Abstract
NEDD4 familie på E3 ubiquitin ligaser inkluderer ni medlemmer. Hver er en modulær protein, inneholdende en N-terminal C2-domene for celle lokalisering, to-til-fire sentrale WW domener for substrat anerkjennelse, og en C-terminal katalytisk domene hect, som er ansvarlig for å katalysere reaksjonen ubiquitylation. Medlemmer av denne familien er kjent for å påvirke trasé sentrale til patogenesen av tykktarmskreft, inkludert WNT, TGFfi, EGFR, og p53 veier. Nylig,
NEDD4
mRNA ble rapportert å være overuttrykt i tykktarmskreft, men tumor stadium ble ikke vurdert i analysen. Uttrykk for de andre familiemedlemmer er ikke undersøkt i tykk- og endetarmskreft. Heri, bestemt vi uttrykk mønstre av alle ni NEDD4 familiemedlemmer i 256 pasienter som hadde hatt sykdommen varierer fra premaligne adenom til stadium IV tykktarmskreft.
NEDD4
mRNA ble betydelig økt i alle stadier av tykktarmskreft. I kontrast,
NEDD4L
mRNA, nærmest homolog til
NEDD4
, var den mest downregulated familiemedlem, og ble betydelig nedregulert i alle kreft etapper. Vi fant også NEDD4L protein ble betydelig redusert med western blotting i kolorektal kreft prøvene i forhold til tilstøtende normal slimhinne. I tillegg NEDD4L, men ikke katalytisk inaktive NEDD4L, hemmet kanonisk WNT signalering ved eller under nivået for β-catenin
in vitro
. Disse funnene tyder på at NEDD4L kan spille en svulst undertrykkende rolle i tykk- og endetarmskreft, muligens via hemming av kanoniske WNT signale
Citation. Tanksley JP, Chen X, Coffey RJ (2013) NEDD4L Er nedregulert i tykktarmskreft og hemmer Canonical WNT Signa. PLoS ONE 8 (11): e81514. doi: 10,1371 /journal.pone.0081514
Redaktør: Chunming Liu, University of Kentucky, USA
mottatt: 22 juli 2013; Akseptert: 23. oktober 2013, Publisert: 28.11.2013
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Jarred Tanksley ble støttet av NCIP5095103, RO1CA46413, og GM007347. Xi Chen ble støttet av RO1CA158472. Robert J. Coffey ble støttet av NCIP5095103 og RO1CA46413. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje vanligste kreftformen i USA av forekomsten, og andre bare til lungekreft i dødelighet, forårsaker omtrent 50.000 dødsfall hvert år [1]. Prosessen med tumorigenesis i sporadisk CRC begynner vanligvis med en inaktive mutasjon i
adenomatøs polypose coli (APC)
genet som fører til avvikende aktivering av den kanoniske WNT signalveien [2]. I de resterende tilfellene er det ofte en mutasjon i
CTNNB1
, som koder for β-catenin [3]. Resultatet av hver av disse mutasjonene er den reduksjon eller tap av en celles evne til å målrette cytoplasmatisk β-catenin til den multi-proteinet E3 ubikvitin ligase, beta-transducin repeat-inneholdende protein (β-TRCP), som poly-ubiquitylates β -catenin, og retter seg mot det å proteasome for degradering [4]. I stedet akkumuleres β-catenin i kjernen, og partnere med TCF /LSF transkripsjonsfaktor for å drive en transkripsjonen program som til slutt resulterer i neoplasi. I dette scenariet er det cellenes manglende evne til å kontrollere nivåer av β-catenin gjennom ubiqitin-mediert degradering som fremmer tumorigenesis. Imidlertid er prosessen med ubiquitylation som en helhet antas å være oppregulert ved kreft, noe som har ført til bruk av proteasomhemmere i CRC-behandling [5].
