Abstract
Nek11 kinase er en potensiell formidler av DNA skade respons hvis uttrykket er oppregulert i tidlig fase kolorektal kreft (CRC). Her, ved hjelp av RNAi-mediert uttømming, undersøkte vi rolle Nek11 i HCT116 WT og p53-null CRC-celler utsatt for ioniserende stråling (IR) eller det kjemoterapeutiske legemiddel, irinotecan. Vi viser at uttømming av Nek11 hindrer G2 /M rest indusert av disse midler genotoksiske og fremmer p53-avhengig apoptose både i nærvær og fravær av DNA-skade. Interessant, Nek11 uttømming førte også til langsiktig tap av celleviabilitet som var uavhengig av p53 og forverret etter IR eksponering. CRC-celler uttrykker fire spleisevarianter av Nek11 (L /S /C /D). Disse er hovedsakelig cytoplasmatisk, men gjennomgår nucleocytoplasmic skyt mediert gjennom tilstøtende atom import og eksport av signaler i det C-terminale ikke-katalytisk domene. I HCT116-celler, Nek11S spesielt har de en viktig rolle i den DNA-skade respons. Disse dataene gir sterke bevis for at Nek11 bidrar til responsen av CRC celler til gentoksiske stoffer og er avgjørende for å overleve, enten med eller uten eksponering for DNA-skade
Citation. Sabir SR, Sahota NK, Jones GDD, Fry AM (2015) Tap av Nek11 Hindrer G2 /M arrest og Fremmer celledød i HCT116 kolorektal kreft celler eksponert for Therapeutic DNA-ødeleggende midler. PLoS ONE 10 (10): e0140975. doi: 10,1371 /journal.pone.0140975
Redaktør: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, FRANCE
mottatt: 15 august 2014; Godkjent: 03.10.2015; Publisert: 26 oktober 2015
Copyright: © 2015 Sabir et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet med tilskudd til AMF fra The Wellcome Trust (082828, https://www.wellcome.ac.uk), Cancer Research UK (. C1420 /A9363, https://www.cancerresearchuk.org), Association for International Cancer Research (AICR 13-0042, https://www.aicr.org.uk), og en PhD student fra University of Leicester (http : //www.le.ac.uk). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje vanligste diagnosen kreft i den vestlige verden. Nåværende standard behandling for CRC pasienter etter kirurgi innebærer kjemoterapi kombinasjoner som vanligvis omfatter DNA-skadelige stoffer. For eksempel, mange pasienter får FOLFIRI som førstelinjebehandling, en kombinasjon av folinsyre, 5-fluorouracil (5-FU) og irinotecan [1]. 5-FU er et pyrimidin analogt som blokkerer DNA-syntese ved å inhibere DNA-polymerase, mens folinsyre potenserer virkningen av 5-FU ved å inhibere tymidylatsyntase. Irinotecan er en hemmer av topoisomerase som forårsaker enkelttråds DNA pauser, som vanligvis deretter konverteres til dobbel tråd pauser (DSB sin). Disse aktivere DNA skade sjekkpunkter og årsaken arrestasjonen av cellesyklusen på G1 /S eller G2 /M.
DNA skade respons (DDR) er et komplekst nettverk av cellulære prosesser som fører til flere utfall, inkludert DNA-reparasjon , cellesyklus arrest, alderdom og apoptose [2, 3]. Den spesifikke utfallet bestemmes av mange faktorer, inkludert nivået og type skade, og integriteten til forskjellige DDR veier. Suksessen til DNA-skadelige stoffer i behandling av kreft er avhengig av økt følsomhet for hurtig sykling kreftceller som har svekket DDR veier. Disse forskjellene til normale celler gi det terapeutiske vinduet som kreves for effekt. Imidlertid er dagens utvalg av disse midlene basert hovedsakelig på tumortypen assosiert med betydelig toksisitet og en bedre forståelse av hvilke faktorer som dikterer svar på disse stoffene vil føre til mer raffinerte og personlige behandlinger.
