Abstract
Menneskelig endogene retrovirus K (Herv-K) er den mest intakte retrovirus i det menneskelige genom. Det er flere helaftens eller i nærheten av full lengde Herv-K provirus i den. For å analysere hvilke Herv-K provirus gi opphav til viral transkripsjoner i kreftcellelinjer og for å teste om ioniserende stråling kan endre nivåene av Herv-K transkripsjoner, RT-PCR undersøkelser ble foretatt ved hjelp av flere humane kreftcellelinjer. Primere fra flere stillinger i det virale genomet ble brukt og tatt med parene som skal krysse spleise veikryss i viral RNA. I fravær av ioniserende stråling, ble transkripsjoner oppdaget fra flere Herv-K provirus i cellelinjer fra menneske prostata, cervical, hode og nakke, eller brystkreft, og provirus hvorfra transkripsjoner stammer varierte mellom de ulike linjene. Bare én av 13 cellelinjer som ble testet (livmorhalskreft linje C33A) ikke klarte å vise Herv-K transkripsjoner. Skjøtes RNA oppdaget inkludert viral RNA skjøtes som forventet på de konvensjonelle virusspleiseseter, pluss flere alternativt spleisede RNA. Alternativt spleisede transkripter oppsto fra bestemte provirus, og ble påvist i de fleste av cellelinjene som ble brukt. Kvantitativ RT-PCR ble utført for å vurdere virkningene av ioniserende stråling. Disse analysene viste at Herv-K transkripsjoner ble forhøyet i fire av tolv linjer testet, spesielt alle tre prostatakreft linjer som brukes og en brystkreft linje. Økningene var forbigående, med en topp på 24 timer etter en enkelt dose av gamma-bestråling som varierte 2,5 til 20 Gy, og tilbake til utgangsnivået av 72 timer. Oppsummert disse studiene viste at ioniserende stråling kan påvirke nivåene av Herv-K transkripsjoner i celler, og disse effektene varierer mellom ulike celler. Endringene i Herv-K transkripsjonsnivåer kan påvirke flere biologiske prosesser i cellene, og fremtidige studier av effekten av ioniserende stråling på Herv-K er verdt å forfølge
Citation. Agoni L, Lenz J, Guha C ( 2013) Variant skjøting og innflytelse av ioniserende stråling on human Endogene Retrovirus K (Herv-K) transkripsjoner i Cancer Cell Lines. PLoS ONE 8 (10): e76472. doi: 10,1371 /journal.pone.0076472
Redaktør: Robert Belshaw, Plymouth University, Storbritannia
mottatt: 03.07.2013; Godkjent: 27 august 2013; Publisert: 18 oktober 2013
Copyright: © 2013 Agoni et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet av en NIBIB R01 EB009040 (til CG). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
effekten av ioniserende stråling (IR) på endogene retrovirus (ERVs) er i stor grad ukjent. DNA-genomet til ERVs er integrert i genomet til vertsarter som følge av infeksjoner av kimlinje-celler enn evolusjonær tid. Til dags dato, har virkningene av ioniserende stråling på ERVs blitt undersøkt bare i mus [1], der det har vært kjent i flere tiår at ioniserende stråling kunne reaktiveres mus endogene retrovirus (MERVs) [2] – [4]. Ioniserende stråling påvirker også immunresponser mot kreftceller, og en studie detektert CD8 + T-celler som er reaktive mot et MERV antigen i en murin, bestrålt colon carcinoma modell [5]. Således er det sannsynlig at virkningen av ioniserende stråling på endogent retrovirus ekspresjon kan ha konsekvenser for immunrespons mot tumorceller.