Ubiquitylation er en sekvensiell, tre-trinns prosess som involverer en E1, E2, E3 og ubiquitin-ligase som resulterer i kovalent binding av ubiquitin (s), et 76 aminosyre-protein, til et Lys rest (r) av et substrat eller målprotein. Det er sentralt for cellulær homeostase, først og fremst ved å målrette proteiner til proteasome eller lysosome for degradering via feste av ubiquitin kjeder (poly-ubiquitylation). Imidlertid har ubiquitylation også vist seg å spille en viktig rolle i handelen, lokalisering, og aktiviteten til proteiner, særlig når det er tilsetningen av bare en ubiquityl del, betegnet mono-ubiquitylation [6]. Target spesifisitet er primært levert av E3 ligaser, som katalyserer det siste trinnet av ubiquitin vedlegg. I det menneskelige genom, er det over 600 E3 ligaser, mot cirka 30 E2S og to E1S. En gitt E3 kan ha mange mål, og kan aktivere eller hemme flere cellulære signalveier [7]. Det er to store familier av E3S. Det virkelig interessante New Gene (RING) familie, bestående 95% av alle E3S og homolog til E6-AP karboksylenden (hect) familie, bestående av de resterende 5% [8]
NEDD4 familie av hect-type E3S inkluderer ni medlemmer [9]. Hvert medlem er en modulær protein, med en N-terminal C2-domene, to-til-fire sentrale WW domener, og en C-terminal katalytisk domene hect. WW domener er ansvarlig for valg av målsetting og samhandle med en fire aminosyre motiv (PY motiv, PPXY) i målet protein, mens K2-domenet hjelpemidler i riktig cellulær lokalisering. Den hect domenet er ansvarlig for å rekruttere E2, som tjener som en bærer for ubiquitin og direkte konjugater ubiquitin til målet Lys rest, en prosess som krever en aktiv stedet Cys-rest. Den grunnleggerne av denne familien, NEDD4, har nylig blitt vist å være oppregulert i CRC, og å fremme spredning av CRC celler
in vitro
, men mekanismen er fortsatt uklart [10]. Utover den studien, er ingenting kjent om uttrykk mønstre av NEDD4 familien i CRC. Av notatet, har mange av de NEDD4 familiemedlemmer blitt funnet å målrette proteiner som er integrert spillere i trasé antas å være de viktigste i genesis og progresjon av CRC.
I denne studien, søkte vi å finne ut mRNA uttrykk nivåer av hver av de ni NEDD4 familiemedlemmer i svulster fra en stor kohort av personer med kolorektal neoplasi. Vi fant ut at
NEDD4
er den mest oppregulert medlem av familien. Overraskende,
NEDD4L
, som deler den største sekvens homologi med
NEDD4
, var den mest downregulated medlem av familien i barnekonvensjonen. Vi har bekreftet at nedregulering av NEDD4L på proteinnivået i humane CRC prøver. Nylig NEDD4L ble vist degradering DVL2, og dermed hemme WNT signalering, som bestemmes av redusert TOPFlash aktivitet [11]. Vi fant også at NEDD4L hemmer TOPFlash aktivitet ved eller under nivået av β-catenin. Samlet utgjør disse funnene tyder på at NEDD4L har potensial til å fungere som en tumor suppressor i CRC.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Alle de humane prøver som brukes i vår manuskriptet ble samlet inn og analysert i samsvar med en protokoll godkjent av Institutional Review Boards ved Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN, og Moffitt kreftsenter, Tampa, FL. Prøvene som benyttes i denne publikasjon, er blitt beskrevet tidligere [12], [13]. De resulterende data ble analysert anonymt.