DDR veier er initiert gjennom aktivering av minibank eller ATR svar på DSB sin, stoppet opp replikering gafler eller endringer i kromatinstruktur assosiert med DNA-addukter [2, 3]. For å starte cellesyklus arrest, disse kinaser phosphorylate nedstrøms mål inkludert Chk1, Chk2 og p53. Fosforylering av p53 fører til sin stabilisering og økt uttrykk for sin transkripsjonen målet, p21. Chk1 og Chk2 fosforylere og inaktivere Cdc25 fosfatase gjennom å fremme sin degradering eller cytoplasma håndtering. Sammen, økt ekspresjon av p21 og tap av Cdc25 funksjon å blokkere aktiveringen av CDK nødvendig for G1 /S og G2 /M-overganger. Men dette representerer et lite øyeblikksbilde av det som nå forstått å være svært komplekse baner som involverer mange andre enzymatiske, regulatoriske og strukturelle komponenter.
Ett sett med proteiner som begynner å dukke opp som viktige regulatorer av DDR er den NIMA-relatert, eller NEK, protein-kinase-familien [4]. Denne familien består av elleve medlemmer, hvorav minst fire, Nek1, Nek8, Nek10 og Nek11 har mistenkt roller i DDR [5-10]. Nek11 ble den første av disse for å være implisert når dens kinase-aktivitet ble funnet å være forhøyet i celler eksponert for DNA-ødeleggende midler og replikasjons hemmere [9]. Dessuten er denne aktiviteten tapt ved tilsetning av ATM /ATR-hemmer, koffein, noe som tyder på at Nek11 fungerer nedstrøms minibank eller ATR. Nyere mekanistiske undersøkelser viste at Nek11 aktiveres ved fosforylering på Ser-273 av Chk1 ved eksponering av celler for ioniserende stråling (IR) [7]. Aktivert Nek11 er i stand til å fosforylere Cdc25A på steder innenfor en phosphodegron som fremmer rekruttering av β-TrCP. Dette i sin tur fører til ubiquitin-formidlet nedbrytning av Cdc25A og cellesyklus-stans [11-13]. Men andre har hevdet at fosforyleringen-avhengig nedbrytning av Cdc25 er mediert av alternative kinaser, slik som kasein kinase 1 [14, 15]. Likevel Nek11 har også blitt rapportert å være et potensielt relevant kreft biomarkør som forhøyet Nek11 uttrykk ble oppdaget i et sett av kolorektale adenomer [16]. Vi har derfor satt ut for å teste om Nek11 er nødvendig for responsen til CRC celler til klinisk relevante DNA-skadelige stoffer, samt søke ytterligere bevis for en rolle for Nek11 i DDR.
Resultater
Nek11 er nødvendig for IR-indusert G2 /M arrest av HCT116 cellene
for å undersøke hvor Nek11 kan bidra til DDR av CRC celler, en protokoll ble etablert som tillot cellecyklusprogresjonen skal overvåkes av flowcytometri følgende Nek11 uttømming og IR eksponering (fig 1A). Nek11 ble tømt ved hjelp av én av to forskjellige siRNAs med effekten av disse oligonukleotider bekreftet etter 72 timer transfeksjon ved RT-PCR og Western blot (S1 A og S1B fig). Ved hjelp av et doseringsområde på IR, ble det fastslått at HCT116 CRC-cellelinjen viste en betydelig økning i G2 /M-fraksjon 16 timer etter eksponering med 10 Gy IR (S1C Fig). Derfor, i disse forsøk ble cellene først transfektert med kontroll (GL2 luciferase) eller Nek11 sirnas og deretter, etter 56 timer, de var enten ubehandlet eller utsettes for 10 Gy IR. Etter ytterligere 16 timer, ble de samlet inn for analyse av propidiumjodid (PI) -basert flowcytometri (fig 1B og 1C, S1D, S1E, S2A og S2B figurene).
A. Skjematisk fremstilling av tidsforløpet for cellen behandlinger. 24 timer etter utsåing ble cellene transfektert med siRNA oligonukleotider. 56 timer senere ble cellene enten ubehandlet eller bestrålt (± IR). De ble deretter samlet opp og fiksert for PI-baserte flowcytometri etter ytterligere 16 timer. B C. Ved å følge protokollen som er beskrevet i A, HCT116 WT og p53-null-celler ble transfektert med sirnas som angitt, og ubehandlet (B) eller behandlet med 10 Gy IR (C), før analyse ved strømningscytometri. Fordeling av celler i henhold til flowcytometri profil er indikert (2n, G1, 2n-4n, S; 4n, G2 /M). D-G. Histogrammer representerer prosentandelen av sykling HCT116 WT (D, E) og p53-null (F, G) celler i G2 /M. H-K. Histogrammene viser prosentandelen av alle HCT116 WT (H, I) og p53-null (J, K) -celler med sub-2n DNA. Histogrammer i DK er hentet fra data som er vist i B og C.
p
verdiene er beregnet i forhold til siGL2.
