Abstract
Bakgrunn og Aim
Kalsium er foreslått som en formidler av chemoprevention av tykktarmskreft (CRC), men den omfattende mekanismen bak denne forebyggende effekten er ennå ikke klart. Derfor gjennomførte vi denne studien å evaluere mulige roller og mekanismer for kalsium-mediert forebygging av CRC indusert av 1,2-dimetylhydrazin (DMH) hos mus.
Metoder
For genekspresjonsanalyser , 6 ikke-tumor kolorektal vev av mus fra DMH + Calcium gruppe og 3 prøver hver fra DMH og kontrollgruppene ble hybridisert på en 4 × 44 K Agilent hele genomet oligo microarray, og utvalgte gener ble validert ved real-time polymerase chain reaksjon (PCR). Funksjonell analyse av microarray data ble utført ved hjelp KEGG og Gene ontologi (GO) analyser. Hub gener ble identifisert ved hjelp av Pathway Studio.
Resultater
De kreftforekomst i DMH og DMH + Kalsium gruppene var 90% og 40%, henholdsvis. Microarray gene expression analyse viste at
S100a9
,
Defa20
,
Mmp10
,
Mmp7
,
Ptgs2
, og
Ang2
var blant de mest downregulated gener, mens
Per3
,
Tef
,
Rnf152
, og
Prdx6
var signifikant oppregulert i DMH + Kalsium gruppen sammenlignet med DMH-gruppen. Funksjonell analyse viste at Wnt, cellesyklus, og arakidonsyre-trasé var signifikant nedregulert i DMH + Kalsium gruppe, og at GO termer relatert til celledifferensiering, cellesyklus, proliferasjon, celledød, adhesjon, og cellevandring ble signifikant påvirket .
gaffelhodeboks M1 product: (
FoxM1
) og
nukleær faktor kappa-B product: (
NF-kB
) ble betraktet som potente hub gener.
Konklusjon
i DMH-indusert CRC musemodell, ble omfattende mekanismer involvert med komplekse genuttrykk endringer som omfatter mange endret trasé og GO vilkår. Men hvor kalsium regulerer disse hendelsene gjenstår å bli studert
relasjon:. Wang J-L, Lin Y-W, Chen H-M, Kong X, Xiong H, N Shen, et al. (2011) Kalsium Hindrer tumorigenesis i en musemodell for tykktarmskreft. PLoS ONE 6 (8): e22566. doi: 10,1371 /journal.pone.0022566
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA
mottatt: 13 november 2010; Godkjent: 29 juni 2011; Publisert: 17 august 2011
Copyright: © 2011 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra Ministry of Public Health, Kina (nr 200 802 094), et stipend fra National Science funnet of China (30830055) til Jing-Yuan Fang; og et stipend fra Natural Science Foundation National of China (No: 30900757) til Hua Xiong. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Den nåværende forekomst av tykktarmskreft (CRC) er høy, og dens prognose forblir fattige [1]; Derfor er det viktig å tenke ut strategier for å forebygge utvikling av CRC. Mange midler anvendes for å forhindre CRC [2]; Det er imidlertid ingen konsistens i effektene på tvers av midler [3], [4], [5], og noen midler kan føre til alvorlige bivirkninger, [6], [7]. Således er nødvendig for å forebygge CRC en alternativ tilnærming.
En fersk systemisk gjennomgangen viste at kalsium kan være mer attraktiv i forebygging av CRC sammenlignet med aspirin og screening [8]. Imidlertid er effektiviteten av kalsium fremdeles usikker. Samlede funn av 10 kohortstudier viste en omvendt sammenheng mellom inntak av kalsium og CRC risiko [9], men dette forholdet ble ikke bekreftet av en randomisert kontrollert klinisk studie [10]. Men på grunn av begrensninger i den randomiserte kontroll studie (RCT), for eksempel lav dose av kalsium, kort lengde på oppfølging og påvirkning av østrogen inntak [11], er konklusjonen fra RCT var ikke overbevisende. Ikke desto mindre, effektiviteten av kalsium på forebygging av CRC fremdeles kontroversiell [12].