Menneske vevsprøve microarray analyse
I alt 250 mennesker CRC vevsprøver var samlet på VUMC (N = 55) og MCC (N = 195). Av disse CRC prøvene, ble 33 Trinn I (13,2%), 76 trinn II (30,4%), 82 trinn II (32,8%), og 59 trinn IV (23,6%). Tilstøtende normalt vev ble samlet ved MCC fra ti av disse pasientene. Av disse to ble samlet inn fra Stage jeg, fem fra Stage II, og tre fra Stage III pasienter. Ytterligere seks adenomer var samlet på MCC. Prøvene som benyttes i denne publikasjon, er blitt beskrevet tidligere [12], [13]. RNA fra disse vev ble innhentet og hybridisert til Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Genechip Expression Array. Følgende prober ble analysert:
NEDD4 plakater (213012_at),
NEDD4L plakater (237498_at, 241396_at, 212445_s_at, 212448_at),
WWP1 plakater (212637_s_at, 212638_s_at),
WWP2 plakater (1552737_s_at, 1554580_a_at, 204022_at, 210200_at),
ITCH plakater (209743_s_at, 209744_x_at, 217094_s_at, 235057_at, 239101_at),
SMURF1 plakater (1559426_at, 212666_at, 212668_at, 215458_s_at, 232665_x_at ),
SMURF2 plakater (205596_s_at, 227489_at, 232020_at),
NEDL1 plakater (210331_at, 215584_at), og
NEDL2 plakater (232080_at, 243080_at). Av de fire sonder spesifikke for
NEDD4L
, fokuserte vi vår oppmerksomhet på 212445_s_at som det koder for en del av det translaterte protein. Tre av de fire NEDD4L prober ble betydelig nedregulert på en lignende måte, mens en (237498_at) forble uendret med progresjon.
Pasienter i VUMC gruppen hadde en median oppfølging på 50,2 måneder, med et minimum føl- opp til 0,4 måneder og maksimum 111.3 måneder. De i MCC gruppen hadde en median oppfølging av 44,7 måneder, med et minimum på 0,92 og maksimum 142,8 måneder. Alle disse prøvene ble samlet inn og analysert i samsvar med en protokoll godkjent av Institutional Review Boards både VUMC og MCC.
Western blot analyse
CRC vev og tilstøtende normale colonic slimhinnen prøver ble samlet inn fra 20 individer ved kirurgisk reseksjon ved VUMC og hurtigfrosset i flytende nitrogen. Prøvene ble deretter lysert i 8 M urea, ultralydbehandlet og sentrifugert ved 14 000 rpm. Supernatanten ble fjernet, og proteinet kvantifisert ved å måle absorbans ved 280 nm. Prøvene ble så kjørt på en 7,5% polyakrylamidgel og overført til nitrocellulosemembraner. Membranene ble utslettet med anti-NEDD4L (1:2000) (Bethyl Laboratories, Montgomery, Texas) og anti-α-tubulin (1:2000) (TUBA) (Calbiochem, San Diego, California) antistoffer, og oppdaget ved hjelp av egnet HRP -konjugert sekundære antistoffer og kjemiluminescens-metoden. Intensiteter av blotter ble deretter kvantifiseres ved hjelp av ImageJ programvare, og analysert.
TOPFlash analysen
transfections ble utført ved hjelp Metafectene (Biontex, San Diego, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. HEK293-celler (2 x 10
5) ble sådd i en 12-brønners skål, fikk feste seg og transfekteres den neste dag med 0,1 ug av hvert plasmid. Følgende plasmider ble brukt: TOPFlash reporter plasmid, FOPFlash reporter plasmid, pcDNA3.1, NEDD4L (KIAA0439) (Addgene plasmid 27000), og NEDD4L (C A) (Addgene plasmid 27001) [14]. Konstrukter som inneholder villtype (wt) β-catenin og mutant β-catenin (ΔN89) var en gave fra Ethan Lee ved Vanderbilt University. Dagen etter transfeksjon, ble mediet fjernet, og serumfritt medium inneholdende 20 ng /ml WNT3A og 100 ng /ml R-spondin (Vanderbilt antistoff og protein delt ressurs) ble tilsatt. Den følgende dag ble cellene lysert og behandles i samsvar med luciferase-assay kit (Promega, Fitchburg, WI). TOPFlash aktiviteten ble normalisert til FOPFlash aktivitet, og fold-aktivering ble bestemt ved å normal til TOPFlash og FOPFlash aktivitet i ustimulerte celler. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer minst tre ganger.
