordeling av proteinkonsentrasjonen for en enkelt metabolske spor understreker dens sentrale stilling i utnyttelsen av de store makronæringsstoff, glukose, som anvendes som en energikilde. Det gir også innsikt i de store flukser som er observert i glykolyse og hvordan disse fluksene kan være så rask. Funnene kaller også inn spørsmål mange kontrollmekanismer som er foreslått å regulere glykolyse. For eksempel, er det sannsynlig, at i mange tilfeller kan post-translasjonelle modifikasjoner så som acetylering eller fosforylering ikke ha store regulatoriske roller fordi deres støkiometri er begrenset av det lille antallet av kinaser og acetyltransferases som kommer til uttrykk for å utføre slike reaksjoner.
