Abstract
Kreft-testikkel (CT) antigener er hovedsakelig uttrykt i testikkel eller morkake , men fraværende i de fleste voksne vev. Under malign transformasjon CT gener er ofte aktivert. CT antigen 16 (CT16, PAGE5) blir ofte uttrykt i avansert melanom men dens biologiske funksjon har vært ukjent. For å undersøke hvilken rolle CT16 i celleoverlevelse vi slo det ned i A2058 melanom celler med bestemte sirnas og utsatt cellene til kreftmedisinen cisplatin kjent for å indusere apoptose. Som et resultat, ble celleoverlevelse markert redusert. For å studere effekter av CT16 på celle overlevelse i mer detalj, ble celle genuttrykk profiler forsket etter CT16 stanse i CT16 positiv A2058 melanomceller, samt etter CT16 overekspresjon i CT16 negative WM-266-4 melanomceller. Blant de 11 genene både oppregulert ved CT16 taushet nedregulert ved CT16 overekspresjon eller vice versa, 4 gener var potensielt apoptotiske eller antiapoptotic gener. CT16 ble anerkjent som en positiv regulator av antiapoptotic metallothionein 2A og interleukin 8 gener, mens det hemmet uttrykk for apoptose indusere dickkopf 1 (DKK1) genet. I tillegg CT16 forbedret ekspresjon av fettsyre-bindende protein 7, er en kjent promotor for melanom progresjon. Effekten av CT16 på DKK1 ekspresjon var p53 uavhengig. Videre CT16 ikke regulere apoptotiske gener via DNA metylering. I tjue melanoma metastase vevsprøver gjennomsnittlig DKK1 mRNA nivå ble vist å være signifikant (p 0,05) lavere i høy CT16 uttrykke svulster (n = 3) i forhold til de svulster med lav CT16 uttrykk (n = 17). Dermed våre resultater tyder på at CT16 fremmer overlevelse av melanom celler og er derfor et potensielt mål for fremtidig utvikling av legemidler
Citation. Nylund C, Rappu P, Pakula E, Heino A, Laato L, Elo LL, et al. (2012) Melanom-Associated Cancer-testikler Antigen 16 (CT16) Regulerer Uttrykk for apoptotisk og Antiapoptotic Gener og fremmer celle overlevelse. PLoS ONE 7 (9): e45382. doi: 10,1371 /journal.pone.0045382
Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA
mottatt: 4 mai 2012; Godkjent: 17 august 2012; Publisert: 21.09.2012
Copyright: © Nylund et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Turku universitetssykehus EVO tilskuddet (prosjekter 13 040 og 13 041, https://www.tyks.fi), Southwest fond i det finske Cancer Research Foundation (https://www.cancer.fi), Academy of Finland (http : //www.aka.fi), Sigrid Juselius Foundation (https://www.sigridjuselius.fi), og Kreftforeningen i Finland (https://www.cancer.fi). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft-testis antigener (oppfordringer) danner en heterologe gruppe proteiner som er uttrykt i kjønnsceller og trophoblasts [1]. CTdatabase av Ludwig Institute for Cancer Research (https://www.cta.lncc.br/index.php) [2] viser mer enn 140 CTAs. Den CTA kan deles til X-kromosom-kodet (X-CTA) og ikke-X-kromosom-kodet CTAs (non-X-CTA). Den vanligste mekanismen for CTA genaktivering er promoteren demetylering [1]. Gametogenesis og tumorigenesis har mange tilsvarende og felles arrangementer, blant annet global hypometylering og CTA uttrykk [3]. Det er imidlertid uklart, om uttrykk for CTAs er bare en konsekvens av demetylering hendelser vanlige i tumorigenesis eller om den CTAs ha en aktiv rolle i å fremme kreft progresjon.