NEDD4L knock-down
Lentiviral plasmider som inneholder shRNA (Open Biosystems, Huntsville, Alabama) mot menneskehandel
NEDD4L
ble transfektert inn HEK293 celler ved hjelp Metafectene. Dagen etter, frisk medium ble tilsatt. Den neste dag ble mediet filtrert (0,45 um filter). For å infisere DLD-1 og RKO celler, 2,0 x 10
5-celler ble sådd ut i hver brønn av en 6-brønns plate, og infisert med lentivirus. Etter to dager ble GFP ekspresjon observert, og infiserte celler ble selektert med puromycin (5 ug /ml) og sortert for GFP uttrykk. Effektivitet av knock-down ble bestemt av NEDD4L western blotting.
Statistisk analyse
Å sammenligne uttrykket nivået av hver probe mellom normal, adenom, og kreft vevsprøver, den Wilcoxon rank sum test ble brukt [12], [13]. For å bestemme relative proteinnivåer, ble NEDD4L proteinnivåer normalisert til Tuba nivåer, log-transformert, og sammenlignet ved hjelp av en paret t-test. Kaplan-Meier-overlevelsesanalyse ble utført på mikromatrisedatasettet for å bestemme sykdomsspesifikk overlevelse. Sykdomsspesifikk overlevelse ble definert som en dokumentert kreftrelatert død [12]. Betydning nivåer i TOPFlash reporter analysen eksperiment ble bestemt ved hjelp av t-test.
Resultater
Expression nivåer av NEDD4 familiemedlemmer i CRC
De ni medlemmene av NEDD4 familie på E3 ubiquitin ligaser er modulære proteiner (figur 1). Som helhet er NEDD4 familien er kjent for å være involvert i reguleringen av en rekke proteiner og veier som er sentrale for utviklingen av CRC. Tabell 1 er en samling av kjente substrater, signalveier som berøres, og uttrykk nivåer i ulike kreft i alle NEDD4 familiemedlemmer. Det er høy sekvenshomologi blant familiemedlemmer, noe som forklarer de delte mål for mange av familiemedlemmene. Men det finnes også eksempler på forskjellige familiemedlemmer som har motsatte virkninger på den samme signalveien. For eksempel, bevirker NEDD4 den nedregulering av SMAD1 og CBL, som hemmer benmorfogenetisk protein (BMP) signalering og aktiverer epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) signal-, henholdsvis [15], [16]. På den annen side, NEDD4L virkninger transformerende vekstfaktor-β (TGFfi) signalering, men ikke BMP-signalering, ved nedbrytning av SMAD 2 og 3, og type I TGFp-reseptoren, og opphever EGFR signalisering gjennom de ubiquitin-mediert nedbrytning av aktivert CDC42 kinase 1 (ACK1) [14], [17], [18]. I tillegg NEDD4 har vist seg å nedregulere tumor suppressor PTEN [19]. Men NEDD4 ble vist seg å fremme spredning av CRC celler
in vitro
, uavhengig av en effekt på PTEN nivåer [10].
De ni medlemmene av NEDD4 familien er modulære proteiner. Ved sin N-terminale ende, har hver en C2-domene, som spiller en rolle i riktig cellulær lokalisering. Den sentrale del av hvert protein inneholder to-til-fire WW domener, som er ansvarlig for target anerkjennelse. WW domener er 20-23 aminosyre, Trp-baserte motiver som gjenkjenner PY motiver (PPXY, LPXY), samt noen fosfor-Ser- eller fosfor-Thr-baserte motiver. Ved C-terminus er hect domene, som direkte konjugater en ubiquityl gruppe til målproteinet. Familiemedlemmene er gruppert sammen med navn og homologi. ITCH er nærmere homolog til WWP1 og 2 enn til andre familiemedlemmer.
For å bestemme en potensiell rolle for NEDD4 familien i initiering eller progresjon av CRC, vi utsettes 250 CRC pasienttumorprøver av ulike stadier, seks adenom prøver, og 10 tilstøtende normale prøver til mikromatriseanalyse, legg merke til hvordan uttrykk for hvert familiemedlem endret seg med progresjon (figur 2A). Interessant, tett homologe par
NEDD4 Hotell og
NEDD4L
var motsatt regulert (figur 2B, C).