På samme måte er mekanismen for kalsium-mediert forebygging av CRC ikke ennå klart. I tidligere studier, ble kalsium antatt å redusere risikoen for CRC ved binding til toksiske sekundære gallesyrer og danner uoppløselige såper i hulrommet i tykktarmen [13], eller ved å redusere proliferasjon, stimulerer differensiering, og indusering av apoptose i kolon mukosa [ ,,,0],14], [15]. En fersk studie antydet at kalsium kan oppheve hyperplasi i distal kolon ved å hemme en kalsium kanal reseptor, dvs. transient receptor potensielle kanal, underfamilien V, del 6 (TRPV6) [16]. Disse funnene tyder på at kalsium kan redusere risikoen for CRC gjennom en rekke mekanismer, men den spesifikke og omfattende mekanisme er ennå ikke klart. Derfor gjennomførte vi denne studien å evaluere mulige roller og mekanismer for kalsium-mediert forebygging av CRC indusert av 1,2-dimetylhydrazin (DMH) i mus. Vi tror at våre funn vil bidra til forskning på klinisk anvendelse av kalsium.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Vår studie ble godkjent av Animal Care og bruk komiteen av Shanghai Jiao Tong University School of Medicine Renji Hospital, Shanghai, Kina. Alle dyr prosedyrer ble utført i henhold til retningslinjer utarbeidet av China Council on Animal Care og protokollen godkjent av Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Renji Hospital, Shanghai, Kina.
Kjemi
DMH ble hentet fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA). Normal og høy kalsium feed for mus ble oppnådd fra Shanghai SLAC Forsøksdyr Company (Shanghai, Kina). Hovedkomponentene i den normale og høye kalsiumstrømmen var de samme: protein, 22,1%; fett, 5,28%; ask, 5,2%; fiber, 4,12%; nitrogen-fri ekstrakt, 52%; fosfor, 0,92%; og vitamin D3 6818,4 IE /kg. Konsentrasjonen av kalsium (i form av kalsiumkarbonat) i normal og høy kalsiumstrømmen var 1,24% og 3,0%, respektivt. Den høye kalsiumstrømmen ble justert ved tilsetning av kalsiumkarbonat for å oppnå en endelig kalsiuminnhold på 3%. Fordi vi tror at den kontroversielle effektiviteten av høy kalsium diett på forebygging av CRC kan være delvis på grunn av liten dose av kalsium i tidligere studier, så vi bestemte oss for å bruke høyere kalsiuminnhold for å teste den eksakte forebyggende effekt av CRC og mus toleranse .
Forsøksdyr
I alt 80 kvinnelige SLAC: ICR mus [vekt, 18-20 g; klasse, spesifikke patogen-fri (SPF)] ble kjøpt fra den kinesiske Academy of Sciences (Shanghai, Kina). De ble holdt ved romtemperatur (22 ° C) med en relativ fuktighet på 60% og 12-timers lys /mørke sykluser; de ble levert en standard laboratorium diett og drikkevann. Musene ble tilfeldig delt inn i 4 grupper (20 mus i hver gruppe): kontrollgruppen, DMH gruppe, DMH + Kalsium gruppe, og kalsium gruppe. Musene i kontrollgruppen ble gitt normal fôr og fikk subkutane injeksjoner av fysiologisk saltvann; de av DMH gruppe ble gitt normal mate og fikk subkutan injeksjon av DMH i en dose på 20 mg /kg en gang ukentlig i 20 uker; de av DMH + Kalsium gruppe ble gitt høy kalsiumstrømmen og fikk subkutan injeksjon av DMH i en dose på 20 mg /kg en gang ukentlig i 20 uker; de av kalsium gruppe ble gitt høy kalsiumstrømmen og mottok subkutane injeksjoner av vanlig saltvann. Musene ble avlivet ved slutten av 24 uker, og forekomsten av CRC i hver gruppe ble undersøkt. Denne fremgangsmåten er beskrevet i detalj i vårt tidligere studium [17]. I korte trekk, ble langsgående snitt gjort i kolorektal vev å observere antall brutto svulster. Etter at deretter, ble de grove tumorene fjernet separat og full-tykkelse colorectal vev ble kappede i halvparten av den langsgående aksen. Noen av de nylig oppnådde tumorprøver sammen med sin halvdel tilsvarende ikke-tumor kolorektale Vevene ble frosset umiddelbart i flytende nitrogen. De resterende prøvene ble fiksert i formalin løsning og innebygd i parafinblokker for patologisk analyse og immunhistokjemi.
