Abstract
En høy kvalitet NMR løsning struktur presenteres for protein hMcl-1 (171-327) som omfatter rester 171-327 av humant anti-apoptotiske proteiner Mcl-en (hMcl-1) . Etter denne konstruksjon inneholder tre Bcl-2-homologi (BH) sekvensmotiver som deltar i å danne et bindingssete for inhibitorer av hMcl-1, blir det ansett for å være avgjørende for strukturbasert konstruksjon av nye anti-kreft medikamenter som blokkerer Mcl1 beslektet anti-apoptotiske reaksjonsvei. Mens koordinatene til et NMR løsning struktur for en tilsvarende konstruksjon av musen homolog (mMcl-1) er offentlig tilgjengelig, er vår struktur den første atom oppløsning struktur rapportert for «apo formen» av det humane proteinet. Sammenligning av de to strukturer viser at hMcl-1 (171-327) oppviser en noe bredere ligand /hemmer binding spor, så vel som et forskjellig ladningsfordeling innenfor BH3 bindingen sporet. Disse funnene tyder sterkt på at tilgjengeligheten av den menneskelige strukturen er av avgjørende betydning for å støtte fremtidige utformingen av kreftlegemidler
Citation. Liu G, Poppe L, Aoki K, Yamane H, Lewis J, Szyperski T (2014 ) Høy kvalitet NMR Structure of human antiapoptotisk Protein Domain Mcl-1 (171-327) for Cancer Drug design. PLoS ONE 9 (5): e96521. doi: 10,1371 /journal.pone.0096521
Redaktør: Annalisa Pastore, National Institute for Medical Research, Medical Research Council, London, Storbritannia
mottatt: 17. desember 2013, Godkjent: 08.04.2014; Publisert: 02.05.2014
Copyright: © 2014 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av Amgen Inc. (www.amgen.com). LP, KA, HY og JL er ansatte i Amgen Inc. og Amgen Inc. spilt en rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere og utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Denne studien var finansiert av Amgen Inc., men det er ingen konkurrerende interesse som kan skjevhet dette arbeidet. Denne tilknytningen endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
feil av mobilnettet apoptose [1] er et viktig kjennetegn på kreft. Regulering av apoptose avhengig av familien av Bcl-2-proteiner som inneholder en eller flere Bcl-2-homologi (BH) sekvensmotiver. Basert på deres funksjon og likheten av deres respektive BH sekvensmotiver kan disse proteinene grupperes i tre klasser [2], [3]: (i) med flere domener pro-apoptotiske proteiner som Bax og Bak, (ii) anti -apoptotic (dvs. pro-overlevelses) proteiner som Mcl-1, Bcl-1, Bcl-x
L, Bcl-w og Bfl-1 /A1, som alle oppviser en lignende arkitektur som Bax og Bak, og (iii) flere pro-apoptotiske proteiner som omfatter bare én BH3 sekvens motiv som Bud, Bad, Bim, Puma, Noxa, HRK, BMF, og Nbk /Bik ( «BH3-bare «proteiner). BH3 motivet av klasse (iii) proteiner danner en amfipatisk α-heliks som interagerer spesifikt med en hydrofob lomme dannet i både pro-apoptotiske klasse (i), og anti-apoptotiske klasse (ii) proteiner med deltakelse av de respektive BH motiver [ ,,,0],2], [3]. Inhibering av det resulterende protein-proteinkompleksdannelse har en lovende strategi for å behandle kreft. For eksempel, det lille molekyl Bcl-2 antagonist ABT-737 [4] inhiberer anti-apoptotiske klasse (ii) proteiner Bcl-x
L, Bcl-w og Bcl-1, og en kongener [5] som kan være oralt administrert er for tiden i kliniske studier.
den anti-apoptotiske, pro-overlevelse 350-rest protein Mcl-1 ( «myeloid celle leukemi-1») [2] er primært forankret i den ytre mitokondrielle membranen ved en C-terminal trans-membran domene og inneholder tre BH sekvensdomener: BH3 (rester 209-223), BH1 (252-272) og BH2 (restene 304-319) [2]. MCL-1 hemmer død reseptor-indusert apoptose ved selektiv binding til avkortet Bud (tBid) [6] og kan beslaglegge endogen Bak å blokkere Bak-mediert celledød. Videre Mcl-en samhandler med flere BH3-bare proteiner (Bim, Bud og Puma, Noxa og Bak). Derfor spiller Mcl-1 et tidlig rolle som reaksjon på signaler dirigere enten celleoverlevelse eller celledød [2], og har vist seg å være oppregulert i en rekke ondartede svulster. Går abrogere MCL-en anti-aptototic funksjon enten ved å redusere sin overflod eller ved å inaktivere sin funksjonelle BH3-bindende groove viser store løftet for kreftbehandling [2], [4], [6], [7]. Her presenterer vi høy kvalitet NMR løsning struktur av polypeptidet segmentet 171-327 av menneskelig Mcl-en (hMcl-1) som består av de tre BH motivene anses å være avgjørende for struktur basert drug design.