NEDD4 plakater (213012_at) tendert oppover på adenom scenen, men ble betydelig forhøyet i Stage 1 CRC og forble signifikant forhøyet i løpet av tumorprogresjon. Omvendt,
NEDD4L plakater (212445_s_at) uttrykk redusert, trending nedover i adenomer, og ble betydelig redusert i alle faser av CRC (figur 2C).
(A) Uttrykket av alle ni NEDD4 familie medlemmer ble undersøkt i CRC av microarray profilering. Vist her er den gjennomsnittlige fold-forandring av alle sonder for hver enkelt gen i Nl (N = 10), Ad (N = 6), CA1 (N = 33), Ca2 (N = 76), Ca3 (N = 82) og CA4 (N = 59). (B)
NEDD4 plakater (213012_at) er den mest oppregulert medlem av NEDD4 familien i CRC. (C)
NEDD4L plakater (212445_s_at) er den mest downregulated medlem av NEDD4 familien i CRC. Nl = normal, Ad = adenom, og Ca1-4 = CRC, stadium I-IV. * P. 0,05
NEDD4L protein er redusert i CRC
Som transkripsjonsnivåer av et bestemt gen ikke alltid korrelerer med protein nivåer, neste fastsatte vi om nedgang i
NEDD4L
mRNA nivåer resulterte i en nedgang i NEDD4L protein. For å gjøre dette, vi utførte western blot analyse på menneskelig CRC og tilstøtende prøver normale vev fra 20 pasienter som bruker vev samlet ved Vanderbilt University Medical Center (figur 3A, B). Vi har observert en signifikant reduksjon i NEDD4L proteinnivåer (~42%) i humant CRC sammenlignet med normalt vev, er en finne i overensstemmelse med mikromatriseanalyse.
(A) NEDD4L nivåer ble bestemt ved Western-blotting av CRC (Ca ) og tilstøtende normalt (Nl) slimhinnen fra tjue personer. Nivåer ble normalisert til TUBA og Nl ble sammenlignet med Ca. NEDD4L var signifikant nedregulert (~42%) i CRC (* p 0,05). Data blir representert i boksen og whisker plott format. Linjene som kobler datapunkter viser de relative NEDD4L nivåer i en gitt Nl-Ca matchet par. Røde betegner redusert NEDD4L nivåer i Ca, mens svart betegner en økning. (B) Lysates generert fra Nl-Ca matchet par ble blottet for NEDD4L og TUBA. Vist her er fire representative par.
neste søkt å fastslå om NEDD4L uttrykk nivåer korrelerer med sykdomsspesifikk overlevelse i vår kohort av pasienter. Vi sammenlignet overlevelse av pasienter i det høyeste kvartil av NEDD4L uttrykk med den av de i det laveste kvartil (figur 4). Vi fant at de pasientene med høyest NEDD4L uttrykket oppviste en lengre periode av sykdomsspesifikk overlevelse enn pasienter med de laveste ekspresjonsnivåer. Denne forskjellen er imidlertid ikke statistisk signifikant (p = 0,079).
sykdomsspesifikk overlevelse i CRC pasienter med høyest og lavest NEDD4L uttrykk ble sammenlignet ved hjelp av Kaplan-Meier analyse. Pasienter med tumorprøver i høyeste kvartil av NEDD4L uttrykk viste en trend mot lengre sykdomsspesifikk overlevelse over en 60-måneders periode. p = 0,079.