Ved hjelp av denne protokollen, ingen signifikant endring ble observert i brøkdel av sykling celler i G2 /M-fasen av cellesyklusen etter Nek11 tømming uten IR (~ 30%, fig 1D). Men etter IR-eksponering,-celler utarmet av Nek11 oppviste en vesentlig reduksjon i G2 /M-fraksjonen sammenlignet med celler utarmet med kontroll oligonukleotider, med siNek11-2 forårsaker en tilbakevending til basalnivået av G2 /M-celler (figur 1E). Vi merker oss at siNek11-2 ga en mer robust knockdown enn siNek11-1 ved RT-PCR og Western blot. For å undersøke rollen til p53 i denne reaksjon, er de samme eksperimentelle metode anvendt på isogene HCT116 p53-null (p53
– /-) celler. Nedbryting av Nek11 alene igjen hadde ingen signifikant effekt på cellesyklus distribusjon i fravær av IR, mens det var en markert reduksjon i G2 /M arrest i respons til IR behandling etter Nek11 mangel (Fig 1F og 1G). Men i dette tilfellet, ingen siRNA forårsaket en fullstendig retur til basalnivåer av G2 /M-celler tyder på at tapet av G2 /M sjekkpunkt kontroll i fravær av Nek11 er delvis p53-avhengig.
I tillegg slik at cellesyklus fordeling skal bestemmes, den strømningscytometri-analyse viste tilstedeværelse av celledød som indikert ved under 2n topp. Sammenligning av den prosentvise i denne fraksjonen (i forhold til alle cellene i prøven) viste en beskjeden økning i celledød ved Nek11 tømming uten IR, selv om signifikans (p 0,05) ble bare nådd med en oligonukleotid (Fig 1 H). Imidlertid økte celledød i større grad i den Nek11 utarmede prøvene følgende IR eksponering noe som tyder på at kombinert behandling forbedret celledød (Fig 1I). I motsetning til dette, var det bare en liten økning i sub-2n populasjon av HCT116 p53-null-celler Følgende Nek11 uttømming før IR eksponering og, selv om det var flere celler i sub-2n fraksjon følgende IR-eksponering, var det ikke en konsekvent økning upon Nek11 mangel (fig 1J og 1K). Vi konkluderer derfor med at induksjon av celledød at resultatene fra kombinert Nek11 tap og IR eksponering er i stor grad avhengig av p53.
Nek11 er nødvendig for å hindre apoptose og fremme langsiktig celle overlevelse
Som PI-baserte flowcytometri indikert celledød følgende Nek11 utarming, med eller uten IR eksponering, bestemte vi oss for å spesifikt måle apoptose. For dette ble den samme fremgangsmåte fulgt som før med unntagelse av at strømningscytometri ble utført ved anvendelse av annexin V-baserte flekker for å måle tap av plasmamembranen fosfolipid asymmetri som oppstår i løpet av apoptose. Nedbryting av Nek11 uten IR eksponering førte til en ~ 2-3 ganger økning i apoptose i HCT116 WT celler som bekrefter at Nek11 fremmer overlevelse i fravær av DNA-skader (figur 2A). Videre, mens eksponering for 10 Gy IR alene ikke økte prosentandelen av HCT116 WT-celler som gjennomgår apoptose, var det en forbedring i apoptotisk fraksjonen følgende kombinerte Nek11 uttømming og IR eksponering sammenlignet med Nek11 uttømming alene (figur 2B). I de HCT116 p53-null-celler, Nek11 uttømming alene ikke føre til en betydelig økning i apoptose, mens det var bare en liten økning i apoptose i HCT116 p53-null-celler når Nek11 uttømming ble kombinert med IR (figur 2C og 2D). Disse data er i overensstemmelse med dem som ble oppnådd ved bruk av PI-baserte flekker og indikerer at tapet av Nek11 fører til en p53-avhengig induksjon av apoptose som blir forverret av IR-eksponering.