Resultater og diskusjon
En høy kvalitet NMR strukturen hMcl-1 (171-327) ble oppnådd (tabell 1) og koordinatene ble avsatt i PDB [8] (tiltredelse kode 2mhs). Strukturen består av syv α-helikser α1-α7 (rester 173-191, 204-235, 240-253, 262-280, 284-301, 303-308 og 311-319) arrangert for å danne karakteristiske «BCL-2 kjerne «struktur [9] (Figur 1). Spiralene er lokalt og globalt veldefinert, mens den C-terminale (restene 320-327) og løkker som forbinder henholdsvis heliksene α1 og α2, heliksene α3 og α4, og heliksene α4 og α5 er fleksibelt uoversiktlig. Den sentrale helix α4 er omgitt av de seks andre helikser, med α1, α2, α3 og α5 pakket rundt den ene siden, og α6 og α7 pakket mot sin N-terminal. Helikser α2, α3, α4 og α7 delta i utformingen av BH3 bindende groove. Den elektrostatiske protein overflaten potensial er positiv i begge ender av BH3 bindings sporet (på grunn av tilstedeværelsen av Arg 233, Lys 234, Arg 248 og Arg 263) og negativ på siden av heliksen α3 side (på grunn av Asp 256) (figur 2). Dette viser at ladningsfordeling i BH3 bindende sporet av hMcl-1 (171-327) skiller seg klart fra andre anti-apoptotiske proteiner [10].
(A) ryggraden i de 20 Cyana konformasjoner representerer løsningen strukturen av hMcl-1 (171-327) etter overlagring av ryggraden N, C
α og C «atomene i a-helikser for minimalt rmsd. De tre BH sekvensmotiver er farget i grønt (BH3), rød (BH1) og blå (BH2), henholdsvis. (B) Ribbon tegning av de laveste energi konformer av hMcl-1 (171-327). α-helikser α1-α7 er merket og farget annerledes, og N- og C-endene er merket som «
N «
» og «
C»
«. Tallene ble generert ved hjelp av programmene molmol [36] og PYMOL [37].
(A) For human hMcl-1 (171-327) i retningen vist i figur 1 (venstre) og etter dreining 180 ° om den loddrette akse (til høyre). Overflate farger (blått for positivt ladet, rødt for negativt ladet) indikerte elektropotensialet beregnes ved hjelp PYMOL [37] og standard vakuum elektrostatikk protokollen. (B) Samme som i (A), men for mus mMcl-1 (152-308).
Bilder
inkludert våre hMcl-1 (171-327) struktur, tjue atom oppløsning strukturer som inneholder forskjellige Mcl-1 konstruksjoner er nå deponert i PDB. I tillegg til de to «apo «proteiner hMcl-1 (171-327) og mus mMcl-1 (152-308) [10] [PDB tiltredelse kode 1wsx, 89% sekvensidentitet med det humane protein], strukturene for nitten protein-ligand-kompleksene ble deponert (tabell 2) [9], [11] – [18]. Klart, det store antallet tilgjengelige strukturer reflekterer høy interesse for Mcl-en som et mål for utvikling av nye kreftmedisiner. Superposisjon av a-helikser avslører, som forventet, nær strukturell likhet for alle Mcl-1 proteiner strukturer (figur 3): root mean square avvik (rmsd) verdier varierer 1,05 til 1,54 Å forhold til hMcl1-1 (171-327 ) (tabell 2). Imidlertid sammenligning av de to apo proteinstrukturer av hMcl-1 (171-327) og mMcl-1 (152-308) ved hjelp av komplekse strukturer viser at bindingen lommen er utvidet ved kompleks-dannelse (tabell 2): avstandene mellom C
α-atom rester His 224 i heliks α2 (His 205 i mMcl-1) og His 252 (His 233 i mMcl-1) ved den C-terminale ende av heliks α3 er henholdsvis ~16 Å og ~ 14 Å i hMcl-1 (171-327) og mMcl-1 (152-308), og ~18-21 Å i kompleksene.