Histologisk analyse
For histologiske analyser, 4-mikrometer tykke deler av formalinfiksert, parafin- innebygde colontumorer var forberedt. Etter hematoxylin og eosin-farging, ble deler av hver tumor undersøkt under et lysmikroskop (Olympus, Japan). Resultatene ble bekreftet av patologen Chen XY.
RNA ekstraksjon, merking, hybridisering, og analyse
Total RNA fra 12 ikke-tumor kolorektal vev [3 fra kontrollgruppen, tre fra DMH gruppe, 6 fra DMH + Kalsium gruppe (blant de seks fra DMH + Calcium gruppe, tre var fra mus med svulster og tre var fra mus uten svulster)] ble høstet ved hjelp TRIzol (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA-innholdet ble målt ved anvendelse av et Nanodrop ND-1000 spektrofotometer, og denaturerende gelelektroforese ble gjennomført. Deretter ble prøvene forsterket, merket med Agilent Hurtig Amp merking kit, og hybridisert med Agilent hele genomet oligo mikromatriser (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) ved hjelp av Agilent SureHyb hybridisering kamre. Etter hybridisering og vasking ble behandlet lysbilder skannes med Agilent DNA microarray scanner med innstillingene anbefalt av Agilent Technologies.
De resulterende tekstfiler hentet fra Agilent Feature Extraction programvare (versjon 10.5.1.1) ble importert til Agilent GeneSpring GX-programvaren (versjon 11.0) for videre analyse. Bakgrunn intensitet har blitt kuttet av før normalisering. Microarray datasettene ble normalisert i GeneSpring GX hjelp av Agilent FE én farge scenario (hovedsakelig median normalisering). Differensielt uttrykte gener ble identifisert ved å bestemme fold-endring (FC) og p-verdiene av
t
-test. Gener med en FC av ≥1.5 og en p-verdi på ≤0.05 mellom to grupper ble identifisert som differensielt uttrykte gener. Funksjonell analyse av forskjellig uttrykte gener ble utført ved hjelp av Gene ontologi (GO) (https://www.geneontology.gov/) [18] og KEGG PATHWAY Database (https://www.genome.jp/kegg/pathway. html). Hub gener ble identifisert ved hjelp av Pathway Studio (Ariadne Genomics) [19].
Sanntids polymerase chain reaction
Revers transkripsjon ble utført ved hjelp av oligo (DT) primere og hevet II revers transkriptase (Takara ). Kvantifisering av gen-ekspresjon ble utført ved anvendelse av en sanntids-polymerase kjedereaksjon (PCR) sett (Takara). Ekspresjonsnivået av 18 s-rRNA ble anvendt som en intern kontroll. Uttrykket av følgende gener ble analysert:
S100a9
,
Defa20
,
Mmp10
,
Ptgs2
,
Per3
,
Tef
,
Rnf152
, og
Prdx6
. Primerne er oppført i tabell 1.
Immunohistochemistry
Fire-mikrometer tykke deler av formalinfiksert, parafininnstøpte ikke-tumor kolon vev ble deparaffinized og vannes ut. Den mikrobølgereparasjonsmetode ble brukt for innhenting av antigen. Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert ved inkubering av seksjoner med 0,3% hydrogenperoksid i 10 minutter. Ikke-spesifikk antigen ble blokkert ved inkubering av seksjoner med saueserum i 30 min. Platene ble inkubert over natten ved 4 ° C i et fuktet kammer med kanin monoklonalt anti-β-catenin (Cell Signaling Technology, # 9562) ved en fortynning på 1:200. Anti-kanin-IgG ble anvendt som sekundært antistoff (30 min inkubasjon). Diaminobenzidin ble brukt som kromogen, og seksjonene ble motfarget med hematoksylin. Prøvene inkubert med PBS istedenfor primært antistoff ble brukt som negative kontroller.