A-D. Ved å følge protokollen som er beskrevet i figur 1A, HCT116 WT (A, B) og p53-null (C, D) celler ble transfektert med sirnas som er angitt, før bestråling og analyse av annexin V-baserte strømningscytometri. Histogrammer representerer prosentandelen av alle celler i apoptose.
p
verdier står i forhold til siGL2. E. HCT116 WT og p53-null-celler ble transfektert med sirnas som angitt, og etter 56 timer behandlet ± 2 Gy IR. Celler ble samlet opp etter 16 timer og belagt for klonogene analyser (50 celler per plate for siGL2, 500 celler per plate for andre behandlinger). Koloniene ble farget med krystallfiolett. F. Kolonier fra E ble talt opp og% overlevelse bestemt som beskrevet i Materialer og metoder. G. HCT116 p53-null-celler ble transfektert med enten siGL2 eller siNek11-2 og etter 56 timer enten ubehandlet eller bestrålt. Cellene ble fiksert 48 timer etter IR og farget med α-tubulin antistoff (grønn). DNA ble farget med Hoechst å observere kjernemorfologi. Skala barer, 10 um. H. Histogram representerer prosentandelen av celler som utviser flere kjerner følgende behandlinger som er angitt som beskrevet i G. 500 celler ble talt opp per prøve og gjennomsnittlig andel av flerkjernede celler ble bestemt over to uavhengige forsøk.
Å undersøke langvarig overlevelse, ble klonogene analyser utført i hvilke celler ble utladet med kontroll eller Nek11 sirnas i 56 timer og deretter utsatt for en lavere dose (2 Gy) av IR før utplating ut 16 timer senere. Etter to uker ble kolonier fiksert og telles (figur 2E og 2F). Først av alt, dette viste at selv i kontrollprøvene oppbrukt, denne dosen av IR var tilstrekkelig til å bevirke betydelig redusert (~ 3-fold) kolonitall ikke bare i HCT116 WT-celler, men også den HCT116 p53-null-celler. Derfor, selv om IR ikke induserer betydelig celledød eller apoptose ved korte tider etter eksponering, vil det forårsake langvarig tap av overlevelse som oppstår i en p53-uavhengig måte. Interessant, uttømming av Nek11 alene hadde også en sterkt skadelig virkning på overlevelsen med en 5-gangers reduksjon i antall koloni i HCT116 WT-celler. Igjen ble en tilsvarende reduksjon i kolonien antall sett med HCT116 p53-null-celler. Kombinasjonen av Nek11 utarming og IR eksponering førte til det største tapet av levedyktighet med ~ 10 ganger reduksjon i kolonien nummer både i HCT116 WT og p53-null celler. Derfor konkluderer vi at langsiktig overlevelse av HCT116 cellene blir dramatisk redusert som følge av IR eksponering, Nek11 uttømming eller en kombinasjon av begge. Videre disse svarene er ikke avhengig av p53, noe som indikerer at p53-uavhengig dødsveier er aktivert.
For å undersøke om den langsiktige tap av celle overlevelse etter disse behandlingene kan skyldes mitotisk katastrofe, håne eller Nek11- utarmet HCT116-celler var enten ubehandlet eller utsettes for IR og deretter fiksert for mikroskopisk analyse etter ytterligere 48 timer. Tilstedeværelsen av store flerkjernede celler som indikerer mislykkede mitotiske divisjoner (dvs. mitotisk katastrofe) ble sett i respons til enten Nek11 uttømming eller IR-eksponering (figur 2G). Imidlertid kvantifisering av flerkjernede celler viste at uttømming av Nek11 alene førte til en forholdsvis liten frekvens mitotisk katastrofe, mens en vesentlig høyere frekvens ble observert i respons på IR-behandling alene (figur 2 H). Lignende resultater ble observert i både WT og p53-null-celler bortsett fra at mitotisk katastrofe som respons på IR var enda mer uttalt i p53-null-celler i samsvar med tidligere rapporter [17, 18]. De høye nivåene av mitotiske katastrofe indusert ved hjelp av IR alene tyder på at dette er en vesentlig årsak til redusert levedyktighet sett i klonogene analyser. Men de lavere nivåene av mitotisk katastrofe indusert av uttømming av Nek11 alene heller argumentere for alternative mekanismer for redusert kolonidannelse, for eksempel skade-indusert alderdom.