ioniserende stråling har vært rapportert å øke transkripsjonen aktivitet av mange virus, inkludert CMV [6], [7 ], HPV [8] og HIV [9], [10] i infiserte celler. De molekylære mekanismene er fremdeles i stor grad ukarakterisert, selv om det for HIV, har IR blitt rapportert å øke transkripsjon gjennom LTR promoter-aktivering [9], [10]. På klinisk nivå, har studier vist en uventet høy reaktivering frekvensen av latent HBV infeksjon i leverkreft etter strålebehandling [11]. I HPV infiserte celler, har økt produksjon av E6 /E7 transkripsjoner og proteiner vist etter y-bestråling [8]. Ved et klinisk nivå, har økt spesifikke cytotoksiske lymfocytter (CTL) responser mot HPV E6 /E7-antigener blitt påvist i livmorhalskreftpasienter etter strålebehandling [12]. I tillegg til virkningene på nivåer av virus uttrykk, blir ioniserende stråling er kjent for å modulere immunresponser mot kreft [13] – [15]
Endogene retrovirus er til stede i genomet til hver celle i et individ og kan være. mål for immunresponser slik som de mot MERVs [16]. Begge T- og B-lymfocytt svar har også blitt observert mot menneskelige endogene retrovirus (HERVs) [17] – [21]. Mest spesielt, har immunreaksjoner blitt observert mot de sist kjøpte sett av retrovirus i det menneskelige genom, Herv-K [18], [19], [22], [23]. HERVs finnes i det humane genom i form av integrerte retrovirale DNA-genom kalt provirus. Kollektivt de er blitt antatt å omfatte omtrent 8% av det humane genom [24]. I fravær av seleksjonstrykk på verten for å opprettholde disse provirus i en intakt form, mutasjoner uunngåelig samler seg i dem over evolusjonær tid og derved avbryte viral genomisk komponenter og inaktivering av viral smittsomhet. Den HML2 undertype av Herv-K er den eneste retrovirus for å ha kommet inn i genomet av den humane avstamning siden divergens av de humane og sjimpanse slektsnavn forekom ca 6 millioner år siden, [25] – [31]. Fordi det er den mest nylig innført, Herv-K HML2 utgjør den mest intakte sett av retrovirus i det humane genom [25], [32] – [39]. Til tross for det, er ingen individuelle Herv-K førvirus locus kjent at er fullt funksjonell og i stand til å produsere smittsomme viruspartikler, selv rekombinasjon mellom loci eksisterende i dag i det menneskelige genom kan gjenopprette viral smittsomhet [37]. Mange av de Herv-K provirus er tilstrekkelig intakt for å koder for proteiner som kan beholde noe av funksjonaliteten [25], [35], [36], [38], [39], og ekspresjon av disse proteinene har blitt foreslått for å korrelere med sykdommer inkludert kreft [40] -. [44]
Herv-K er transkribert i varierende grad i en rekke menneskelige sykdommer, inkludert kreft [20], [45] – [48], HIV-infeksjon [18], [49 ] – [51] og autoimmune sykdommer [52], [53]. Individuell Herv-K loci i det humane genom forskjellig integriteten av spesifikke åpne leserammer, funksjonaliteten av de kodede proteiner, integriteten av cis-virkende elementer, og eventuelt i egenskap av DNA-sekvenser flankerende virus-DNA til å påvirke transkripsjon. De varierer fra omtrent 97 til over 99% identisk i parvise sammenligninger til hverandre, og mange av forskjellene mellom dem er enkelt basepar-endring. Derfor for å identifisere den spesifikke Herv-K loci uttrykkes i en human prøve, og for å forstå grundig biologiske rolle Herv-K i humane sykdommer, om noen, er det nødvendig å inkludere analyse av virus-transkripter på enkelt nukleotid nivå i en hvilken som helst undersøkelse av dem [54]. Vi har tidligere oppdaget at Herv-K-transkripter i prostatakreftcellelinjer, og det observert at noen av transkripter ble spleiset til uvanlige posisjoner i det virale genomet [55]. Påvisning av variant skjøting av Herv-K transkripsjoner i prostatakreft linjer var uventet. I denne rapporten ble det nukleotid-baserte analysen av spesifikk Herv-K loci som er transkribert og muligheten for uvanlige spleisevarianter utvides til andre typer kreftcellelinjer. Vi testet også hypotesen om at ioniserende stråling kan påvirke nivåer av menneskelige endogene retrovirus K transkripsjoner. Herv-K-proteiner er kjent for å være mål for både T- og B-lymfocyttsvar [17] – [21], [46]. Som et første skritt i retning av å bestemme hvorvidt Herv-K-antigenene kan bli utsatt for bestråling induserte modulering og kanskje utgjøre kandidat mål for anti-tumor, T-celle-basert immunterapi av kreft ved administrering av ioniserende stråling, undersøkte vi hvorvidt ioniserende stråling påvirker nivåene av Herv-K transkripsjoner i ulike kreftcellelinjer.