Statistisk analyse
Resultatene av dyreforsøk og real-time PCR ble analysert ved hjelp av SAS 9.2-programvare (SAS Institute Inc. USA). Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. Elevens
t
-test ble brukt for å sammenligne verdier mellom 2 uavhengige grupper.
Resultater
Dyreforsøk
De viktigste resultatene av dyreforsøk vist i figur 1. Vi har med hell indusert i mus ved bruk av CRC DMH (figur 1A). De fleste av kreft ble identifisert som adenokarsinomer av histologisk analyse (figur 1B, 1C). I DMH og DMH + kalsium-grupper, svulsten var forekomsten 90% og 40% (figur 1D), det midlere antall tumorer pr mus var 5,39 ± 1,97 og 3,0 ± 1,31 (figur 1E), og gjennomsnittlig maksimal diameter av tumorene var 6,44 ± 1,72 og 2,63 ± 1,19 (figur 1F), respektivt. Ingen svulst ble funnet i Kontroll og kalsium grupper. Vekst og utvikling av mus i Calcium gruppen ble ikke signifikant påvirket, og patologisk undersøkelse av sine nyrer, hjerte, lunger, lever og milt viste ingen åpenbare forandringer (data ikke vist).
A.
Observasjon av svulster i tykktarmen hos mus etter avliving ved 24 uker.
B product: (x 200) og
C product: (x 400). De fleste av tumorene ble bekreftet som adenokarsinomer av patologisk undersøkelse.
D
. Tumor forekomst blant de 4 grupper.
E
. Tumor Antall /mus mellom de 4 gruppene.
F
. Maksimal svulst diameter mellom 4 grupper (Control: Kontrollgruppen fikk vanlig fôr og injeksjon av normal natrium i 20 uker, DMH: DMH gruppe, fikk normal fôr og injeksjon av DMH i 20 uker, DMH + Kalsium gruppe: fått høy-kalsium mate og injeksjon av DMH i 20 uker, kalsium gruppe: fått høy-kalsium feed og injeksjon av normal natrium i 20 uker). *
P
verdi. 0,05 mellom DMH + Kalsium gruppe og DMH gruppe
Gene uttrykk profil ved microarray analyse
Alle 12 colonic vev ryddet kvalitetskontroll trinnet og ble analysert som beskrevet i metodedelen. Den microarray analyse ble utført mellom kontrollgruppen (3 prøver), DMH gruppe (3 prøver), og DMH + Calcium gruppe (6 prøver). Vi har også sammenlignet genuttrykk nivåer mellom prøvene med eller uten svulster blant DMH + Calcium gruppe.
hierarkisk clustering analyse av de 12 rekke uttrykk data viste en homogen uttrykk profil blant de prøver av hver gruppe (Figur S1 ). Ved å sette filteret for FC til ± 1,5 og p-verdi på ≤0.05, fant vi at uttrykket av 12395 gener ble vesentlig endret i DMH gruppen sammenlignet med de i kontrollgruppen (se tabell S1), og at av 1508 gener ble betydelig endret i DMH + Kalsium-gruppen sammenlignet med de i DMH-gruppen (se tabell S2). Sammenlignet med tabell S1 og tabell S2, fant vi at uttrykket av 549 gener som endringer på grunn av DMH behandling kan bli reversert av kalsium (se tabell S3). I tabell 2 er de 30 mest differensielt uttrykte gener vist, de fleste som er nært knyttet til tumorigenesis, slik som
S100a9 plakater (S100 kalsium-bindende protein A9 [calgranulin B]),
Defa20
(defensin alpha 20),
Mmp10 plakater (matriksmetalloproteinase 10),
Ang2 plakater (angiogenin, ribonuklease En familie, medlem 2),
Per3 plakater (periode homolog 3)
Tef plakater (thyrotroph embryonale faktor), og
Ptgs2 plakater (prostaglandin-endoperoxide syntase 2). For de 8 utvalgte gener, dvs.
S100a9
,
Defa20
,
Mmp10
,
Ptgs2
,
Per3
,
Tef
,
Rnf152
, og
Prdx6
, resultatene oppnådd fra microarray analyse ble bekreftet ved real-time PCR (figur 2). Vi valgte disse genene for PCR bekreftelse fordi de er nært knyttet til tumorigenesis og verdt videre forskning.