Nek11 formidler G2 /M arrest i HCT116-celler behandlet med irinotecan
CRC pasienter ofte får irinotecan, en topoisomerase inhibitor, som en del av sin cellegiftbehandling. PI-baserte flowcytometri bekreftet at HCT116-celler utviser en doseresponsen til denne DNA-ødeleggende middel, med en akkumulering av celler i G2 /M etter 24 timers behandling (fig S3A). En protokoll ble derfor brukt som tillot oss å sammenligne responsen HCT116 WT og p53-null celler til irinotecan den som er sett for IR. I dette tilfellet ble celler utarmet av Nek11 i 52 timer før tilsetning av irinotecan ved 5 uM. Etter ytterligere 20 timer ble celler samlet opp for analyse ved flowcytometri (figur 3A-3C og S2C og S2D Fig). For det første, det avslørt at, som med IR, akkumulering av HCT116 WT celler i G2 /M som reaksjon på irinotecan ble undertrykt følgende Nek11 mangel (figur 3D og 3E og fig S3b). Tilsvarende irinotecan induserte en G2 /M arrest i HCT116 p53-null-celler som ble delvis undertrykt av Nek11 mangel (Fig 3F og 3G og S3C fig). Som for IR-eksponering, observerte vi at Nek11 tømming alene induserte en moderat grad av celledød, men dette ble forbedret i kombinasjon med irinotecan i HCT116 WT celler (fig 3H og 3i). I motsetning til dette ble en lavere og mindre konsistent nivå av celledød observert i HCT116 p53-null-celler følgende Nek11 uttømming enten med eller uten irinotecan (Fig 3J og 3K). Vi konkluderer derfor med at irinotecan induserer også en Nek11-avhengig G2 /M rest som er delvis avhengig av p53 status i HCT116-celler, og som irinotecan øker celledød når den kombineres med Nek11 tømming på en måte som er p53-avhengig. Derfor er Nek11 sannsynlig til å spille en tilsvarende rolle i responsen av HCT116 cellene til IR og irinotecan.
A. Skjematisk fremstilling av tidsforløpet for cellen behandlinger. 24 timer etter utsåing ble cellene transfektert med siRNA oligonukleotider. 52 timer senere ble cellene enten ubehandlet eller behandlet med 5 uM irinotecan. De ble deretter samlet opp og fiksert for PI-baserte flowcytometri etter ytterligere 20 timer. B C. Ved å følge protokollen som er beskrevet i A, HCT116 WT og p53-null-celler ble transfektert med sirnas som angitt, og ubehandlet (B) eller behandlet med irinotecan (C), før analyse ved strømningscytometri. Fordeling av celler i henhold til flowcytometri profil er indikert (2n, G1, 2n-4n, S; 4n, G2 /M). D-G. Histogrammer representerer prosentandelen av sykling HCT116 WT (D, E) og p53-null (F, G) celler i G2 /M. H-K. Histogrammene viser prosentandelen av HCT116 WT (H, I) og p53-null (J, K) celler med sub-2n DNA. Histogrammer i DK er basert på data i B og C.
p
verdier står i forhold til siGL2.
Identifikasjon av fire Nek11 spleisevarianter som gjennomgår nucleocytoplasmic skyt
den første karakterisering av humant Nek11 beskrevet to spleisevarianter, en lang versjon av 74 kDa, betegnet Nek11L, og en kortversjon av 54 kDa, betegnet Nek11S [9]. Gjennom analyse av genuttrykk databaser, identifiserte vi to mulige spleisevarianter som vi betegnet Nek11C og Nek11D, med spådd størrelser på 56 og 69 kDa, hhv. Alle fire varianter har identiske N-terminale sekvens av 466 rester som omfatter det katalytiske domenet, og to forutsagte kveil-spoler. Nek11S og Nek11C avslutte snart etter, om enn med ulike sekvenser. Nek11L og Nek11D ha mer utvidet C-endene, først dele en ekstra identisk ~ 50 rester før den ender med alternative sekvenser (figur 4A). For å finne ut om disse variantene hadde forskjellige egenskaper, må vi først genererte U2OS celler som stabilt uttrykte GFP-merket versjoner av hvert Nek11 variant. Disse cellene ble anvendt for det formål å subcellulære lokaliseringsstudier, mens det har vist seg at Nek11 uttømming perturbs DDR i disse cellene [7]. Vi har også generert en U2OS cellelinje som uttrykker en kinase-døde «(KD) versjon av Nek11L med mutasjon i to essensielle katalytiske rester (K61R /D158A) for å avgjøre om lokalisering kan være aktivitetsavhengige.