Resultater
Herv-K transkripsjon i Cancer Cell Lines
Herv-K transkripsjon har blitt rapportert å forekomme i human kreft . Imidlertid har responsen til Herv-K for ioniserende stråling aldri blitt testet i kreft eller normale celler. For å bekrefte Herv-K transkripsjon og etablere et referanse baseline for eksperimenter med IR, vi urfremført revers transkriptase-PCR (RT-PCR) på RNA isolert fra 13 kreftcellelinjer fra kreftformer ofte behandlet med strålebehandling: prostata, livmor cervix, hode hals og bryst. RT-PCR ble utført ved anvendelse av primer-par fra flere deler av det virale genomet som er vist i Figur 1. Primere fra det virale protease (
pro
), polymerase (
pol
) var i stand til å påvise unspliced viral RNA, og konvolutten (
env
) genet primere var i stand til å oppdage både unspliced og enkeltvis spleisede env mRNA. De forventede størrelse produkter ble observert i 12 cellelinjer ut av 13 testet for
pro Hotell og
pol
amplikonene og i 11 cellelinjer for
env
fragment (Fig . 2A). Parallelle RT-PCR ble utført med primere for
GAPDH
genet for å bekrefte nøyaktig sammenlign lasting av RNA til alle prøvene og lasting av geler. Kontroller uten revers transkriptase bekreftet at produktene ble samlet fra RNA-templater og ikke fra potensielt forurensende genomisk DNA (fig. 2).
En genetisk kart over et Herv-K provirus (grå) innsatt i flankerende sekvenser er vertsgenomet vist med en 5 eller 6 bp target dupliseres sekvens (TDS) som er angitt som svarte bokser. Den unspliced primære viral avskrift, enkeltvis-skjøtes
env
mRNA og dobbelt-skjøtes
rec Hotell og
np9
mRNA er vist nedenfor virusgenomet, sammen med enkeltvis skjøtes RNA [56] som ikke er kjent for å kode for hvilket som helst protein. 3 «poly (A) haler er indikert (AAAA). Den 292 nukleotid sletting av type 1 Herv-K provirus spenner over pol-env krysset vises (Δ292). Type 2 Herv-K provirus og deres transkripsjoner inneholder disse nukleotider. Posisjonene av PCR-primerpar er vist ved bunnen som svarte piler med navn som de er identifisert i hele papiret. De grå pilene identifisere primere som brukes for nestet PCR. Den stiplede, vinklet linje viser det utskårede intronic sekvenser som 1X-env og 2X-rec primerpar ble utformet for å krysse. Den primerpar benyttet for kvantitativ RT-PCR er også vist (q-env).
RT-PCR ble utført for å påvise virus-transkripter ved fem forskjellige posisjoner i Herv-K genomet, hvorav to på tvers spleise veikryss for å påvise RNA skjøtes på konvensjonell env mRNA spleise (1x-env) og rec mRNA spleise veikryss. GAPDH RT-PCR ble utført samtidig, og fungerte som en positiv kontroll for RNA integritet og som lasting sammenligning. Produktene ble løst ved hjelp av agarose-gelelektroforese. Genomiske posisjonene til de anvendte primerene er vist i fig. 1. Parallelt kontroller ble utført uten revers transkriptase (-RT) som kontroller for å utelukke DNA-kontaminering. DNA størrelsesmarkører vises til venstre.