Vi brukte 18 s rRNA som en intern kontroll. Relative mRNA-ekspresjon ble beregnet i henhold til den 2
-ΔΔT metode. Dataene er gjennomsnittet av 10 prøver ± SD. Kontroll, genekspresjon nivå i normal tykktarm vev fra mus i kontrollgruppen; DMH, genekspresjon nivå i den ikke-tumor colon vev av mus i DMH-gruppe; DMH + Kalsium, genekspresjon nivå i den ikke-tumor colon vev av mus i DMH + Kalsium-gruppe; Kalsium, genekspresjon i den ikke-tumor colon vev av mus i gruppen kalsium. *
P
verdi 0,05 mellom DMH + Kalsium gruppe og DMH gruppe; §
P
verdi. 0,05 mellom Kalsium gruppe og en kontrollgruppe
For å finne ut av hvilke biologiske mekanismer eller funksjonelle genet grupper ble ulikt påvirket av høy kalsium diett, vi analysert vår microarray datasett (på basis av resultatene vist i Tabell S3) ved hjelp av GO og KEGG programvare. De detaljerte resultatene er vist i tabell S4 og S5 Tabell. Ved å sette p-verdi på ≤0.05, fant vi betydelig nedregulering av 39 signalveier, inkludert noen tumor-relaterte reaksjonsveier slik som cellesyklusen vei, Wnt signalveien, vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) signalveien, og transformerende vekstfaktor ( TGF-β) signalveien. De anrikede reaksjonsveier er vist i tabell 3. Vi brukte immunhistokjemi for å påvise proteinekspresjon og fordeling av β-catenin, kjernen molekyl i Wnt reaksjonsveien, og funnet ut at dets ekspresjon var signifikant høyere i ikke-tumor kolon mukosa fra DMH gruppe enn i den fra kontrollgruppen, men dens ekspresjon i DMH + Kalsium-gruppen ble betydelig redusert sammenlignet med DMH-gruppen (figur 3). Til sammen 703 GO vilkår, inkludert kreftrelaterte GO begreper som celledifferensiering, celleproliferasjon, apoptose, angiogenese, celle adhesjon, cellesyklus, og celledeling, ble vesentlig endret
Control, kontrollgruppe.; DMH, DMH gruppe; DMH + Kalsium, DMH + Calcium gruppe; Kalsium, kalsium gruppe.
Vi har også brukt Pathway Studio programvare for å filtrere hub gener som kan spille viktige roller i kalsium-mediert forebygging av CRC (tabell 4). Av disse, ble 2-genene valgt for å konstruere gene nettverk (figur 4). På grunnlag av nettverkene, kunne vi klart å bestemme kjerneroller av navet genene
De differensielt uttrykte gener reguleres av de 2 hub gener (A,
FoxM1
, b.,
NF-kB
) vises i form av et nettverksdiagram. Grønne eller røde fargestoffer, sekvenser som er nedregulert eller oppregulert i den DMH + Kalsium gruppen sammenlignet med DMH-gruppe, respektivt. Intensiteten av fargen er proporsjonal med graden av endring.
I tillegg har vi ytterligere i forhold genuttrykket nivåer mellom musene fra DMH + Calcium gruppe med /uten svulster og funnet at genuttrykk nivåene av de fleste av de ovennevnte utvalgte gener hos mus fra DMH + Kalsium gruppe med tumorer var mellom de fra DMH + Kalsium gruppe uten tumorer og de fra DMH-gruppen (se tabell S6 og fig S1). Vi fant også at uttrykket av noen kalsium transportører var annerledes blant musene fra DMH + Calcium gruppe med /uten svulster. For eksempel ble det uttrykk for Trpv6 og Trpv3 betydelig oppregulert i mus fra DMH + Calcium gruppe med svulster sammenlignet med de uten svulster; imidlertid uttrykk for plasmalemmal Ca
2 + -ATPase (PMCA) ble signifikant nedregulert.