(A) Komposisjoner av hMcl-1 (171-327) (grønn) og mMcl-1 (152-308) (cyan, PDB tiltredelse kode 1wsx) etter overlagring av ryggraden N, C
α og C «atomene i a-helikser for minimalt rmsd. (B) Ribbon tegning (zoomet inn i (A)) viser de forskjellige bindingssporbreddene av human (grønn) og mus (cyan) protein. Avstandene mellom Cα-atomer av rester Hans 224 i helix α2 (Hans 205 i mMcl-1) og hans 252 (Hans 233 i mMcl-1) på C-terminalen av helix α3 er uthevet: ~16 Å i hMcl- 1 (171-327) og ~14 Å mMcl-1 (152-308) (C) overleiring som i (A) av hMcl-1 (171-327) (grønn) og mMcl-1 (152-308) (cyan , 1wsx), og seks utvalgte MCL-1 komplekse strukturer (se også tabell 2): human Mcl-en kompleks med Bim BH3 (magenta, 2nla); kimære rotte-menneske rMcl-1 (171-208) hMcl-1 (209-327) kompleks med musen mNoxaB BH3 (gul, 2rod); mus mMcl-1 (152-308) kompleks med musen NoxaA BH3 (rosa, 2roc); mus mMcl-1 (152-308) kompleks med musen Puma BH3 (grå, 2jm6); mus mMcl-1 (152-308) kompleks med musen NoxaB BH3 (lilla, 2rod); kimære rotte-menneske mMcl-1 (171-208) hMcl-1 (209-327) kompleks med humant Bim BH3 (orange, 2nl9); kimære rotte-menneske mMcl-1 (171-208) hMcl-1 (209-327) kompleks med humant Bim BH3 (L62A, F68A) (lys grønn, 3d7v) .De tallene ble utarbeidet med programmene molmol [36] og PYMOL [37].
det faktum at det humane apo-protein oppviser en noe bredere spor enn bindingsmusehomologen (tabell 2) kan være, i det minste delvis tilskrives sidekjeden av Leu 246 i det humane proteinet som ikke er begravet så dypt som den tilsvarende Phe-sidekjeden i den museprotein. Videre, når man sammenligner de humane og museprotein, blir forskjeller observert for ladningsfordelingene i BH3-bindende spor (figur 2): det humane proteinet er negativt ladet på siden av heliksen α3, mens den tilsvarende flate av museprotein er positivt ladet. Denne forskjellen oppstår Ser 255 tilsvarer Lys 236 i musen protein. Bemerkelsesverdig, hMcl-1 (171-327) er strukturelt mer lik den hMcl1 (171-327) -hBim BH3 kompleks (figur 3) enn til apo mMcl-1 (152-308) (tabell 2).
til sammen strukturelle sammenligninger viser at, til tross for den 89% sekvensidentitet mellom humane og museprotein, kan tilgjengeligheten av den humane hMcl-1 (171-327) struktur kan forventes å være av avgjørende betydning for å støtte fremtidige utformingen av kreftlegemidler.
Materialer og metoder
NMR Prøvepreparering
Foreløpige undersøkelser viste at hMcl-1 (171-327) (UniProtKB /Swiss-Prot ID Q07820 /MCL1_HUMAN ) er ikke stabilt i løsning. Imidlertid mutanten Cys 286 Ser → er stabil i flere uker ved konsentrasjoner ~0.7 mM, og både villtype og mutant bind BIM-BH3 peptid med den samme affinitet (K
d ~ 60 pM) i en Biacore-analyse . Derfor løste vi NMR strukturen hMcl-1 (171-327) Cys 286 → Ser referert til som hMcl-1 (171-327) i denne publikasjonen.
hMcl-1 (171-327) ble klonet, uttrykt, refolded og renses etter standardprotokoller for å produsere et jevnt
13C,
15N-merket protein prøven [19]. I korte trekk, ble genet klonet inn i en pET21d (Novagen) derivat som ga plasmid pSR482-21.1. Den resulterende konstruksjon inneholder syv nonnative rester ved den C-terminale ende (LHHHHHH) for å lette proteinrensing.
