Abstract
Målet med denne studien er å avgjøre om pasienter med paraneoplastic cerebellar degenerasjon (PCD) og småcellet lungekreft (SCLC) ha en spesifikk repertoar av antistoffer, hvis SOX1 antistoffer (SOX1-ab) kan forutsi nærvær av SCLC, og hvis antistoffer til celleoverflate-antigener forekommer i dette syndromet. Antistoff analyser ble gjort ved hjelp av immunhistokjemi på rottehjerne, immunoblot med rekombinante antigener, screening av cDNA uttrykk biblioteker, og immunolabeling av levende nevroner i 39 pasienter med PCD og SCLC. VGCC-ab ble målt ved RIA, og SOX1-ab, Hu-ab, og ZIC4-ab av immunoblot. Lambert-Eaton myastenic syndrom (Lems) var til stede i 10 av 23 pasienter med elektrofysiologiske studier. I det minste ett antistoff ble påvist i 72% av pasientene. De enkelte frekvenser var: 49% SOX1-ab, 44% VGCC-ab, 31% Hu-ab, og 13% ZIC4-ab. SOX1-ab forekom hos 76% av pasientene med VGCC-ab og 27% av de uten VGCC-ab (p = 0,0036). SOX1-ab ble ikke funnet i 39 pasienter med sporadisk sent innsettende lillehjernen ataksi, 23 med cerebellar ataksi og glutaminsyredekarboksylase antistoffer, og 73 med andre enn SCLC (31 uten onconeural antistoffer, 25 med Yo-ab, 17 PCD og krefttyper med Tr-ab). Fem pasienter (13%) hadde antistoffer mot ukjente nevronale celleoverflate-antigener, men ingen av dem forbedret med immunterapi. Ett serum immunologisk mot axon initiale segment av neuroner og et annet serum mot ELKS1, et protein sterkt uttrykt i lillehjernen som samhandler med beta4-subenhet av VGCC. Som konklusjon, 72% av pasienter med PCD og SCLC hadde ett eller flere antistoffer som indikerer tilstedeværelsen av denne tumor. Hos disse pasientene VGCC-ab og SOX1-ab oppstå tett forbundet. SOX1-ab er prediktorer for SCLC i ataksi pasienter med en spesifisitet på 100% og sensitivitet på 49%. I motsetning limbiske encefalitt med SCLC, til antistoffer celle andre enn VGCC-ab overflateantigener, er sjeldne og ikke forutsi respons på behandling
Citation. Sabater L, Höftberger R, Boronat A, Saiz A, Dalmau J, Graus F (2013) antistoffrepertoaret i paraneoplastic Cerebellar degenerasjon og småcellet lungekreft. PLoS ONE 8 (3): e60438. doi: 10,1371 /journal.pone.0060438
Redaktør: Michael Platten, Universitetssykehuset i Heidelberg, Tyskland
mottatt: 8 november 2012; Godkjent: 27 februar 2013; Publisert: 25 mars 2013
Copyright: © 2013 Sabater et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien har vært støttet delvis av Fondo de Investigaciones Sanitarias. Madrid. Spania (#FIS PS09 /0193 FG), den Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung, Østerrike, Prosjekt J3230 (RH), og NIH RO1NS077851, NCI RO1CA089054, Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS, 11/01780), og Fundació la Marató de TV3 (JD). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Dr. Dalmau har et forskningsstipend fra Euroimmun, og mottar royalties fra patenter for bruk av mA2 og NMDAR som autoantistofftester. Han har ingen finansielle konkurrerende interesser som eier av aksjer eller aksjer, lønnet arbeid eller konsulent, styreverv, reisestipend og honorarer for å snakke eller deltakelse på møter, produkter under utvikling eller markedsført produkter, eller gaver av noe slag etc. Forholdet mellom Dr. Dalmau med selskapet Euroimmun ikke endrer forfatterne, overholdelse av alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Ingen av de andre bidragsyterne har noen interessekonflikter.