NEDD4L undertrykker kanoniske WNT signaliserer
Den betydelige nedgangen i NEDD4L uttrykk i CRC antyder muligheten for at NEDD4L spiller en tumor-undertrykkende rolle i CRC. Gitt sentralitet kanoniske WNT aliserte til initiering og progresjon av CRC, undersøkte vi om NEDD4L kan undertrykke kanoniske WNT signalering ved å utføre TOPFlash reporter analysen, som måler kanonisk WNT aktivitet ved å fusjonere TCF /LEF responselementer til en ildflue luciferase reporter. NEDD4L inhibert TOPFlash aktivitet når kanonisk WNT signalisering ble aktivert ved tilsetning av WNT3A og coactivator, R-spondin (figur 5A). Hemming synes å være avhengig av evnen til NEDD4L til ubiquitylate målproteiner, som den katalytisk inaktiv form av NEDD4L, hvor den aktive-området Cys ble mutert til et Ala [NEDD4L (C A)] viste ingen hemming av TOPFlash aktivitet ( Figur 5A) [20]. Disse resultatene støtter den nylige funn at NEDD4L hemmer WNT signalering av ubiquitylating og målretting DVL2 til proteasome for degradering [11]. Men vi fant også at NEDD4L hemmet kanoniske WNT signale når wt eller mutant (ΔN89) β-catenin ble brukt som en aktivator (figur 5B), noe som tyder NEDD4L undertrykker WNT signaliserer nedstrøms DVL i nærvær av mutant APC eller CTNNB1.
(A) NEDD4L hemmer TOPFlash aktivitet i HEK293 celler sammenlignet med tom vektor (CTL) eller katalytisk inaktiv NEDD4L [NEDD4L (C A)]. WNT3A (20 ng /ml) og R-spondin (100 ng /ml) ble anvendt for å aktivere kanoniske WNT signalering. (B) Når to forskjellige β-catenin konstruksjoner, β-catenin (wt) og β-catenin (ΔN89), blir brukt til å aktivere kanoniske WNT signaliserer en betydelig reduksjon i TOPFlash aktivitet ble observert i nærvær av NEDD4L overekspresjon, sammenlignet tom vektor eller NEDD4L (C A). Alle resultater er normalisert til FOPFlash aktivitet. * P. 0,05
For å utvide dette arbeidet, undersøkte vi vekstvirkningene av å slå ned endogen NEDD4L i to menneskelige CRC cellelinjer, DLD-en og RKO. DLD-1 celler inneholder en avkorting mutasjon i
APC
, mens RKO celler har verken en mutasjon i
APC
eller
CTNNB1
, men har en inaktivere mutasjon i
NKD1
, en induserbar negativ regulator av WNT signalering [21]. Knock-down ble bekreftet ved Western-blotting (~80%) (data ikke vist). Vi målte vekst på plast, og i myk agar og kollagen. Vi observerte ingen signifikante forskjeller i vekst i celler med NEDD4L knock-ned i forhold til egge kontroller (data ikke vist). I tillegg NEDD4L knock-down hadde ingen effekt på tumorstørrelse i nakne mus xenografter (data ikke vist).
Diskusjoner
Denne studien ble utført for å begynne å forstå om det er en rolle for medlemmer av NEDD4 familie på E3 ubiquitin ligaser i CRC. Ni medlemmer utgjør denne familien, og hver av dem har vist seg å påvirke minst ett av de cellulære veier sentrale for initiering og progresjon av CRC. Flere medlemmer er blitt vist å være dysregulerte i en rekke forskjellige kreftformer. Men en systematisk evaluering av uttrykket nivåer av alle familiemedlemmer i menneskelig CRC har ikke tidligere blitt utført. Spesielt,
NEDD4
mRNA uttrykk ble nylig vist å være oppregulert i CRC, men denne analysen ikke anser den fasen av CRC, eller inneholder adenomer [10]. Vi følte at det første trinnet i begynnelsen for å forstå denne familien av E3S i CRC var å undersøke uttrykket nivåer til hvert familiemedlem i CRC fra en stor kohort av pasienter. Vi valgte å utføre våre analyser på tvers av alle stadier, inkludert adenomer, så er det ofte endringer i lignende baner på lignende poeng i løpet av CRC progresjon [2]. Noen av disse banene har forskjellige funksjoner på forskjellige stadier. For eksempel er TGFfi pathway en tumor suppressor tidlig i barnekonvensjonen, men fremmer progresjon og metastaser senere [22].