Disse data bekreftet at Herv-K transkripsjoner var til stede i de fleste av de menneskelige kreftcellelinjer som ble testet. Det var noen tilfeller hvor Herv-K RT-PCR produktene ikke ble oppdaget (fig. 2). En cervix cancercellelinje, C33A, ikke ga RT-PCR-produkter med hvilken som helst av de tre primerparene, selv om det gi det forventede produkt i
GAPDH
kontroll forsterkning (fig. 2A). En brystkreft cellelinje, MDA-MB-468, konsekvent unnlatt å gi
env
fragment, selv om
pro Hotell og
pol
produktene var til stede (Fig. 2A ). For å øke sensitiviteten, ble en nestet RT-PCR utføres for
env
amplicon bruke primere plassert som vist i figur 1.
env
produktet ble påvist i MDA-MB-468 bryst kreft linje, som den var i 11 andre linjer (fig. 3a). Men det fortsatt var umulig å oppdage i C33A livmorhalskreftceller, noe som indikerer at unspliced og enkeltvis skjøtes Herv-K RNA var ikke til stede på detekterbare nivåer i denne cellelinjen. Parallelle amplifiseringsreaksjoner ble utført uten revers transkriptase og var jevnt negativ, hvilket viser at amplifikasjonen var fra RNA-templater og ikke fra noen potensielt forurensende genomisk DNA (fig. 3).
Nested PCR ble utført på RT-PCR-produktene vist på fig. 2 for å detektere virale transkripter ved tre forskjellige stillinger i Herv-K genom. To av RT-PCR kryss skjøting veikryss for å oppdage RNA skjøtes på konvensjonell env mRNA spleise (1x-env) og rec og np9 mRNA (2X-rec, 2X-np9) spleise veikryss. Produktene ble løst ved elektroforese. Genomiske posisjonene til de anvendte primerene er vist i fig. 1. Parallelt kontroller ble utført uten revers transkriptase (-RT) som kontroller for å utelukke DNA-kontaminering. DNA størrelsesmarkører vises til venstre.
Tilstedeværelse av Herv-K skjøtes transkripsjoner i Kreftcellelinjer
For å vurdere om de Herv-K transkripsjoner har tilstrekkelig integritet for RNA til skjøtes, utførte vi RT-PCR på tvers av de to virus vanlige skjøte veikryss. Flere spleisede Herv-K mRNAer er karakterisert [40], [56] – [58], inkludert enkeltvis spleiset mRNA som koder for env-protein, og tre dobbelt spleisede RNA-er, hvorav den ene som koder Rec, og en annen av hvilke koder for Np9 (Fig . 1). Herv-K HML2 provirus eksisterer som to forskjellige typer kalt type 1 og type 2, avhengig av om et 292 bp strekning av nukleotider er til stede (type 2) eller slettet (type 1). I type 1 provirus fjerner slettingen aminoterminal-koding del av
env Hotell og
rec
, og fører til en i ramme fusjon av
pol Hotell og
env
åpne leserammer (Fig. 1). Omvendt, i type 2 provirus, karboksylenden-koding del av
pol
og at for aminoendene
env Hotell og
rec
er fullt til stede. 3 «spleisesete (3’SS) for
env
mRNA og den første intron av
rec
mRNA ligger oppstrøms av 292 bp strekningen, men 5’SS for andre intron av
rec
mRNA ligger innenfor 292 bp (fig. 1). Dermed type 1 provirus ikke genererer
rec
form av dobbelt skjøtes RNA (Fig. 1) eller kode Rec protein.
Ved hjelp av primere designet for å oppdage enkeltvis-skjøtes
env
mRNA (1X-env, fig. 1) og de to spleise veikryss i dobbelt-skjøtes
rec
eller
np9
mRNA (kalt 2X-rec, fig. 1), 11 ut av 13 cellelinjer ble funnet å være positive med 1X-
env
primere, og 10 ut av 13 ga produkter med de 2X-rec primere (fig. 2B). Påvisning av de spleisede produktene også gitt ytterligere bevis på at RT-PCR produktene ble avledet faktisk fra viralt kodet RNA og ikke fra noen potensielt forurensende cellulær genomisk DNA. Påvisning av flere størrelse produkter med 1X-env primere var uventet.