Ifølge CTdatabase, mange ikke-X- CTAs synes å ha en rolle i spermatogenesen og sperm funksjon i normal testikkel. I motsetning til dette er den biologiske rollen til X-CTA for det meste ukjent. Funksjonen av genprodukter som er kodet ved to X-CTA familier, MAGE og SSX, har blitt tidligere studert. MAGE-A-antigenene har blitt rapportert å direkte kommunisere med p53 og undertrykke dens funksjon [4], [5]. Dessuten har MAGE proteinene blitt vist å danne et kompleks med et stillas protein, KRAB-assosiert protein 1 (KAP1) og for å undertrykke p53-avhengig apoptose [6]. MAGE er også blitt vist å interagere med RING E3 ubiquitin-ligaser og for å forbedre den ubiquitinering aktiviteten av RING domain protein mot sine mål, slik som p53 [7]. SSX familiemedlemmer som kan blandes med SS18, som et resultat av en spesifikk translokasjon i human synovial sarcom [8], er blitt foreslått å virke som transkripsjonelle regulatorer [9]. Gjær to-hybrid screening og glutation-S-transferase pull-down-analyser har vist at SSX2 proteinet binder seg til RAB3IP og SSX2IP proteiner [10]. På den annen side har SSX proteiner blitt rapportert å colocalize med medlemmer av polycomb gruppe komplekset [11], og i senere studier bevis på rollen til SSX proteiner i histon modifikasjon og DNA-metylering har blitt funnet [12], [13] .
CT16 (også kjent som PAGE5, GAGEE1, CT16.1) er en X-CTA og dets nærmeste slektninger hører til prostata-assosiert antigen familie (HOVED gener), som i sin tur er relatert til XAGE og GAGE genfamilier [14]. CT16 ble først rapportert i en studie der Unigene databasen ble søkt etter gensamlingene inneholder uttrykt sekvens koder stammer utelukkende fra både normale menneskelige testikkel og tumor cDNA-bibliotek. Ekspresjonen av CT16 i melanomer, så vel som i lunge og nyre cancer ble vist på mRNA-nivå [15]. Mer nylig har vi rapportert uttrykk for CT16 mRNA i 11 av 22 melanom hud metastasering. Videre viste vi at til tross for homologi til kjente prostata-assosierte antigener CT16 ikke blir uttrykt i primær prostatakreft [16]. Vi har også utviklet en sensitiv analyse for å måle CT16 direkte fra pasientsera og viste at 14 av 23 (61%) pasienter med metastatisk melanom hadde påvisbare CT16 nivåer [16].
Den biologiske rolle CT16 har vært ukjent , men det finnes noen rapporter om de antatte funksjonene til de CT16 homologer. Ett GAGE familiemedlem som har 30% identitet med CT16 har blitt rapportert å hemme apoptose og for å samhandle med nucleophosmin /B23 og interferon-regulerende faktor 1 [17]. Tilsvarende har det nylig blitt vist at prostata cancer assosiert antigen 4 (side4), som har 43% identitet med CT16, er en anti-apoptotiske protein [18]. I samme studie, forfatterne også rapportert at Side4 er en egen uordnede protein (IDP) som binder seg til GC-rike sekvenser i dobbelttrådet DNA [18]. NMR-analyse av CT16 har også indikert at det er en IDP [19]. Faktisk er den sekvensanalyse med IUPred algoritme (https://iupred.enzim.hu) [20] forutsier at alle proteiner som er relatert til CT16 er egentlig uoversiktlig. Fordrevne er proteiner som ikke danner en stiv 3-D struktur i fysiologiske betingelser [21]. Videre en fersk
i silico
analyse tyder på at de fleste CTA er internt fordrevne [22]. Omtrent 25% av pattedyrproteiner er anslått å være fordrevne, og omtrent 75% av pattedyrsignal proteiner er spådd å ha lange uordnede regioner [23]. Det har blitt foreslått at fordrevne ofte har flere funksjoner, en egenskap betegnes som moon [24]. Dermed kan også CT16 og CT16 relaterte CTAs har ulike funksjoner avhengig av biologisk sammenheng og cellulær lokalisering.
I denne artikkelen har vi studert hvilken rolle CT16 i melanom. Vi viser at lyddemping av CT16 med siRNAs forbedrer cisplatin-indusert celledød. Transkriptomet analyse utnytte CT16 overekspresjon og knockdown avslørte at CT16 negativt regulerer, sannsynligvis indirekte uttrykk for en antiapoptotic protein DKK1. Vi viser at denne reguleringen er p53 uavhengig og CT16 har ingen effekt på metylering av overlevelse regulere gener. Vi foreslår også at menneske melanom hud metastase prøver med høy CT16 mRNA nivå kan ha mindre DKK1 mRNA enn de med lav CT16 mRNA nivå.