Diskusjoner
I denne studien brukte vi DMH-indusert CRC musemodell som viser fenotypisk og genotypiske funksjoner som ligner på de som ble observert i humane sporadiske CRC og således kan brukes til å studere forebygging av CRC [20]. I denne studien har vi funnet at forekomsten av CRC sunket betraktelig i mus matet en høy kalsium diett, noe som indikerer en klar rolle kalsium i forebygging av CRC. Våre resultater er konsistente med mange andre studier. Pence [21] har funnet at rotter på den høye kalsium diett ha en redusert forekomst CRC sammenlignet med lavt kalsiumdiett (86% vs. 53%), Salas [22] også observert en signifikant reduksjon i antall tumorer og en reduksjon i CRC forekomst i gruppen matet høy kalsium diett (97% vs. 64%). Imidlertid har enkelte studier observert ulike utfall. Sitrin [23] fant at verken kalsiumtilskudd alene eller tilskudd av kalsium sammen med vitamin D-mangel endret forekomsten av CRC indusert av DMH, Mølck [24] selv funnet en økt forekomst i rotter fôret høy kalsium diett. Vi tror at forskjellene i dyret stamme, dyr alder, stell miljø, basis diett, DMH doser og varighet av injeksjonen, kalsiumkonsentrasjon, kalsium inngrep tid kan tas hensyn til forskjellene i resultatene av forskjellige studier med høy kalsium. Den bekreftet forebyggende effekten av CRC med høyt kalsium kosthold kan ennå ikke være inneholdt fra disse studiene. Vi tror det er kan være på grunn av små doser av kalsium i disse studiene. Slik at vi brukte høyere kalsiuminnhold (3%) i tilførselen for å teste den forebyggende effekt av CRC og musene toleranse. Faktisk viste dette høyt kalsium-feed god forebyggende effekt av CRC i vårt eksperiment og ingen åpenbare negative effekter ble funnet hos mus. I tillegg ble ingen svulst funnet i kalsium grupper. Vekst og utvikling av mus i Calcium gruppen ble ikke signifikant påvirket, og patologisk undersøkelse av sine nyrer, hjerte, lunger, lever og milt viste ingen åpenbare forandringer, uttrykk for de fleste av de utvalgte gener bekreftet av real-time PCR i Calcium gruppen var lik den i kontrollgruppen. Disse funnene tyder på at denne høye kalsium diett er trygt for mus.
Deretter brukte vi microarray gene expression profil analyse for å fastslå mekanismen av kalsium-mediert forebygging av CRC. Så langt vi kjenner til, er dette den første undersøkelsen å bruke microarray teknologi for å studere rollen høy kalsium diett i forebygging av CRC.
Når FC ble satt til ≥1.5, endringene i 549 gener som var et resultat av DMH behandling kan bli reversert med kalsium.
S100a9
er den mest downregulated genet; produkt er en cytoplasma Ca
2 + -binding protein. Selv ekstracellulære S100a9 kan indusere apoptose ved å binde seg til en foreløpig ukjent reseptor og årsaken dimerisering av Bax og Bak og deres trans til mitokondriene fører til mitokondriell skade [25], kan dens uttrykk i epitelceller faktisk induserer celleproliferasjon ved å aktivere phosphoinositide 3- -kinase (PI3K) -Akt-NF-kB overlevelsesreaksjonsveien, som er forbundet med tumorgenese [26]. I tillegg er S100a9 et viktig proinflammatorisk cytokin som er involvert i medfødt immunitet, og dens ekspresjon ble funnet å være forhøyet i tallrike patologiske tilstander assosiert med inflammasjon [27]. Mange andre inflammatoriske cytokiner, som Defa, ble også signifikant nedregulert [medlemmer av defensin familien ble nedregulert på ulike nivåer:
Defa-RS2 plakater (FC = -9,88),
Defa20 plakater (FC = -8,16)]. Tumornekrosefaktor (
Tnf
) og dets reseptorer ble også downregulated på ulike nivåer:
Tnf plakater (FC = -1,87),
Tnfrsf11b plakater (FC = -5,98),
Tnfrsf19 plakater (FC = -2,27). Flere andre studier utført ved hjelp av DMH eller azoxymethane (AOM) indusert CRC modell også funnet høye uttrykk nivåer av S100a9 og Defa i tumorvev [28], [29]. Inflammatoriske cytokiner spiller viktige roller i det medfødte og adaptive immunitet; imidlertid blir disse forhøyede cytokiner involvert i tumor initiering, markedsføring, og invasjon [30], [31], [32], [33], og således spiller en viktig rolle i inflammasjon assosierte karsinogenese [34].