For å verifisere at uventede størrelse bandene ble avledet fra Herv-K RNA og for å oppnå en bedre oppløsning av PCR produktene band på agarosegel-elektroforese utførte vi nestet PCR (figur 1). Multiple bånd ble igjen observert, og ingen produkter ble detektert i fravær av revers transkriptase, noe som bekrefter at de var avledet fra spleisede viral RNA (fig. 3). PCR produktene ble identifisert for 1X-env amplicon i 12 av 13 cellelinjer og band av tre ulike størrelser ble oppdaget, med prosenter av intensiteten av de tre bandene varierende mellom de ulike linjene. Flere størrelse produkter ble også observert for 2X-rec fragment, inkludert svakt bånd på ca. 500 bp og en fremtredende band av omtrent 250 bp. Begge PCR-produktene var til stede i MDA-MB-468 brystkreft celler, hvilket viser at Spliced viralt RNA var til stede i denne cellelinje. For C33A cervikale kreftceller, ble ingen av de nestede produkter fra spleiset RNA detektert, for derved å bekrefte fravær av detekterbare Herv-K-transkripter i denne cellelinje. Denne analysen også påvist tilstedeværelse av np9 transkripsjoner i fem av de linjene (Fig. 3).
Identifikasjon av Individuell Herv-K Active Loci
Bakgrunnen for påvisning av flere størrelses band RT-PCR i figurene 2B og 3, særlig for 1X-env RT-PCR, var usikker. En mulighet var at de kunne reflektere unike slettinger eller innsett som hadde påløpt bestemt Herv-K loci løpet evolusjonær tid resulterer i endrede størrelse transkripsjoner, og disse bestemte loci var de transkribert i cellelinjene som brukes. En annen var at spleiseseter brukes variert mellom individ Herv-K loci i det menneskelige genom, og dermed resultere i forskjellige størrelse produkter. For å skille mellom disse hypoteser og for å identifisere den bestemte geometriske steder hvorfra transkriptene stammer, PCR-produktene som er vist i figur 2 ble sekvensert. Dette krevde analyse av transkripter på nukleotidnivå fordi provirus er så lik hverandre. Mens individuelle provirus akkumulere unike mutasjoner enn evolusjonær tid, noen av de Herv-K provirus i det humane genom er så nye at de er over 99% identisk, og graden av identitet kan variere i forskjellige deler av det virale genom. Provirus som dannet tidligere i tid har gradvis blitt mer divergerende. Sekvensering av tilstrekkelig lange PCR-produkter kan brukes til å utlede den spesielle virale loci som best samsvarer med de transkriptene, selv når forskjellene er mindre enn ett nukleotid i 100 mellom to bestemte provirus og RNA-transkripter fra dem. Tabell 1 viser 23 av de mest intakte Herv-K HML2 provirus i det menneskelige genom som sekvensene ble sammenlignet [39].
I utgangspunktet
pro
,
pol Hotell og
env
PCR produktene ble direkte sekvensert. Et eksempel på
Pro
sekvenser fra fire cellelinjer som er innrettet med mange av de forholdsvis intakte Herv-K provirus i det humane genom er vist i figur 4. Sammenligning av sekvensene viste at Herv-K-transkripter detektert matchet de deles av menneskelige spesifikke provirus, som viser at de stammer minst overveiende fra undergruppe av Herv-K HML2 provirus som dannet etter de menneskelige og sjimpanse linjene skilt. Ved andre posisjoner, det var flere sekundære topper i sekvenserings chromatographs, noe som indikerer at PCR-produktene var avledet fra blandinger av transkripter fra multiple loci. Tabell 1 oppsummerer de mest dominerende nukleotider ( «mangfold», Tabell 1) på hver av stillingene der flere nukleotider ble entydig observert innenfor
pro
amplikonene. Selv om dette i størst mulig grad samsvarer med den provirus Herv-K102 (tabell 1), var det ikke mulig å skjelne ved denne analysen om dette provirus ble faktisk transkribert, fordi det var også sannsynlig at flerheten sekvensen av en blanding av transkriberte provirus bare sammentreffet matchet dette provirus. Blandingene sekvens varieres i noen grad blant de forskjellige cellelinjer (tabell 1), og ble likeledes observert i de andre deler av det virale genomet (data ikke vist). Mens den innsikten som kan oppnås ved direkte sekvensering av RT-PCR produktene ble dermed begrenset, blandinger gjorde viser at flere provirus ble transkribert mellom de ulike kreftcellelinjer.