Resultater
CT16 er uttrykt i melanoma metastaser og melanomcellelinjer på proteinnivå
Vi har tidligere rapportert produksjon av spesifikke polyklonale antistoff mot humant rekombinant CT16 [16]. Her ble det antistoffet som brukes til å verifisere CT16 uttrykk på proteinnivå i melanom hud metastaser. De frosne vevsprøver ble undersøkt ved hjelp av immunhistokjemi. CT16 uttrykk var bare synlig i melanoma metastase vev som uttrykte CT16 mRNA (Figur 1A, B). I tillegg kan mengden av CT16-spesifikk farging korrelerte godt med mRNA-nivåer (figur S1). Den primære prostatakreft prøvene brukes som negative kontroller viste ingen farging for CT16 (figur 1C). En testis prøve ble benyttet som en positiv kontroll og CT16 ble lokalisert i basalrommet spermatogenic epitel, hovedsakelig i spermatogoniene (figur 1D). I de melanom metastase prøvene CT16 syntes å være hovedsakelig cytoplasmatisk, men i enkelte celler kjerner ble også positivt farget (figur 1A).
CT16 ble påvist i vevsprøver med CT16-spesifikke antistoff visualisert ved Vectastain ABC kit og diaminobenzidine, og delene ble kontra med hematoksylin. (A, B) melanoma skin metastaseprøver fra to pasienter. (C) Primær prostatakreft (negativ kontroll). (D) Testis prøve (positiv kontroll). Både cytoplasmisk og atom CT16-spesifikk farging er synlig i det forstørrede området (innfelt) av melanom metastase huden prøven. I testikkel prøven forstørrelsen viser CT16-spesifikk farging av spermatogonier. Målestokken i testiklene bilde representerer forstørrelse som 150 mikrometer for alle bildene.
Den intracellulære plasseringen av CT16 ble undersøkt videre i SK-MEL-2 melanomceller samt i WM-266- 4-melanomceller stabilt transfektert med CT16 cDNA-inneholdende eller intakte (kontroll cDNA) som inneholder ekspresjonsvektoren. Den CT16 CT16 ekspresjon av de transfekterte celler ble verifisert både på mRNA og proteinnivå (figur S2). Immunofluorescens-analyse ved bruk av CT16 antistoff (figur 2A) bekreftet spesifisiteten av antistoffet, ettersom CT16 negative WM-266-4-celler transfektert med kontroll plasmidet viste noe bakgrunns fluorescens bare (figur 2A). I CT16 CT16 positive celler ser ut til å lokalisere både i kjernen (unntatt nucleoli) og cytoplasma. For å bekrefte lokaliseringen i kjernen, ble SK-MEL-2 atom ekstrakt fremstilt og analysert ved Western blotting. CT16 ble funnet både i den kjernefysiske og cytosoliske fraksjon, mens et cytosolisk protein kontroll MEK1 /2 var bare til stede i den cytosoliske fraksjon (figur 2B).
(A) bilder fra angitte humane melanomcellelinjer som er merket med kanin polyklonalt antistoff mot human cancer testis antigen protein CT16 etterfulgt av sekundære antistoff Alexa Fluor 488 geit-anti-kanin-IgG (H 0,001 (ANOVA, Tukey HSD)
CT16 fremmer melanoma celleoverlevelse
For å teste videre biologiske rolle CT16 vi utsatt melanomceller til en apoptose-induserende kreft narkotika, cisplatin. A2058 celler ble først behandlet enten med CT16 spesifikke sirnas eller tak siRNA i 48 timer, og etter tilsetning av cisplatin cellekulturene ble overvåket i 30 timer i 10-minutters intervaller ved bruk av xCELLigence teknologi. I denne teknologien, blir cellene dyrket på en overflate som inneholder integrerte mikroelektroder, og den elektriske impedans mellom elektrodene forårsaket av cellene blir målt. Den relative endringen i målt elektrisk impedans er uttrykt som celleindeks (CI). Både celleantall og morfologi påvirker CI, og celle løsgjøring og død blir sett på som en reduksjon i CI.
Cisplatin redusert CI av CT16 siRNA behandlede celler vesentlig mer enn for kontroll siRNA behandlede celler (figur 3D, E ). Forskjellen var mest tydelig når cisplatin konsentrasjon på 50 uM ble anvendt. I motsetning til dette, CT16 hadde ingen virkning på overlevelsen i nærvær av staurosporin (0 til 600 nm) (ikke vist). Det synes således at CT16 inhiberer cisplatin-indusert, men ikke staurosporin indusert død av A2058 melanomceller.