MMP er en familie på matriksmetalloproteinaser som kan spille viktige roller i svulsten mikromiljøet [35]. Mange medlemmer av MMP familien var signifikant nedregulert i DMH + Calcium gruppe [
MMP10 plakater (FC = -9,47),
MMP13 plakater (FC = -9,1),
MMP7
(FC = -7,07), og
MMP11 plakater (FC = -1,56)]. Andre metalloproteinaser ble også nedregulert, slik som
Adam8 Hotell og
Adam10
, som ble nedregulert ved 2,08 og 1,6 ganger, henholdsvis. Nyere studier har vist at mange medlemmer av MMP og ADAM familien kan spille ulike roller i tumorigenesis. For eksempel
MMP7
kunne kløyve Fas ligand, og dermed redusere effekten av kjemoterapi på svulsten ved abrogere apoptose [36].
Adam10
kan utløse frigjøring av løselige epidermal vekstfaktor (EGF), megle utgytelsen av E-cadherin, translocating β-catenin til kjernen, og dermed kjører celleproliferasjon [37]. Imidlertid er den viktigste rolle av medlemmer av MMP og ADAM familie fremme tumorinvasjon og metastaser ved nedbrytning av ekstracellulær matriks [38], [39]. Disse funnene tyder på at et høyt kalsium diett kan spille en viktig rolle ved inhibering av invasjon og metastaser av CRC. Fordi
in vitro
studier viste at, i CRC-celler, E-cadherin ekspresjon kan bli indusert ved å øke den ekstracellulære Ca
2+ konsentrasjon [40], kan kalsium anses å undertrykke den epiteliale-mesenchymale overgang (EMT) for å hemme CRC metastaser.
Per3
var den mest oppregulert genet i vår studie, som tilhører perioden gener. Disse genene er kjerneelementene i transkripsjons /translasjonsforskning feedback loops som genererer den endogene døgnrytmen, og
Per3
deltar i tidtaking i hypofysen og lunge [41]. Nylige studier har antydet at cirkadianske gener deltar i veksten og utviklingen av ulike kreftformer, og perioden genene har nå blitt koblet til DNA-skade responsforløp, hemning av veksten av kreftceller, og økning i den apoptotiske hastighet [42]. Oshima studie har vist at uttrykket av
Per3
i CRC vev var betydelig lavere enn i den tilstøtende normal slimhinne, som tyder på at
Per3
kan fungere som en tumor suppressor gen [43].
Tef
var den nest mest oppregulert gen i vår studie. Det tilhører den PAR-domenet basic leucine glidelås (PAR bzip) transkripsjonsfaktorer og er involvert i avrusning og legemiddelmetabolismen [44] og i vedlikehold av cellen form i fibroblaster [45]. Det fungerer også som en pro-apoptotiske genet ved å fremme uttrykket av BCL-gs eller bik [46], [47]. Mange andre gener ble også oppregulert, f.eks
Rnf152 Hotell og
Prdx6
.
Rnf152
er en roman RING finger protein og har vist seg å ha pro-apoptotiske aktivitet [48].
Prdx6
er medlem av PRDX familien, forbundet med funksjoner som celledeling, differensiering og apoptose, og dermed utfører anti-kreft aktivitet [49].
Ved å bruke pathway analyse, vi funnet at Wnt reaksjonsveien ble signifikant påvirket. Selv om uttrykket av Wnt hemmende faktor
wif1
var signifikant nedregulert, ble det av mange gener assosiert med Wnt signalveien og deres målgener downregulated [dvs.
