Abstract
Endringer i miRNA uttrykket er en vanlig funksjon i tykktarmskreft. De endringer som skjer i overgangen fra normal til adenom og fra adenom til karsinom, har imidlertid ikke blitt godt definert. I tillegg miRNA endringer blant kreft undergrupper av tykktarmskreft har heller ikke blitt tilstrekkelig evaluert. I denne studien undersøkte vi den globale miRNA uttrykket i 315 prøver som inkluderte 52 normal colonic slimhinner, 41 tubulovillous adenomer, 158 adenokarsinomer med dyktig DNA mismatch reparasjon (pMMR) valgt for scene og debutalder, og 64 adenokarsinomer med defekt DNA mismatch reparasjon (dMMR) valgt for sporadisk (n = 53) og arvelig tykktarmskreft (n = 11). Sporadiske dMMR svulster hadde
MLH1
inaktivering på grunn av arrangøren hypermethylation. Unsupervised PCA og klyngeanalyse viste at normal kolon vev, adenomer, pMMR karsinomer og dMMR karsinom var alt klart merkbar. De fleste av mirnas som ble differensielt uttrykte mellom normal og polypper ble også uttrykt forskjellig med en tilsvarende størrelsesorden i forhold til normal til både pMMR og dMMR tumor grupper, noe som tyder på en trinnvis progresjon for transformasjon fra normal tykktarm til carcinoma. Blant mirnas demonstrerer den største kaste opp- eller nedregulert endringer (≥4), fire roman (MIR-31, MIR-1, MIR-9 og MIR-99a) og to tidligere rapportert (MIR-137 og MIR-135b ) mirnas ble identifisert i normal /adenom sammenligning. Alle bortsett fra ett av disse (MIR-99a) viste lignende uttrykk forskjeller i de to normal /karsinom sammenligninger, noe som tyder på at disse tidlige kreft endringene er viktig både i pMMR- og dMMR-avledet kreft. Sammenligningen mellom pMMR og dMMR svulster identifisert fire mirnas (MIR-31, MIR-552, MIR-592 og MIR-224) med statistisk signifikante uttrykk forskjeller (≥2-fold endre)
Citation. Oberg AL , fransk AJ, Sarver AL, Subramanian S, Morlan BW, Riska SM, et al. (2011) miRNA uttrykk i kolon polypper gir bevis for en Multihit modell for tykktarmskreft. PLoS ONE seks (6): e20465. doi: 10,1371 /journal.pone.0020465
Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA
mottatt: 04.03.2011; Godkjent: 26 april 2011; Publisert: 09.06.2011
Copyright: © 2011 Oberg et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra Minnesota Partnerskap for bioteknologi og medisinsk Genomics [Medical Foundation 2006-100412]. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tykktarmskreft kreft~~POS=HEADCOMP (CC) er en av de viktigste årsakene til kreft dødsfall på verdensbasis, med ca 148 000 nye tilfeller rapportert i USA i 2009 [1]. Progresjonen til CC er ansett som en trinnvis prosess med akkumulering av forskjellige genetiske og epigenetiske forandringer som fører til en forandring fra en normal celle til en premalign tumor, og til slutt til en ondartet og metastatisk tumor potensielt (normal til adenom til karsinom sekvens). Foreliggende data viser tydelig tilstedeværelse av heterogenitet i denne sekvensen av hendelser. Disse omfatter: (i) utvikling av ulike typer av forstadier til kreft som villøse adenom, rørformet adenom, tubulovillous adenom, og taggete polypp med antatte forskjeller i molekylære defekter; (Ii) overgang til invasiv kreft demonstrerer svært ulike molekylære forandringer (f.eks svulster med og uten defekt DNA mismatch reparasjon); og til slutt, (iii) utvikling av sporadiske versus forskjellige former av arvelig CC. De underliggende faktorene ansvarlig for heterogenitet, men er fortsatt i stor grad ukjent.
En av de klareste skillene vist så langt for sporadisk CC er basert på tilstedeværelse eller fravær av funksjonelle DNA mismatch reparasjon (MMR) [2] , [3], [4]. Svulster med defekt MMR (dMMR) har blitt identifisert i -20% av sporadisk CC, og er preget av tilstedeværelsen av en bestemt svulst fenotype, betegnes mikro ustabilitet (MSI). I sporadisk CC, har tre forskjellige MSI fenotyper blitt beskrevet: MSS, MSI-L og MSI-H [5]. MSI-H fenotype er assosiert med distinkte funksjoner clinicopathologic [2], [3], [4], blant annet en mer gunstig utfall [6]. Blant sporadisk CC, de fleste av MSI-H tilfeller resultater fra inaktivering av
MLH1
grunn av arrangøren hypermethylation (~95%) [2], [3], [4]. De resterende ~80% av CC med dyktig MMR (pMMR), på den annen side, følger en kromosomal ustabilitet (CIN) bane og er forbundet med en høy frekvens av Aneuploidy og alleliske ubalanse [7].
Selv majoriteten av CC ser ut til å være sporadisk med en gjennomsnittsalder ved diagnose i midten av 60-s, omtrent 15-20% av tilfellene oppstår i løpet av familiære aggregater, med kjente genetiske forhold sto bare for en liten brøkdel av disse. Mens arvelig CC har blitt anerkjent for en stund, har identiteten til gener som er involvert i sykdomsprosessen først nylig blitt identifisert for mange av de arvelige forhold. Den mest utbredte arvelig form for CC er arvelig ikke-polypose Colon Cancer (HNPCC), sto for ~2-3% av alle tilfeller [8].