I nærvær av cisplatin CT16 siRNAs kunne øke aktiveringen av caspase-3, som vist ved hjelp av Western blotting med antistoffer som spesifikt gjenkjenner spaltes caspase-3 (figur 3C). Dermed CT16 kunne beskytte melanom celler fra apoptose.
CT16 regulerer overlevelse assosierte gener
For ytterligere å undersøke hvilken rolle CT16 i celle overlevelse, ble to transcriptomic profilering eksperimenter utført. I det første eksperiment ble CT16 positiv A2058 melanomceller behandlet med CT16 spesifikk siRNA og deretter sammenlignet med A2058 celler behandlet med kontroll siRNA. I det andre forsøket, stabilt å regulere cDNA transfiserte WM-266-4 melanomceller ble sammenlignet med stabilt CT16 cDNA transfiserte celler. Microarray data er blitt deponert, ifølge MIAME retningslinjer, i NCBI Gene Expression Omnibus [25], tiltredelse antall GSE31352 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE31352 ). Rangen produkt algoritme ble brukt til å velge forskjellig uttrykt gener [26]. Algoritmen oppdager gener som er konsekvent funnet blant de mest opp- eller nedregulert gener på tvers av replikater. Bruken av rekkene i stedet for uttrykksverdier øker robustheten mot støy. Genene med rang produkt falske funnrate (FDR) 0,05 ble sendt til genet ontologi analyse av GoTermMapper verktøy som kartlegger gener til valgt cellekomponent og biologiske prosessen genet ontologi kategorier (GO Slims). Den generelle fordeling av cellulær komponent eller biologisk prosess av de differensielt uttrykte gener ble funnet å være lik både i CT16 overekspresjon og knockdown eksperimenter (figur 4). For å identifisere de biologiske prosessene de differensielt uttrykte gener kan delta i, ble en funksjonell annotering analyse utført ved hjelp av DAVID verktøyet. Bare de vilkår med Benjamini-Hochberg FDR 0,05 ble inkludert i resultatene. Genene som ble oppregulert ved CT16 overekspresjon ble betydelig anriket i de biologiske prosesser som fremmer overlevelse eller er relatert til betennelse, kjemisk homeostase samt respons på stimuli og såret (tabell 1). Genene som ble nedregulert ved CT16 overekspresjon var signifikant overrepresentasjon utelukkende i den antigen prosessering og presentasjon av peptid eller polysakkarid antigen via MHC klasse II fremgangsmåte (tabell 1). Analyse av forskjellig uttrykt gener i CT16 knockdown eksperiment viste ingen biologiske prosesser med Benjamini-Hochberg FDR 0,05 (ikke vist)
De differensielt uttrykte gener fra CT16 knockdown og overekspresjon eksperimenter ble analysert separat.. Antallet gener kommenterte for den kategorien er i parentes. Kartleggingen å gå slanke ontologi ble gjort med GoTermMapper (https://go.princeton.edu/cgi-bin/GOTermMapper).
For å begrense antallet gener som skal studeres, vi valgte bare de genene som ble nedregulert av CT16 bestemt siRNA og oppregulert grunn CT16 overekspresjon eller
vice versa plakater (rang produkt FDR 0,1 i begge forsøk). Av det totale av 11 gener som oppfyller disse kriteriene, har 5 tidligere blitt rapportert å være involvert i kreftutvikling (tabell 2). Basert på disse eksperimentene CT16 ble anerkjent som en positiv regulator av antiapoptotic metallothionein 2A (MT2A) og interleukin 8 (IL8) gener, mens det hemmet uttrykk for apoptose indusere dickkopf 1 (DKK1) genet. I tillegg CT16 forbedret ekspresjon av fettsyre-bindende protein 7 (FABP7), en kjent promotor for melanom progresjon. Differensial regulering av FABP7, MT2A og DKK1 gener ble bekreftet av real-time QRT-PCR analyse av CT16 overekspresjon WM-266-4 celler (figur 5A, figur S4).