Tcf7
,
Myc
,
cyclin D1 product: (
Ccnd1
), og
Mmp7
FC fra -1,53, -1,61, -1,62, og henholdsvis -7,07,]. Proteinet uttrykk for β-catenin ble betydelig redusert i DMH + Calcium gruppe, noe som tyder på at Wnt veien ble nedregulert i denne gruppen. Dette er i overensstemmelse med tidligere funn [28], [50]. Interessant, cellesyklus sti ble også betydelig hemmet i DMH + Calcium gruppe, med mange gener i denne veien blir konsekvent nedregulert, dvs. de cykliner
Ccnb1 Hotell og
Ccnd1
ble nedregulert ved 1.79 og 1,62 ganger, henholdsvis, og ekspresjon av cyclin-avhengige kinase
Cdk1
ble redusert med 1,66 ganger.
Blant de metabolske baner, ble de arakidonsyre-trasé vesentlig hemmet i DMH + kalsium gruppe. Mange enzymer i denne reaksjonsveien, viste redusert ekspresjon, f.eks Ptgs2, også kjent som syklooksygenase-2 (COX-2), ble redusert med 3 ganger. Arakidonsyre-reaksjonsveien er aktivert i løpet av inflammasjon, som fører til syntesen av prostaglandin og tromboksan, som spiller en viktig rolle i inflammatoriske respons [51]. Videre er nøkkelenzymet i denne reaksjonsveien, Ptgs2 (COX-2), spiller en viktig rolle i initieringen av CRC. COX-2 overekspresjon ble vist å være korrelert med kreftutvikling i mer enn 80% av CRC [52]. I dyremodeller er COX-2 ekspresjon funnet å være tilstrekkelig til å indusere tumorgenese [53]. Mekanismen kan være relatert til aktivering av induserbar nitrogenoksidsyntase (iNOS) og VEGF-signalering for å fremme dannelsen av nye blodkar [54]. På bakgrunn av det funn at ekspresjonen av de inflammatoriske cytokiner S100a9, Defa, TNF og TNF-reseptorer ble også signifikant nedregulert i DMH + Kalsium gruppe, spekulert vi at kalsium kan spille en viktig rolle i å redusere betennelse knyttet til tumorgenese.
Blant de Pathway Studio-avledet hub gener som kan spille viktige roller i kalsium-mediert forebygging av CRC,
FoxM1
,
NF-kB
, etc., var også involvert. FoxM1 tilhører en familie av evolusjonært konserverte transkripsjonelle regulatorer som ble karakterisert ved nærværet av et DNA-bindende domene er kjent som den gaffelhodeboksen domene. Høyere ekspresjon av FoxM1 ble notert i mange typer humane cancere [55]. FoxM1 kan spille viktige roller i celleproliferasjon og apoptose [56]. Den molekylære mekanismen bak FoxM1 signale-mediert induksjon av tumorvekst er ikke helt klarlagt. Imidlertid, flere onkogene reaksjonsveier slik som PI3K /Akt, NF-kB, ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK), mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK), VEGF, reaktive oksygenarter (ROS), c-myc, og hypoksi-induserbar faktor (HIF) -1 har blitt rapportert til å samhandle med FoxM1 aliserte; Dette tyder på at samspillet mellom FoxM1 signalering og andre signalveier kan spille viktige roller i tumorigenesis [57]. Det skal bemerkes at ekspresjonen av mange gener regulert av NF-kB viste endret ekspresjon i DMH + Kalsium gruppe, f.eks,
TNF
,
PTGS2
,
MYC
CCND1
,
ETS-relatert gen 1 product: (
ERG1
),
S100A9
, og
lymfoid enhancer faktor 1 product: (
LEF1
), noe som tyder på at NF-kB kan også tjene som en hub genet i kalsium-mediert forebygging av CRC. Selv om ekspresjonen av NF-kB ikke endrer vesentlig på transkripsjonsnivået, kan det ha endret ved det translasjonelle eller posttranslational nivå. Uttrykket mønster av NF-kB i DMH + Kalsium gruppe og dens spesifikke mekanismen må bli ytterligere belyst.
Vi har også funnet at genuttrykk nivåene av de fleste av de ovennevnte utvalgte gener hos mus fra DMH + kalsium gruppe med tumorer var mellom de fra samme gruppe uten tumorer og de fra DMH gruppe, således bekreftet viktigheten av disse gener i kalsium s forebygging av CRC.