Innledning
Purkinje celle er en av de vanligste målene for immunresponsen at noen pasienter med kreft bygget opp mot antigener som deles av svulst og nervesystemet [1]. Den døde Purkinje cellene resulterer i en pancerebellar syndrom kalt paraneoplastic cerebellar degenerasjon (PCD) [1]. Små-celle lungecancer (SCLC) er en av de mest vanlige tumorer som assosierer med PCD [2]. Mens mange pasienter (mer enn 80%) med andre neurologiske paraneoplastiske syndromer og SCLC havn Hu antistoffer (Hu-ab), er frekvensen av Hu-ab i PCD lavt (23%) [3]. Omtrent 40% av PCD pasienter med SCLC har antistoffer mot spenningsstyrte kalsiumkanaler (VGCC), og noen også til stede klinisk eller nevrofysiologiske tegn på Lambert-Eaton myastenisk syndrom (Lems) [3]. Opptil 60% av pasientene med Lems og SCLC har SOX1-ab, en serologisk markør for SCLC [4].
På grunn av den hyppige sammenslutning av PCD med SCLC, og noen ganger med Lems, begrunnet vi at fastsettelse av SOX1-ab kan også være nyttig å forutsi om pasienter med mistanke om PCD har en underliggende SCLC. Videre pasienter med limbisk encefalitt og SCLC, men uten onconeural antistoffer ofte har antistoffer mot neuronal overflatereseptorer, hvis dette paradigmet gjelder også for PCD er ukjent [5].
I den foreliggende undersøkelse vi analyserte antistoffrepertoaret i en serie av pasienter med PCD og SCLC, med fokus på hyppigheten av SOX1-ab og tilstedeværelsen av nye antistoffer til nevronale celleoverflateantigener.
Metoder
pasienter
Vi valgte fra databasen, pasienter med diagnosen av PCD og SCLC. Vi spesielt unntatt pasienter som hadde hatt ataksi men raskt utviklet symptomer utover cerebral dysfunksjon. Disse pasienter ble ansett å ha paraneoplastic encefalomyelitt, som i motsetning til PCD nesten alltid forbinder med Hu-ab [6]. Nevrologisk uførhet ble evaluert ved den modifiserte Rankin skala som beskrevet [6], [7]. Den kliniske informasjonen ble hentet fra skjemaer fylles ut av henvisende nevrologer og telefonintervjuer.
standard protokoll godkjenninger, registreringer og Pasient Samtykker
Serum og CSF prøver som brukes i studien er avsatt i innsamling av biologiske prøver som heter «neuroinmunología» registrert i biobanken av Institut d «Investigació BIOMEDICA august Pi i Sunyer (IDIBAPS), Barcelona, Spania. Tatt i betraktning at mange pasienter var døde på det tidspunktet undersøkelsen ble gjennomført, og undersøkelsen er helt anonym, så ingen prøve kan identifiseres til en bestemt pasient, ble det akseptert å frafalle spesifikk skriftlig informert samtykke fra pasientene eller pårørende av Comité Etic d’investigació Clínica (CEIC) Hospital Clinic. Animal håndteringsprosedyrer ble godkjent av den lokale etiske komité (99/1 University of Barcelona) og Generalitat de Catalunya (1094-1099), i samsvar med direktiv 86/609 /EU av EU-kommisjonen. Studien som forklart ble godkjent av CEIC Hospital Clinic.
Påvisning av anti-nevronale antistoffer
Serum og CSF, når det er tilgjengelig, ble evaluert for tilstedeværelse av onconeural (Hu, Yo, Ri, CV2, amphiphysin, MA2, Tr), anti-neuropil (NMDAR, Ampar, GABA
BR, CASPR2, LGI1, mGluR1 og mGluR5) eller mulige nye antistoffer ved immunhistokjemi på frysesnitt av paraformaldehyde-dynket eller post-fast rotte cerebellum som rapportert [8]. Onconeural antistoff positivitet ble bekreftet ved en kommersiell immunoblot (Ravo Diagnostika GmbH, Freiburg, Tyskland) og anti-neuropil antistoffer ved hjelp av et cellebasert assay ved å bruke HEK293 celler transfektert med de egnede plasmider, slik som tidligere beskrevet [9]. Antistoffer mot den underenheten β4 og γ2 av VGCC ble påvist ved immunfluorescens på HEK293 celler transfektert med plasmidene (MC201619 og SC312948; Origene, Rockville, Maryland, USA). Antistoffer mot P /Q typen VGCC ble målt ved et kommersielt radioimmunoassay (DLD Diagnostica GMBH, Hamburg, Tyskland). SOX1-ab og ZIC4-ab ble bestemt ved anvendelse av nitrocellulosefiltere med blandede fagplakker (50% av plakk fra positive kloner og 50% fra irrelevante kloner). Filtrene ble skåret i stykker, hver og en inkubert med ulike pasientens sera (fortynning 1:1000) og utviklet av en avidin-biotin immunoperoxidase teknikk som beskrevet [4].