(A) Verifikasjon av differensial DKK1 mRNA-ekspresjon i (WM-266-4-celler transfektert med kontroll cDNA eller CT16 cDNA. ved QRT-PCR. (B) Differensiell DKK1 mRNA-ekspresjon ble også gjentas på A2058 celler behandlet med den angitte sirnas i 48 timer. (C) for Western blot DKK1 i kulturmedium av A2058-celler som ble behandlet med den angitte sirnas i 48 t. (D) DKK1 er nedregulert i melanomprøver med høy CT16 ekspresjon. CT16 og DKK1 mRNA-nivåer av melanom hud metastase vevsprøver ble påvist ved QRT-PCR.
p
verdi ble oppnådd ved å teste forskjellen i DKK1 mRNA nivå mellom de melanomprøver med høy CT16 mRNA nivå (mer enn 22% av β-aktin mRNA) og de med lav CT16 mRNA nivå ( 7% av β aktin mRNA) ved Tukey-Kramer test.
for å teste utvalgskriteriene av genene i tabell 2, vi brukte sanntid QRT-PCR for å analysere tre gener, CTSL, DDAH1 og BIRC5 som ble nedregulert av CT16 bestemt siRNA og oppregulert grunn CT16 overekspresjon eller
vice versa
men hadde rang produktet FDR 0,1. I disse målingene virkningen av CT16 på ekspresjon ikke ble bekreftet (figur S4). Dermed valgte rang produktet FDR terskelverdien effektivt filtrert ut falske positiver, og samtidig beholde den sanne seg.
CT16 er en negativ regulator av DKK1 i melanom
Den ekstracellulære Wnt antagonist DKK1 ble valgt for videre studier, da det tidligere har vist seg å aktivere apoptose og for å bli nedregulert i melanoma og andre kreftformer [27], [28]. To uavhengige CT16 sirnas økt DKK1 mRNA nivåer i A2058 celler (figur 5B). Effekten av CT16 på DKK1 ekspresjon ble også bekreftet på proteinnivå i cellekulturmedium av A2058-celler ved Western blot. Knockdown av CT16 bestemt siRNA resulterte i en økning i akkumulering av DKK1 protein inn i mediet (figur 5C).
For å finne bevis for at CT16 regulerer også DKK1 uttrykk nivåer i svulster, ble 20 melanom hud metastaseprøver analysert ved sanntids QRT-PCR. Den CT16 mRNA nivå i forhold til p-aktin var under 7% i 17 prøver som ble gruppert som lav CT16 melanom prøver. CT16 mRNA nivået var over 22% av β-aktin i tre prøver som ble gruppert som høye CT16 melanom prøver. Interessant, høye CT16 prøvene hadde signifikant (p 0,05, Tukey-Kramer-test) lavere gjennomsnittlig DKK1 mRNA-nivå i forhold til den lave CT16 prøver (figur 5D), noe som tyder på at høye CT16 nivået kan være en årsak til tidligere beskrevet nedregulering av DKK1 uttrykk i melanom.
CT16 regulerer sine mål gener i en p53 og DNA metylering uavhengig måte
De molekylære interaksjoner av X-CTAs er bare kjent i noen få tilfeller. Siden MAGE proteiner er kjent for å påvirke p53 funksjoner (Yang et al., 2007), ønsket vi å studere effekter i ulike CT16 positive cellelinjer. Ingen endring i p53-protein-ekspresjon ble påvist ved immunblotting i CT16 siRNA knockdown SK-MEL-2-celler sammenlignet med kontroll siRNA behandlede celler (figur S5a). Lignende resultat ble også mottatt mellom CT16 og kontroll cDNA transfekterte WM-266-4 celler (figur S5b). Vi testet også effekten av CT16 i humane osteosarkomceller Saos-2-celler som er kjent for å ha noen p53-ekspresjon. Den negative ekspresjon av p53 i Saos-2-celler ble bekreftet med QRT-PCR (ikke vist). Resultatet viste, på samme måte som i de A2058-celler, en klar oppregulering, av DKK1 etter CT16 knockdown, noe som indikerer at p53 ikke er involvert i prosessen (figur S5C). Heller ikke hadde CT16 noen effekt på konformasjonsendring av p53 i råekstraktet av WM-266-4-celler (Figur S5D). Videre var det ingen forskjell i stabilitet mellom de p53 CT16 siRNA behandlede A2058-celler og kontrollcellene etter hemming av proteinsyntese med CHX fig S5E). I henhold til dette ble ingen betydelig anrikning av p53 målgener blant differensielt uttrykte gener funnet (ikke vist). Sammen disse resultatene støtter ideen om at p53 ikke formidle effekten av CT16 eller delta i apoptose.