I nedre panelet, Herv -K helaftens provirus brukt som referanser for å identifisere loci opprinnelsesland mRNA transkripter vises. På venstre, de store grener av nålevende hominoids vist, sammen med den omtrentlige tider av sin forgrening fra avstamning fører til moderne mennesker i millioner av år siden (MA). Provirus som er satt inn på nøyaktig ortologe stillinger i mennesker og andre hominoids, og dermed er identiske med nedstigningen, indikeres.
For å undersøke mer presist som Herv-K loci ble transkribert, blandinger av RT-PCR produktene ble separert i individuelle sekvenser ved kloning i plasmidvektorer. Dette gjorde også undersøkelser av hva stod for flere størrelse produkter (fig. 2 og 3). Den 1X-
env
RT-PCR-produktene (Fig. 2A) ble hagle klonet inn i plasmidvektorer. For 1X-env-produkter, ble tjuefire individuelle kloner fra hver cellelinje analysert ved hjelp av PCR-screening for å bestemme størrelsen på det klonede fragment. For de forskjellige prøvene, ble 4 til 13 kloner valgt for sekvensering, og resultatene ble sammenfattet i tabell 2. Kloner ble valgt til å omfatte sett av ulike størrelse produkter i hver linje, og dermed antallet ganger en hvilken som helst sekvens ble oppnådd gjorde ikke reflektere sin relative overflod blant de Herv-K transkripsjoner i hver cellelinje. I tillegg ble omfanget av sekvense begrenset til å se på de mest vanlige produkter, og det er sannsynlig at mindre rikelig transkribert provirus ikke ble oppdaget av denne analysen.
Disse analysene identifiserte til sammen seks forskjellige individuell loci Herv-K mellom 12 cellelinjer (tabell 2). To av disse var Herv-K102 og Herv-K108 (heretter provirus er bare identifisert som K102, K108, etc.). Sammen med en tredje provirus, K (I), disse ble detektert i flere cellelinjer (tabell 2). RT-PCR produktene ble også påvist fra tre ekstra provirus, K107, K111, og K117 i ett eller noen få cellelinjer hver. Transkripsjoner fra flere provirus ble påvist i de fleste av linjene. Det er sannsynlig at mer omfattende sekvensering av kloner ville øke antallet Herv-K loci påvist. Fem av loci som ble påvist virus transkripsjoner var human-spesifikke Herv-K provirus, bekrefter at de oppdagede utskrifter i stor grad hentet fra undergruppe av Herv-K HML2 provirus som dannet etter de menneskelige og sjimpanse linjene skilt. Dermed oftest oppdaget Herv-K skjøtes
env
transkripsjoner i den menneskelige kreftcellelinjer ble avledet fra det mest nylig kjøpt undergruppe av retrovirus i det menneskelige genom.
alternativ spleising av Individuell HERV- K Active Loci
Sekvensering av 1X-env RT-PCR produktene viste spleising på de forventede stillinger i Herv-K genomet, men uventet viste også transkripsjoner spleiset på flere områder (figur 5). Den konvensjonelle nettsteder ble oppdaget for type 2 provirus, K108, K109 og K (I), og type 1 provirus, K102 og K117 (Fig. 5). K108 er en av de mest intakte provirus i det humane genom som har full-lengde åpne leserammer for alle virusproteinene [25], [35], og konvensjonelt skjøtes transkripter fra det ble påvist i syv forskjellige linjer (fig. 5). Men fire loci, K102, K (I), K117 og K111, viste uvanlige 1X-env spleisevarianter dannet fra bruk av alternativ 5 «og 3» spleiseseter. De alternative spleiseseter som ble benyttet varierte mellom de ulike provirus (fig. 5). De som ble påvist (Fig. 5) i noen tilfeller matchet konsensus signaler for større eller mindre spliceosomes, mens i andre tilfeller de gjorde ikke (Fig. 5). De fleste av alternativt spleisede transkripter var fra type 1-provirus, men en av dem, K (I), var av en type 2 provirus. Således alternative spleisesetet behandling var ikke utelukkende en følge av fraværet av det 292 bp. K111 er en eldre provirus som dannet før divergens av gorilla avstamning fra menneske-sjimpanse avstamning omtrent 8 millioner år siden [25], [59], men de andre provirus hvorfra skjøtes transkripsjoner ble oppdaget her er human-spesifikke.