For å bekrefte spesifisiteten av SOX1-ab i diagnose av PCD forbundet med SCLC, SOX1-ab ble også analysert i serum fra 31 pasienter med PCD og forskjellige krefttyper, annet enn SCLC, som ikke havn onconeural antistoffer som kunne bekrefte diagnosen av PCD, 25 til PCD, bryst eller eggstokkreft, og Yo-ab, 17 med PCD, Hodgkins sykdom, og Tr-ab, 39 pasienter med sporadisk sent innsett cerebellar ataksi, og 23 med cerebellar ataksi og glutaminsyredekarboksylase antistoffer.
Primær cellekultur og in vivo immunocytochemistry
Hippokampale nevronene ble hentet fra E18 Wistar rotte embryoer. Celler ble enzymatisk og mekanisk avbrutt og resuspendert i Neurobasal medium tilsatt B27 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) [9]. Granulære cellekulturer ble fremstilt fra dissekert cerebella fra 8 dager gamle Wistar-rotter og behandlet likt som hippocampale neuroner men ved anvendelse av Neurobasal-A-medium inneholdende 25 mM KCl og supplert med B27 [10]. Celler ble sådd ut på poly-L-lysin forbelagte P24-plater og 10 uM cytosin-p-D-arabinofuranoside (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ble tilsatt til kulturene 20 timer etter utplating, for å forhindre spredning av ikke- neuronale celler.
i immunocytokjemi forsøkene ble prøver (1:05 fortynning CSF og 1:200 serumfortynning) ble inkubert på levende neuroner i 1 time, deretter fiksert med 4% paraformaldehyd og permeabilisert med 0,3% Triton TX -100. Farging med anti-MAP2 antistoff ble utført for å bekrefte den neuronale spesifisiteten til de positive celler. Passende fluorescerende sekundære antistoffer ble anvendt og glassene ble montert med Vectashield med DAPI montering media (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) og visualisert med en Axio Imager M2 ZEISS mikroskop.
Screening av cDNA ekspresjonsbibliotek
Uni-ZAP XR biblioteker fra menneskehjernen og menneskelig fosterets hjerne (Stratagene, La Jolla, CA) ble immunoscreened med 10 PCD SCLC sera (4 pasienter med SOX1-ab og VGCC-ab, 4 seronegative, en med VGCC- ab og en med SOX1-ab), ved hjelp av teknikker som tidligere rapportert [4]. I korthet immunoscreening av cDNA-biblioteket med serum (fortynning 1:1000) ble utført for å oppnå isolerte positive plaques. Fagkloner ble subklonet i pBluescript-plasmidet ved hjelp av in vivo-utkutting fag rednings protokoll (Stratagene, La Jolla, CA). Plasmid DNA ble renset med QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Santa Clarita, CA), og sekvensert med DNA-sekvens ABI 377 (Applied Biosystems, Foster City, CA) ved hjelp av Big Dye terminator klar mix (Applied Biosystems). Positive kloner ble sekvensert på begge tråder. Det menneskelige genom BLAST program (NCBI, NIH, Bethesda, MD) ble brukt til å søke etter antatte.
Statistical Analysis
Sammenhengen mellom SOX1-ab og VGCC-ab ble analysert i en beredskaps bord og den tosidige Fisher eksakte test ble brukt.