Heri vi vurdert hvordan uttrykk for hver NEDD4 familiemedlem endringer med progresjon fra adenom til Stage IV CRC. Den mest oppregulert familiemedlem var
NEDD4
, i samsvar med de nevnte funnene [10]. Vi går på å vise at oppregulering skjer tidlig i CRC (stadium I), og oppregulering opprettholdes under progresjon. Den mest downregulated familiemedlem i vår datasettet var
NEDD4L
. Vi fant dette overraskende gitt at NEDD4L deler høyeste sekvens homologi med NEDD4, og har vist seg å ha en betydelig overlapping med NEDD4 i mål utvalg [7]. Nylig ble NEDD4L protein nivåer vist seg å bli nedregulert i magekreft, og de pasientene med lavest uttrykk ved immunhistokjemisk analyse hatt en dårligere prognose [23]. NEDD4L har også blitt funnet å være både oppregulert og nedregulert i prostata cancer, økte i invasive galleblæren kreftceller, og nedregulert i mer aggressive maligne gliomer [24] – [27]. Disse ulike funnene er ikke uventet gitt antall mål og cellesignalveier hvorpå NEDD4L har blitt funnet å opptre.
En fersk rapport viser at NEDD4L hemmer både de kanoniske og ikke-kanoniske Wnt signalveier etter ubiquitylating DVL2 , og rettet mot det å proteasomet for ødeleggelse [11]. Her fant vi at NEDD4L kan også hemme kanoniske WNT signale på nivå med, eller nedstrøms, β-catenin. Dette er i motsetning til den ovennevnte papir, hvor de undersøkere viste at NEDD4L ikke kunne hemme TOPFlash når signalering ble aktivert ved en β-catenin mutant (S37A). I sin studie, ble isoform 2 av NEDD4L (NM_001144964.1) som brukes, mens vi brukte en annen NEDD4L isoform (KIAA00439). Disse to cDNA forskjellig ved sin N-terminale ende; konstruksjonen anvendt i vårt studium har ytterligere 141 aminosyrerester ved den umiddelbare N-terminale ende, noe som modifiserer C2-domenet, og 20 færre rester i et segment som går forut for andre WW domene. Dette kan bidra til forskjells lokalisering eller substrat målgruppe. I tillegg ble ulike β-catenin konstruksjoner testet; vi brukte vekt og mutant β-catenin (ΔN89), og, i den tidligere rapporten ble β-catenin (S37A) brukes.
Vi fant ut at å slå ned uttrykket av endogen
NEDD4L
i to CRC linjer hadde ingen effekt på vekst. Dette kan være på grunn av det faktum at disse cellelinjene er allerede utviklet en mekanisme for å overvinne de veksthemmende effekter av NEDD4L, eller at cellene har allerede oppnådd et endogent reduksjon i NEDD4L uttrykk til et nivå under det som er nødvendig for veksthemming. Fremtidige studier vil løse dette ved overekspresjon vekt NEDD4L i et batteri av CRC linjer. I siste instans kan det være nødvendig å opprette en musemodell i hvilken NEDD4L er banket ut tidlig i prosessen med tumorgenese.
Som konklusjon, har vi undersøkt mRNA-ekspresjon av det NEDD4 familien av E3-ubiquitin-ligaser i en stor kohort av personer med kolorektal neoplasi. Den mest sterkt oppregulert medlem er
NEDD4
, som tidligere er blitt vist å øke proliferasjonen av humane celler CRC
in vitro product: [10]. Den mest downregulated medlem er
NEDD4L
. I samsvar med tidligere funn, NEDD4L overekspresjon i HEK293 celler hemmes kanonisk WNT signale [11]. Her viser vi også at NEDD4L inhiberer WNT signalering ved eller nedstrøms av β-catenin, noe som er viktig i sammenheng med de mest vanlige aktiverende mutasjon i kanonisk WNT signalering som finnes i CRC. Derfor foreslår vi at NEDD4L kan fungere som en tumor suppressor i CRC ved å hemme kanoniske WNT signalering.
Takk
Forfatterne ønsker å takke Bruce Aronow, Dan Ayers, Tim Yeatman, og Josh Smith for deres hjelp med dataanalyse, og Jim Higginbotham for hans hjelp med flyt sortering. Forfatterne takker også Emily Poulin for henne redaksjonell bistand.