A. Skjematisk representasjon av de fire Nek11 protein isoformene. De forskjellige C-termini er angitt og stiplede linjer angir posisjonene ved hvilke proteinene divergerer. Posisjonene av kinase domene, kveilet-spoler, residienummerne og forutsagte molekylvekter er indikert. B. Lysater fra U2OS: GFP-Nek11 stabile cellelinjer eller U2OS parentale celler ble analysert ved SDS-PAGE og Western blotting med antistoffer mot Nek11, GFP og α-tubulin. C. U2OS celler ble transfektert med konstruksjoner angitt, og etter 20 timer, behandlet ± MG132 i 4 timer. Lysater ble analysert ved hjelp av Western blot med antistoffer indikert. M.wts. (KDA) vises igjen i B og C. D. GFP bare og GFP-Nek11 cellelinjer som indikert ble behandlet ± LMB i 3 timer før fiksering og farging med GFP antistoffer. Skala barer, 5 um.
Western blot-analyse viste at den GFP-Nek11D variant ble uttrykt ved mye lavere nivåer i forhold til de andre variantene i stabile cellelinjer (figur 4B). Inkubasjon med proteasominhibitor, MG132, førte til selektiv oppregulering av denne isoformen som tyder på at Nek11D varianten er unik blant disse fire variantene i besittelse sekvenser som er rettet mot det for ubiquitin-mediert degradering, antagelig i sin unike C-terminal (fig 4C). Immunofluorescens-mikroskopi viste at mens Nek11L og Nek11D isoformer ble henlagt til cytoplasmaet, Nek11S og Nek11C ble detektert både i cytoplasma og cellekjernen (figur 4D). Kinase-død Nek11L var begrenset til cytoplasma som villtype-proteinet. Som Nek11 ble rapportert å lokalisere til nukleoli [19], vi vurdert om variantene kanskje shuttle mellom cytoplasma og kjernen. Inhibering av atom eksport med Crm1 inhibitor, leptomycin B (LMB), førte alle fire Nek11 varianter til å akkumulere i kjernen, riktignok uten åpenbar konsentrasjon i nucleoli. Kinase-dead Nek11L også gjennomgikk nucleocytoplasmic skyt indikerer at dette ikke er avhengig av sin enzymatisk aktivitet.
Identifikasjon av sekvenser som regulerer nucleocytoplasmic skyt av Nek11
For å kartlegge områder i proteinet som kreves for kjernekraft import og eksport, analyserte vi lokalisering av en rekke Nek11 trunkeringstegn mutanter (fig 5a). Den N-terminale katalytiske domenet alene (rester 1-287) lokalisert til cytoplasma og gjorde ikke shuttle. I motsetning til dette, den C-terminale ikke-katalytiske domene av Nek11L (restene 288-645) var cytoplasmisk i fravær av LMB men konsentrert i kjernen med LMB. Dette indikerer at den inneholder motiver som er nødvendige for nucleocytoplasmic skyt (Fig 5B og 5C). Som kanoniske kjernefysiske lokalisering og eksport sekvenser var ikke til stede, genererte vi fem nye konstruksjoner som representerer C-terminal trunkeringer av Nek11L (figur 5A og 5D). En konstruksjon som omfatter det katalytiske domenet og begge coiled-spole motiver (rester 1-388) var atom uavhengig av LMB behandling, mens en utvidet konstruere omfatter rester 1-541 oppførte seg som full-lengde protein være cytoplasma i ubehandlede celler og kjernekraft med LMB ( fig 5E). En konstruksjon som representerte regionen konservert mellom alle fire Nek11 varianter, 1-466, viste en mer likeverdig atom cytoplasma distribusjon minner om S og C varianter som avslutter snart etter dette punktet. I likhet med de variantene, denne konstruksjonen konsentrert i kjernen etter behandling LMB. Derfor foreslår vi at coiled-spole regioner inneholde sekvenser som er nødvendige for kjernekraft import, mens regionen mellom restene 388 og 465 inneholder sekvenser som er nødvendige for kjernefysisk eksport.