Noen X-CTAs også påvirke genet metylering og posttranslasjonelle modifikasjoner i histoner. For å undersøke dette ble et genom-wide promoter-spesifikk kromatin immunoutfellingsanalyse for WM-266-4-celler stabilt transfektert med CT16 eller kontroll cDNA utføres ved anvendelse av DNA-metylering spesifikk og acetylert histon H3-spesifikke antistoffer og et mikromatrise kjørt 30.000 humane promotorer. Eksempel-spesifikke gener, definert som de som har topper (detektert og bedømt ved NimbleScan programvare) som har FDR 0,05 i prøven og FDR≥0.2 i kontroll eller vice versa, ble analysert ved hjelp av DAVID. Det var ingen signifikant beriket gener i noen genet ontologi kategorier i utvalget spesifikke gener (ikke vist). Vi sammenlignet også listene over differensielt regulerte gener i WM-266-4 avledet cellelinjer med eksempelspesifikk gen-lister fra både metylering spesifikk og histon acetylering bestemt immunoutfellingsanalyser (tabell S1). Resultatene antyder at det er en sammenheng mellom histon H3 acetylering og genuttrykk av CT16 regulerte gener. Det er imidlertid uklart om CT16 er involvert i histone acetylering hendelser eller resultatet gjenspeiler bare den velkjente sammenhengen mellom histon H3 acetylering og genuttrykk. I motsetning til histon H3-acetylering, metylering DNA viste ingen korrelasjon med CT16 regulerte gener tyder på at endringer i genekspresjon profilen etter CT16 ikke formidles av DNA-metylering.
Nylig er det blitt vist at klasse I MAGE proteiner regulere KAP1 og KRAB domene sink finger transkripsjonsfaktor-mediert genet undertrykkelse via interaksjon med KAP1 [34]. Imidlertid er det lite sannsynlig at også CT16 ville interagere med KAP1, siden KAP1 mål identifisert i et genom-bred kromatin immunoutfellingsanalyse av KAP1 binding [35] ikke ble anriket blant differensielt uttrykte gener fra enten CT16 knockdown eller overekspresjon eksperimenter ( ikke vist).
Vi har tidligere utelukket muligheten for at CT16 kan direkte binde til GC-rike sekvenser i dobbeltkjedet DNA [19] på en lignende måte som den paralog side4 [18]. Her kunne vi ikke vise lokalisering av CT16 til de umiddelbare arrangører av sine mål gener (Figur S6). Således er mekanismen for CT16 handling, som funksjon av de andre X-CTA, er ukjent.
diskusjon
Den effektive behandling av metastatisk melanom er et stort uløst problem. Derfor er det et presserende behov for å få ny informasjon om molekylære mekanismer som regulerer overlevelse og stoffet motstand i melanom. Nyere resultater fra kliniske studier har generert optimisme som i nær fremtid nye spesifikke legemidler, slik som ipilimumab [36] og BRAF-hemmere [37], kan brukes til å stoppe utviklingen av en avansert sykdom. Men mange melanomer også ser ut til å utvikle resistens mot de nye medikamentmolekyler hurtig, noen ganger i måneder [38].
Vi har nylig rapportert at ekspresjon av CT16 blir ofte indusert i human melanoma. Videre kan serum CT16 måles og brukes til å følge utvikling av sykdommen [16]. Her viser vi at CT16 beskytter melanomceller mot cisplatin (50 mm) indusert celledød. Platina-komplekser binder seg til DNA og tverrbindes, noe som fører til apoptose. Interessant, CT16 kunne ikke hindre staurosporin-indusert celledød. Staurosporin er et alkaloid som inhiberer et bredt spektrum av proteinkinaser [39], og således kan aktiveres apoptose ved flere forskjellige mekanismer [40]. De cellulære funksjoner av de fleste CTA er ukjent, men i tillegg til CT16 også visse andre X-CTA har vært knyttet til celle overlevelse. Transfeksjon av eggstokkreft celler av MAGE-A2 og MAGE-A6 kan indusere paclitaxel og doxorubicin motstand av en ukjent mekanisme [41]. Videre har GAGE-7 blitt beskrevet å virke som en anti-apoptotiske protein i HeLa-celler [17], [42]. Sist, en prostata cancer-assosiert antigen, side4, ble rapportert å inhibere stress-fremkalt celledød [18].