Escherichia coli
BL21 (DE3) pMGK-celler, en kodon forbedret stamme, ble transformert med pMcl1-21.1, og dyrket i MJ9 minimalmedium [20] inneholdende (
15NH
4)
2SO
4 og
U Anmeldelser –
13C-glukose som eneste nitrogen og karbonkilder. Dobbelte vasket inklusjonslegemer inneholdende hMcl-1 (171-327) ble oppløst i 8 M bufret guanidinhydroklorid (VWR) inneholdende 5 mM DTT, langsomt fortynnet i ni volumer av 20 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 0,5 M urea, 10% glycerol, pH 7,4, og foldet på nytt i løpet av 72 timer ved 4 ° C. hMcl-1 (171-327) ble renset ved hjelp av en Talon affinitet harpiks (Clontech) brukes på en HiTrap SP High Performance kolonne (GE Healthcare). Det endelige utbytte av renset
U
–
13C,
15N protein (mer enn 98% homogent ved hjelp av SDS-PAGE, 20,3 kDa ved MALDI-TOF massespektrometri) var ~ 25 mg /l. I tillegg er en
U
–
15N og 5% biosyntetisk rettet fraksjonert
13C-merket prøven [21] ble generert for stereospesifikk tilordningen av isopropyl metylgrupper. NMR-prøver ble fremstilt ved 0,7 mM proteinkonsentrasjon. En isotropisk totale rotasjonskorrelasjonstiden ~ 10 ns ble utledet fra
15N spin avslapping ganger indikerer at hMcl-1 (171-327) er monomere i løsningen.
NMR-spektroskopi
NMR spektra ble registrert ved 25 ° C. Fem G-matrise Fourier transform (GFT) NMR eksperimenter [22], [23] og en samtidig 3D
15N /
13C
alifatiske /
13C
aromatisk-løst NOESY [24] [25] spektrum (blandetiden 60 ms, måling tid: 48 timer) ble ervervet på en Varian INOVA 750 MHz spektrometer utstyrt med en konvensjonell sonde. 2D konstant-tid [
13C,
1 H] -HSQC spektra (18 timer) ble registrert for 5% biosyntetisk rettet fractionally
13C-merket prøven på en Varian INOVA 600 MHz spektrometer utstyrt med en kryogenisk sonde som beskrevet [21], [26]. Spectra ble behandlet og analysert ved hjelp av programmer NMRPipe [27] og XEASY [28].
Sekvens spesifikk ryggraden (H
N, H
α, N, C
α) og H
β /C
beta resonans oppdrag ble oppnådd ved å bruke (4,3) D HNNC
αβC
α (63 timer) /(4,3) DC
αβC
α (CO) NHN (62 timer), og (4,3) DH
αβC
αβ (CO) NHN (69 timer) [23] sammen med programmet AUTOASSIGN [29]. Mer perifere sidekjede kjemiske skift ble tildelt med alifatiske (4,3) D HCCH (87 timer) [23] og 3D
15N /
13C
alifatiske /
13C
aromatisk-løst [
1 H,
1 H] -NOESY [24], [25]. Alt i alt, bestemmelsen ble erholdt i 96% av ryggraden og
1 H
β /
13C
p resonans og for 93% av de sidekjede-resonanser som er overdras med NMR-eksperimentene som er nevnt ovenfor (med unntak av N-terminal NH
3
+, Pro
15N,
13C «foregående Prolyl- rester, Lys NH
3
+, Arg NH
2, OH, sidekjede
13C «og aromatisk
13C
γ). Videre har 100% /100% av Val og Leu isopropyl-molekyldeler med ikke-degenererte proton-kjemiske skift ble stereo-spesifikt tilordnet (tabell 1). Kjemiske skift ble avsatt i BioMagResBank [30] (tiltredelse kode 19654).
1H
1 H øvre avstandsgrense begrensninger for strukturberegninger ble hentet fra NOESY (tabell 1). I tillegg ble ryggrad dieder vinkelbegrensninger som stammer fra kjemiske skift ved hjelp av programmet TALOS [31] for rester som befinner seg i veldefinerte sekundære strukturelementer (tabell 1). Den programmer Cyana [32], [33] og AUTOSTRUCTURE [34] ble brukt parallelt å tildele langtrekkende Noes [24]. De endelige struktur Beregningene er utført ved hjelp av Cyana fulgt av eksplisitt vannbad raffinement bruker programmet CNS [35].
Takk
Vi takker Dr. Janet Cheetham for den verdifulle forslag å vurdere C286S mutant av hMcl-1 (171-327) for NMR strukturbestemmelse.