Resultater
pasienter
Vi identifiserte 39 pasienter med PCD og SCLC. Median alder for pasientene var 64 år (spredning: 47 til 85 år) og 34 var menn. PCD antedated diagnostisering av SCLC hos 36 pasienter med en median på 2 måneder (variasjon: 0,5 til 42 måneder). På tidspunktet for diagnose PCD 10 pasienter hadde blemer og 13 ikke (bekreftet ved hjelp av minst normale forbindelse muskelaksjonspotensialer i Elektromyografi (EMG) studier [11]). Resten av de 16 pasientene fikk ikke se symptomer på Lems men ingen EMG studier ble gjort. Tjue sju pasienter fikk minst en hel kurs (intravenøs immunglobulin eller steroider, eller begge deler) av immunterapi (6 pasienter), kjemoterapi (14) eller begge (7). Ingen forbedring eller stabilisering med moderat alvorlig cerebral dysfunksjon (Rankin poengsum 3) forekom i 13 av de 21 pasientene (62%) som hadde tilstrekkelig oppfølging. Tre pasienter forbedret og 5 forble stabilt med en Rankin score på 3 eller mindre
VGCC og onconeural antistoffer. Assosiasjon med SOX1 antistoffer
sytti-to prosent av pasientene hadde minst ett av de angitte antistoffer. De individuelle frekvenser av antistoffene var: 49% SOX1-ab, 44% VGCC-ab, 31% Hu-ab, og 13% ZIC4-ab. Tjueåtte sera presentert i det minste ett antistoff, og 11 var negative (figur 1). Det var en klar sammenheng mellom SOX1-ab og VGCC-ab. SOX1-ab ble funnet i 76,5% av pasientene med VGCC-ab men bare 27,3% av de uten VGCC-ab (Fisher eksakt test p = 0,0036) (figur 2). Positive VGCC-ab ble funnet i 9 (90%) av de 10 pasientene med blemer og i 7 (54%) av det 13 uten kliniske eller EMG tegn på blemer. Tilsvarende SOX1-ab var tilstede i 80% av pasienter med Lems og 38% av de uten Lems. Det ble ikke observert assosiasjoner mellom VGCC-ab eller SOX1-ab og Hu-ab. Ingen av pasientene var positive for onconeural antistoffer, annet enn Hu, eller presenteres vel karakteriseres anti-neuropil antistoffer. SOX1-ab ble ikke detektert i kontrollserien av 73 pasienter med PCD og forskjellige typer kreft andre enn SCLC, 32 pasienter med sporadisk sent innsett cerebellar ataksi, og 23 med cerebellar ataksi og glutaminsyredekarboksylase antistoffer.
Distribusjon av SOX1-, VGCC-, men-, og ZIC4-ab i vår pasient kohort. Hver rad representerer en pasient og når positive cellen er fylt i fargen.
Bar grafen representasjon av sammenhengen mellom SOX1-ab og VGCC-ab. (Fisher eksakt test p = 0,0036).
Identifisering av nye antistoffer
Ett serum med SOX1-ab viste også robust immunoreaktivitets mot axon første segmentet av nevroner i rutine immunhistokjemiske studier ( Figur 3A). Screening av et humant cerebellum-cDNA-ekspresjonsbibliotek med dette serum mislyktes i å identifisere den antatte antigen. En annen ny antistoff ble identifisert i løpet av screening av cDNA-bibliotek med en serum med VGCC-ab. Målet protein, kalt ELKS1, er svært rik på lillehjernen. Vi utførte en bestemt fag screening analyse for påvisning av ELKS1 men vi kunne ikke finne andre positive sera. PCD sera også ikke viste immunoreaktivitets med HEK293 celler transfektert med β4 eller y2 hjelpe subenheter av VGCC. Fem pasienter (12,8%) hadde antistoffer mot celleoverflate-antigener uttrykt i levende, ikke-permeabiliserte hippocampale neuroner (figur 3B), men bare en av dem omsatt med lillehjernen granulære neuroner.
A. Antistoffer mot haug av nevronene rotte lillehjernen. Immunhistokjemi på rotte sagittal lillehjernen seksjoner. Legg merke til den sterke atypisk reaktivitet av en PCD SCLC serum mot kollen axon av nevroner, hovedsakelig i Purkinje celler. Kjerner er kontra med hematoksylin. B. immunfluorescens på live hippocampus nevroner. Hippocampus nevroner inkuberes med CSF 1/5 utvannet av en PCD SCLC pasient. Reaktivitet av pasienten mot membranen av neuronet er sett i grønt og MAP2 farging med rødt for å sikre den neuronale avstamning. Kjerner er sett blå med DAPI. (Objektiv 100x olje)
Diskusjoner
I denne studien ønsket vi å finne ut om pasienter med PCD og SCLC hadde andre enn VGCC-ab antistoffer som kan forklare den cerebellar ataksi eller på minst for å hjelpe i diagnostisering av PCD. Det isolerte bestemmelse av VGCC-ab i en pasient med cerebellar ataksi med eller uten blemer bekrefter nesten alltid en paraneoplastic opprinnelse fordi den kliniske foreningen av cerebellar ataksi og blemer meget sjelden forekomme i fravær av kreft [12], [13]. I tillegg, hvis cerebellar ataksi er paraneoplastic og pasienten har VGCC-ab den underliggende svulsten er alltid en SCLC [14].