Basert på genomet, bred genekspresjonsanalyser kan CT16 negativt regulere spesifikke biologiske prosesser som apoptose og antigenpresentasjon å forbedre overlevelsen av kreftcelle. Mekanismen for CT16 handling synes å være i det minste delvis relatert til det faktum at det kan regulere ekspresjonen av apoptotiske og antiapoptotic gener, så som metallothionein 2A, IL-8 og DKK1. Disse tre gener var blant de elleve genene som ble funnet å være regulert av CT16 både i CT16 taushet overekspresjon eksperimenter. Metallothionein 2A er kjent for å beskytte HeLa cellene mot ROS-indusert død [30], mens IL-8 hemmer Trail-og legemiddelindusert apoptose av prostatakreftceller [33] og øker tumorigenicity og metastatisk potensial av melanomceller [32]. Mest interessant, CT16 ble funnet å være en negativ regulator av DKK1, et gen som er beskrevet å være signifikant nedregulert i malignt melanom [43]. DKK1 er et ekstracellulært inhibitor av anti-apoptotiske Wnt-signalveien [44] som kan indusere apoptose i melanomceller [27]. Derfor blir reduksjon i DKK1 uttrykk ansett for å være en viktig mekanisme for å overleve i melanomceller. Når vi analysert 20 melanom hud metastaser i sin DKK1 og CT16 mRNA uttrykk, tre prøver viste eksepsjonelt høye CT16 nivåer og samtidig svært lavt DKK1 uttrykk. Dermed våre data tyder på at CT16 overekspresjon er en, men sannsynligvis ikke den eneste mekanismen som fører til DKK1 undertrykkelse i melanom. CT16 forbedrer også ekspresjonen av fettsyre-bindende protein 7 (FABP7), en kjent promotor for melanom progresjon [29].
Den eksakte mekanismen for hvordan CT16 regulerer ekspresjonen av disse genene gjenstår å undersøkes. Side4, en paralog av CT16, ble nylig vist å binde seg direkte til DNA [18]. Videre har både CT16 og Side4 er egentlig uordnede proteiner [18], [19], [45]. Men CT16 binding til DNA er ikke observert [19]. Derfor, til tross for homologi mellom side4 og CT16 virkningsmekanismen kan variere betydelig mellom disse to proteiner. Videre har vi utelatt de to andre kjente mekanismer for CTA-X handling. Våre data indikerer at p53 ikke medierer effektene av CT16 til tross for det faktum at MAGE proteiner som opptrer på denne måten. Vi kunne heller ikke påvise noen sammenheng mellom DNA metylering og CT16 regulerte gener.
For å konkludere, har nyere fremskritt i utviklingen av medikamentell behandling mot avansert melanom førte til stort behov for å utvikle ny biomarkør for sykdomsutvikling. Vi har nylig foreslått at serumnivåene CT16 kunne brukes for å overvåke effekten av behandlingen og mulige tilbakefall. Her rapporterer vi at CT16 bidrar også til patogenesen av sykdommen ved å regulere både apoptotiske og antiapoptotic gener og fremme melanom celle overlevelse. Derfor er CT16 en antatt målmolekyl for legemiddelutvikling forsøkte å forsterke effekten av apoptose kallende legemidler.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
De kliniske studiene ble godkjent av den institusjonelle gjennomgang styret i Turku universitetssykehus, og hver pasient gitt skriftlig informert samtykke til å delta i studier og /eller for å tillate hans /vevsprøver hennes til å bli brukt til forskningsformål.
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og trans
De melanoma cellelinjer A2058, SK-MEL-2, og WM-266-4 opprinnelig hentet fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia) ble godkjent av Health Protection Agency Kultur samlinger (Porton Down, Storbritannia) ved hjelp STR analysemetode. De melanomcellelinjer ble holdt ved 5% CO
2 og 37 ° C i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA) tilsatt 10% føtalt bovint serum. Den CT16 cDNA inkludert stoppkodon ble klonet ved PCR fra uttrykket vektor for CT16 [16] og settes inn i
Xba
jeg og
Eco
RI områder av pEXPR-IBA103 plasmid (IBA GmbH, Göttingen, Tyskland). En mengde på 1 ug av den CT16 cDNA-inneholdende eller intakte (kontroll cDNA) pEXPR-IBA103 vektor ble transfektert inn i WM-266-4-celler ved anvendelse Fugene 6 transfeksjon reagens (Roche, Basel, Sveits) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter inkubering i 48 timer ble G418-resistente celler ble selektert ved 0,8 mg /ml G418 (Invitrogen). De stabilt transfekterte celler ble opprettholdt i medium inneholdende 0,2 mg /ml G418.