de 5 «og 3» deler av en Herv-K provirus vises øverst adskilt av /og /. 5’SS og 3’SS indikere de konvensjonelle spleise områder av Herv-K, og deres posisjoner er merket med svarte sirkler. Posisjonene til de ytre PCR-primerne anvendt for den nestede PCR er vist som piler. Strukturer av env spleiset RT-PCR-produkter fra cellelinjer og provirus er angitt er vist skjematisk nedenfor det virale genom. Stiplede vinklede linjene viser de skåret introner. Røde sirklene viser posisjonene til de sekvensene hvor ukonvensjonell skjøting forekommet. For hvert produkt skjøtes, viser den øverste sekvensen den utledede primærtranskriptet sekvens bestemt fra den for den beslektede genomiske lokuset, og den nederste sekvensen viser sekvensen av RT-PCR-produkt. Røde nukleotider ble sluttet i skjøtes produktet. Gray nukleotider viser endene av de utskårende intronic sekvenser. Stillingen av 292 nukleotid sletting definitiv av type 1-provirus er vist.
Cellelinjene i hvilken de alternative 1X-env-spleiseseter ble oppdaget er oppsummert i tabell 2 og figur 5. For K102, de samme alternative spleiseseter ble oppdaget i seks forskjellige cellelinjer, og for K117, ble de samme stedene detektert i to (fig. 5). Dette antydet at sekvensene av de spesifikke karakterutskrifter (og provirus som de ble avledet) bestemt alternativ spleise bruken av nettstedet. Alternativt spleisede transkripter ble påvist i de fleste av cellelinjene, og i noen tilfeller, ble både konvensjonelle og alternative spleiseseter detektert for bestemte provirus (K102, K (I), og K117). Det er uklart fra denne analysen hvorvidt arten av de celler som har bidratt til de skjøte mønstre observert. I sammendraget, de alternative spleiseseter oppdaget stod for de ulike størrelses band oppdaget i RT-PCR reaksjoner over hele 1X-env spleise (fig. 2 og 3). Men hyppig påvisning av dem, og variasjonen mellom de ulike Herv-K provirus var uventet, og den mulige molekylære biologiske grunnlaget for dem var ukjent.
Sekvensering av de forskjellige størrelser produkter ble også foretatt for PCR utført med primerne for å detektere dobbelt spleisede RNA (data ikke vist). Jo mindre fremtredende, ca 800 bp produkt (Fig. 2B) samsvarer med konvensjonelt skjøtes
rec
mRNA. Nestede PCR bekreftet tilstedeværelsen av rec mRNA i 9 av 13 cellelinjer (Fig. 3). I tillegg sekvensering viste at fremtredende mindre band i figur 2B samsvarer RNA skjøtes fra 5’SS oppstrøms
gag
til 3’SS nedstrøms for andre intron i
rec
mRNA . Dette RNA har blitt beskrevet tidligere [57], men er ikke kjent for å kode noe protein.
ioniserende stråling (IR) Øker Herv-K transkripsjon i Prostate Cancer Cell Lines
Etter å ha fastslått at Herv K ble transkribert i en rekke menneskelige kreft cellelinjer, spurte vi om ioniserende stråling kan endre nivåene av viral transkripsjoner. Kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) ble utført på RNA isolert fra de 12 cellelinjer som viste Herv-K transkripsjon. Celler ved 50% konfluens ble bestrålt i en enkelt eksponering for en
137Cs kilde. Doser av γ-bestråling ble variert ved 0, 2,5, 5, 10 eller 20 Gy, og cellene ved hver dose ble oppsamlet 1, 3, 8, 24 og 72 timer etter bestråling. Den primerpar benyttes designet i
env
, nedstrøms for 292 nucleotide sletting, slik at det registreres både unspliced RNA og enkeltvis-skjøtes env mRNA (Fig. 1). Hvert eksperiment ble utført tre ganger, og tre RT-PCR ble utført replikater på hver av de biologiske replikater.