For å overkomme denne begrensningen, vi analyserte tilstedeværelse av SOX1-ab, en serologisk markør av SCLC [15]. I vår serie med PCD og SCLC fant vi at SOX1-ab var til stede i nesten 50% av disse pasientene. I motsetning til dette ble SOX1-ab ikke funnet i serum fra pasienter med PCD og andre tumortyper med eller uten onconeural antistoffer og hos pasienter med cerebellar ataksi uten kreft. Våre data tyder på at SOX1-ab er gode prediktorer for en underliggende SCLC hos pasienter med cerebellar ataksi. Hyppigheten av SOX1-ab var enda høyere (76,5%) i PCD pasienter med SCLC som også hadde VGCC-ab. Denne frekvens er lik den som er rapportert i pasienter med blemer og SCLC (67%) [16]. Samlet utgjør disse data tyder på at pasienter med PCD og SCLC, co-forekomst av VGCC-ab og SOX1-ab er sterkt assosiert selv om 41% av PCD pasienter med VGCC-ab av den nåværende serien ikke har Lems.
Tidligere studier viste at alle pasienter med Lems og SCLC som hadde Hu-ab hadde også SOX1-ab [16]. Derfor gjorde ytterligere testing for Hu-ab ikke bedre diagnostisering av paraneoplastic Lems [16]. Men funn av denne studien har forskjellige implikasjoner. Mens SOX1-ab, skjedde i 48,7% av pasienter med PCD, ytterligere 20% av pasientene hadde Hu-ab eller VGCC-ab. Totalt sett kombinere testing av alle 3 antistoffer (alle kommersielt tilgjengelig) vil identifisere nesten 70% av pasienter med PCD og SCLC. Noen få pasienter kan ha andre onconeural antistoffer som ZIC4, CV2 eller amphiphysin og alle, men ZIC4 blir rutinemessig screenet med de samme pakkene som vanligvis brukes til å oppdage Hu-ab.
Vi fant ikke andre potensielt nyttige antistoffer i denne serien . Serumet til en pasient viste reaktivitet med axon initiale segment av store nerveceller. Dette antistoffet ble tidligere rapportert hos en pasient med encefalomyelitt og SCLC som utviklet anfall og alvorlige ganglag ataksi [17]. Vi har tidligere identifiserte dette immunoreaktiviteten hos en pasient med SCLC uten nevrologiske symptomer som tyder på antistoffet kan være en markør av den underliggende SCLC (upublisert). En annen pasient hadde et antistoff mot ELKS1, et protein som uttrykkes hovedsakelig i Purkinje-celler [18]. Selv ELKS1 co-immunpresipitatene med β4 VGCC subenheten, kunne vi ikke identifisere antistoffer reagerer direkte med β4 eller γ2, som er VGCC subenheter som er høyt uttrykt i lillehjernen [18], [19]. Vår studie utelukker ikke muligheten for at sera av disse pasientene kan ha antistoffer mot andre VGCC subenheter eller samspill proteiner. For eksempel, sera fra pasienter med ikke-paraneoplastic Lems reagerer oftere med domenet IV i alpha1A av VGCC sammenlignet med pasienter med Lems og SCLC [20].
Den nylige oppdagelsen av antistoffer mot nevrale overflateantigener har endret konseptet at antistoffer i CNS paraneoplastiske syndromer er bare surrogatmarkører i den underliggende tumor. Mens pasienter med limbiske encefalitt og SCLC ca 50% har Hu-ab og den andre 50% har antistoffer mot synaptiske proteiner (hovedsakelig GABA
B-reseptor) [5], viser vår studie at pasienter med PCD og SCLC forekomsten av antistoffer til celle andre enn VGCC-ab overflateproteiner, er sjeldne.
Den praktiske konsekvensen av vår studie er at pasienter med lillehjernen ataksi, SOX1-ab er gode prediktorer for et tilknyttet SCLC med en spesifisitet på 100 % og en sensitivitet på 49%. Dessuten er kombinasjonen av testing for SOX1-, VGCC-, og Hu-ab identifiserer nesten 70% av pasienter med PCD og SCLC. Gitt at PCD vanligvis utvikler seg før diagnosen svulst, er nyttig dette repertoar av antistoffer for å fastslå at lillehjernen syndrom er paraneoplastic, er den underliggende tumor SCLC, og sjansen for nevrologiske utvinning er lav.
Takk
forfatterne takker Mercé Alba og Eva Caballero for deres utmerkede teknisk støtte. Forfatterne takker også Dr. Xavier Xifró for å gi lillehjernen kornet cellekultur-protokollen.