A. Skjematisk fremstilling av GFP-Nek11L konstruksjoner brukt til å undersøke subcellulære lokalisering. Dominerende lokalisering til cytoplasma (C), kjerne (N) eller lik fordeling (C /N) ± LMB behandling er indikert. B. Western blots med GFP og a-tubulin-antistoffer av lysatene fremstilt fra U2OS celler transient transfektert i 24 timer med de Nek11L konstruksjonene vist. Kinase domene inneholder rester 1-287 og C-terminale domenet inneholder rester 288-645. M. WTS (KDA) er angitt til venstre. C. U2OS-celler ble transfektert med konstrukter som er angitt og, etter 24 timer, behandlet ± LMB i 3 timer før fiksering og farging med GFP antistoffer. D E. Western blot og immunofluorescens-farging ble utført som i henholdsvis B og C, med konstruksjonene angitt. Skala barer, fem mikrometer.
Nek11S spiller en nøkkelrolle i DNA-skader indusert G2 /M arrest i HCT116 cellene
For å finne ut om alle fire Nek11 spleisevarianter er uttrykt i HCT116 -celler, så vel som tre andre CRC-cellelinjer (HT29, SW480 og SW620), kvantitativ RT-PCR ble utført med isoform-spesifikke primere (S4A og S4B fig). Disse identifiserte mRNA for hver variant i alle fire cellelinjer, med Nek11L og Nek11C konsekvent å være den mest og minst rikelig, henholdsvis (S4C fig). Vi så sammenlignet deres overflod i disse CRC-cellelinjer i forhold til det i den udødeliggjort human colonocyte linje, HCEC. Dette indikerte bemerkelsesverdig variasjon med økt Nek11S i HT29 og økt Nek11C i SW620 (S4D fig). Ellers nivåene av hver variant var enten lik eller redusert i forhold til HCEC celler.
For å teste bidraget av disse spleise varianter til DDR i HCT116 cellene, to sett med sirnas ble validert, en som co-utarmer både de lengre isoformene, Nek11L og Nek11D, og en som selektivt utarmer Nek11S (S4E fig). Disse ble så brukt til HCT116 WT og p53-null-celler ved hjelp av de protokoller som er beskrevet tidligere for å analysere respons på IR og irinotecan av PI-baserte flowcytometri (S5 Fig). I HCT116 WT-celler, var det en beskjeden reduksjon i G2 /M-populasjon ved uttømming av Nek11L /D som respons på IR, men ikke i respons til irinotecan. I motsetning til dette var det en vesentlig reduksjon i G2 /M-populasjon i respons til begge behandlingene ved uttømming av Nek11S (fig 6A-6C, S2E og S2F Fig). I HCT116 p53-null-celler, en liten, men signifikant reduksjon i G2 /M populasjon ble observert ved Nek11L /D uttømming i respons til irinotekan men ikke IR, mens Nek11S uttømming førte til en betydelig reduksjon i respons til begge behandlingene (fig 6D -6F). Som for uttømming av total Nek11, var bemerkelsesverdig at den fraksjon av G2 /M-celler returnerte til basalnivåer ved uttømming av Nek11S i WT, men ikke p53-null-celler. Derfor, selv om den relative uttømming effektivitet kan variere, og disse data indikerer at minst Nek11S spiller en viktig rolle ved formidling av DNA-skade indusert G2 /M arrest i HCT116-celler, samtidig som bekrefter at denne responsen er delvis p53-avhengig.
AL. Ved hjelp av protokollen beskrevet i figur 1A for bestråling og figur 3A for irinotecan behandling, HCT116 WT (AC, GI) og HCT116 p53-null (DF, JL) celler ble transfektert med siRNA oligonukleotider å co-utarme Nek11L og Nek11D (L /D ), eller utarme Nek11S eller luciferase (siGL2). Histogrammene viser prosentandelen av sykkel celler ved G2 /M (A-F) og av totale celler med sub-2n DNA (G-L).
p
verdier står i forhold til siGL2 for hver behandling.