De fleste av cellelinjene, inkludert de tre livmorhalskreft linjene som ble testet, er de tre hode og nakke tumorer, og tre av de brystkreft linjer viste ingen merkbare forskjeller i nivået av Herv-K-transkripter ved noen dose av ioniserende stråling og når som helst punkt (fig. 6). Men alle tre prostata carcinom cellelinjer viste signifikant økt nivå av Herv-K transkripsjoner (fig. 6). Økningen i de tre prostatakreft cellelinjer var mest tydelig ved 24 timer etter bestråling. Nivåene av viral
env
RNA etter 24 timer ble økt to til åtte ganger i forhold til ubestrålte celler. Ikke-parametrisk, Wilcoxon-rank signerte tester ble utført for å sammenligne målingene ved hver dose av gammastråling med de på 0 Gy, og P-verdier er presentert i tabell 3. Alle de øker i prostatakreftcellelinjer ved 24 timers var signifikante med p-verdier og 0,01. Dermed var de jevnt betydelig i disse linjene, og ble observert ved alle stråledoser som brukes. Noen økning i disse linjene var tydelig i noen av prøvene ved 8 timer etter bestråling, men ikke i det hele 3 timer. Alle de øker var forbigående, siden etter 72 timer etter bestråling, hadde nivåene av Herv-K tilbake til baseline alle doser av γ-bestråling. Generelt, ble det høyeste nivået av induksjon observert ved 20 Gy, den høyeste dosen som brukes, selv om en signifikant økning ble observert ved alle doser, og det ble ikke observert noen korrelasjon mellom spesifikke dosen og den gangers økning blant prostatakreft-cellelinjer.
Genomiske posisjonene til de anvendte primerene er vist i fig. 1. Fem forskjellige ioniserende strålingsdoser ble anvendt (0, 2,5, 5, 10 og 20 Gy), hver anvendt i en enkelt dose, er vist i forskjellige farger ved fem forskjellige tider etter den γ-bestråling (1, 3, 8 , 24 og 72 timer). Gangers endring relativt til 0 Gy for hvert tidspunkt ble oppnådd ved normalisering til 3 husholdningsgener. Linjene representerer hjelp av tre uavhengige RT-PCR replikater utført for hver av de tre eksperimenter. Feilsøylene viser standardavvik.
En av fire brystkreft cellelinjer (MCF-7) viste også en økning i Herv-K RNA-nivåer etter γ-bestråling (Fig. 6) . Kinetikken til økningen var lik det som ble observert i de tre prostatakreftlinjer med en maksimal økning av det seksdobbelte observert 24 timer etter bestråling på 10 Gy behandlede celler. Både 5 og 10 Gy doser overgitt statistisk signifikant økning (tabell 3), og økninger på mer enn to ganger ble observert 8 og 24 timer etter flere forskjellige doser av γ-bestråling, noe som indikerer at det var en beskjeden effekt av γ-bestråling i denne linjen.
i sammendrag, ble nivåene av Herv-K RNA vesentlig øket ved ioniserende stråling i en brøkdel av kreftcellelinjer som ble testet. Økningene var forbigående og nådde en topp på ca 24 timer etter bestråling. Denne effekten ble observert i alle tre prostatakreft cellelinjene som ble testet, noe som tyder på at Herv-K i disse cellene kan være spesielt følsomme for ioniserende stråling.
Diskusjoner
De viktigste funnene i denne studien var at ioniserende stråling økte nivåene av Herv-K-transkripter i enkelte kreftceller, og at virkningene varierte mellom linjene som ble testet. Særlig oppviste alle tre prostatakreftlinjer som ble testet betydelig økte nivåer av Herv-K RNA, som toppet seg ved omtrent 24 timer etter eksponering mot en enkelt dose av γ-bestråling og deretter stilnet. En tilsvarende økning og påfølgende reduksjon ble også observert i en av tre brystkreft linjer.