Undersøkelse av sub-2n befolkningen via PI-basert flowcytometri avslørte at uttømming av Nek11S, men ikke Nek11L /D, resulterte i en betydelig økning i celledød i HCT116 WT celler eksponert for IR eller irinotecan (figur 6G-6I). Nedbryting av Nek11S, men ikke Nek11L /D, førte også til betydelige nivåer av celledød i p53-null celler eksponert for IR eller irinotecan (Fig 6J-6L). Dette sistnevnte resultat var uventet gitt tidligere observasjoner som celledød i Nek11-uttømte celler eksponert for disse behandlingene er p53-avhengig. Men uttømming av Nek11S også ført til en betydelig økning i celledød i fravær av gentoksisk behandling i p53-null celler som tyder på at dette ikke var en spesifikk respons på eksogene DNA-skader.
Diskusjoner
Tidligere studier viste at kinaseaktiviteten av Nek11 er stimulert i HeLa-celler eksponert for DNA-ødeleggende midler og replikasjons hemmere [9]. Videre Nek11 ble identifisert i en skjerm for gener som kreves for G2 /M arrest i U2OS celler eksponert for IR, med Nek11 fremme Cdc25A degradering nedstrøms Chk1 [7]. Her viser vi at tap av Nek11 opphever G2 /M rest og reduserer celleoverlevelse i HCT116 CRC-celler eksponert for enten infrarød eller det kjemoterapeutiske middel, irinotecan. Videre viser vi at Nek11 gjennomgår nucleocytoplasmic skyt på en måte som minner om andre DDR proteiner. Denne innsikten gir ytterligere bevis på at Nek11 er en viktig formidler av G2 /M DNA skade respons samt å være nødvendig for overlevelse av CRC celler.
Normale celler eksponert for DNA-skade arrest primært på G1 /S overgang . Imidlertid er dette sjekkpunkt ofte mangler i kreftceller som har tapt enten p53 eller Rb. Disse celler er derfor mer avhengig av G2 /M kontrollpunktet når de utsettes for DNA-ødeleggende midler. Våre studier viser at mens eksponering av HCT116 cellene til både IR og irinotecan førte til en stor økning i G2 /M brøkdel, i samsvar med aktivering av G2 /M sjekkpunkt, var denne andelen vesentlig redusert ved fjerning av Nek11. I WT celler, Nek11 uttømming redusert G2 /M brøkdel til baseline nivå stede i en sykkel befolkningen støtter en potensiell rolle for Nek11 i G2 /M sjekkpunkt i HCT116 cellene. Men i de p53-null-celler, til G2 /M-fraksjon, selv om betydelig redusert, holdt seg over grunnlinjen. Dette tyder på at Nek11 ikke bare medfører en p53-uavhengig G2 /M rest etter DNA-skade, men i tillegg hindrer en p53-avhengig tap av G2 /M-celler (figur 7).
Denne skjematisk modell illustrerer slått roller Nek11 i responsen av CRC celler til agenter som forurolige DNA integritet enten gjennom direkte DNA-skader eller stoppet replikering. Tidligere studier har indikert at Nek11 ligger nedstrøms for ATM /ATR og Chk1 og handlinger for å hindre mitotisk progresjon gjennom å fremme nedbrytning av Cdc25A. Våre resultater viser at i CRC-celler, er Nek11 nødvendig ikke bare for å sikre G2 /M arrest, men også for å beskytte mot p53-avhengig apoptose. Svikt i G2 /M sjekkpunkt kan føre til celledød på en p53-uavhengig måte delvis gjennom mitotisk katastrofe.
I samsvar med dette ble det observert en moderat økning i antall celler i sub -2N brøkdel, en indikasjon på døende celler, i Nek11-utarmet WT celler eksponert for IR eller irinotecan som ikke ble sett med p53-null celler. Likeledes, spesifikk analyse av apoptotiske fraksjon av annexin V-analyse avslørte at en liten brøkdel av Nek11-utarmet WT, men ikke p53-null, celler utsatt for infrarød eller irinotekan angitt apoptose. Derfor, i fravær av Nek11, enkelte HCT116-celler utsatt for eksogent DNA-skade gjennomgå en p53-avhengig apoptose, mens andre antagelig på nytt gå inn i cellesyklus i en p53-uavhengig måte. B