For HNPCC, germline mutasjoner i DNA MMR-genene er også ansvarlig for denne tilstanden, med
MLH1 Hotell og
MSH2
sto for de fleste tilfellene (~40% hver) og
MSH6 Hotell og
PMS2
regnskap for en mindre andel, -10% og 5%, henholdsvis [2], [8]. Svulster fra disse pasienter er også kjennetegnet ved nærværet av MSI-H og ved tap av MMR protein uttrykk for den aktuelle genet. Således molekyl etiologien av tumorer som involverer dMMR er meget heterogen, som involverer flere forskjellige gener og mange mekanismer for geninaktivering, inkludert epigenetiske, somatiske og kimlinje-forandringer.
Det synes å være minst to betydelige reaksjonsveier som fører til sporadisk og arvelig CC. Den første veien, som involverer dMMR, antas å stamme fra en taggete forløper (fastsittende taggete adenom) og står for all sporadisk MSI-H CC (selv om ikke alle kreftformer som oppstår via taggete veien er MSI-H). HNPCC gir også opphav til MSI-H CC. Den andre veien er tenkt å oppstå fra tubulointerstitiell /villous adenomer og fører til sporadisk CC eller FAP-relatert CC preget av svulst CIN og pMMR. Vår forståelse av disse banene på et molekylært nivå og deres engasjement i overgangen fra normal til polypp til carcinoma, selv forbedring, forblir ufullstendig.
Genome-wide tilnærminger (expression profilering, genome-wide SNP analyser, aCGH, neste generasjon sekvensering) fortsetter å begrense vår forståelse av prosessen med tumorgenese. Oppdagelsen av en voksende klasse av små ikke-kodende RNA, inkludert mirnas, har avdekket en enda større grad av kompleksitet for kreft biologi [9], [10], [11]. microRNAs (mirnas) er 18-24 nt små ikke-kodende RNA-molekyler som hovedsakelig hemmer genekspresjon på post-transkripsjonsnivået [9]. Som mirnas regulere ekspresjonen av et stort antall av protein-kodende gener, er et bredt spekter av biologiske prosesser påvirkes, slik som metabolisme, organogenese, utvikling, og bestemmelse av celle skjebne, inkludert død [10]. Endret ekspresjon av mirnas har også vært forbundet med en rekke humane sykdommer, inkludert kreft [11]. Selv om et økende antall studier har adressert miRNA uttrykket i CC [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], få har blitt publisert på premaligne lesjoner i tykktarmen [21], [22], [23], [24], [25]. Spesielt er rollen til miRNAs i overgangen mellom normal tykktarm og polypp og mellom polypp og kreft ikke forstått.
I denne studien ble global miRNA (735 miRNA mål) uttrykk evaluert i 315 prøver (52 normal colonic slimhinnene og 263 colontumorer) bruker BeadArray ™ plattformen (Illumina, Inc.) [26]. Prøvene som ble valgt for analyse ble kategorisert ved en rekke kliniske og molekylære kriterier for å utforske tumor heterogenitet i mer detalj, for å oppdage biologisk relevante mirnas og for å løse overgangs endringer fra normal til adenom og adenom til karsinom. Tumortyper inkludert tubulovillous adenomer, adenokarsinomer med dMMR valgt for både sporadiske og arvet tilfeller, og adenokarsinomer med pMMR valgt for scene (A, B, C og D) og debutalder (gammel versus ung-utbruddet sykdom).
Metoder
Etikk erklæringen
The Mayo Clinic Institutional Review Board gjennomgått og godkjent for humane studier protokollen tittelen «Identifisering og validering av miRNA Signatur Profiler som Biomarkører for Colon Cancer Progresjon» fra Dr. Stephen N. Thibodeau. Komiteen bemerket at de menneskelige studier aspekter innebære bruk av prøver samlet etter IRB-godkjente protokoller. Utvalget fastslått at samtykkende prosessen åpner for fremtidig bruk av prøvene som eksemplifisert i den aktuelle protokollen. De fleste pasientene gitt skriftlig informert samtykke. For de som ikke gjorde det, ble prøver anonymisert.
Prøvevalg
Prøver fra pasienter med CC eller polypper ble valgt ut fra to separate kreftregistre. Den første innsamling av prøver ble innhentet fra alle pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon for CC i løpet av en treårsperiode 1995-1998 (umerket). Den andre samlingen, startet i 2000, er en pågående samling av biospecimens fra Mayo Clinic i Roche pasienter med kolorektal neoplasi. For senere registeret, har ingen pre-utvelgelseskriterier blitt brukt av registeret, bortsett fra at bare de polypper med en diameter på ≥ 7 mm samles for fremtidig bruk.
Alle vevsprøver ble hurtigfrosset i flytende nitrogen på innsamlingstidspunktet og deretter lagret ved -80 ° C for senere bruk. Normale områder av kolonepitelet ble oppnådd fra enten margin av reseksjon eller nær tumoren. Alle bortsett fra ett av de normale vevsprøver som brukes til denne studien ble matchet med svulster. Endetarms kreft ble ekskludert. Polypper ble evaluert for histologisk type, med bare tubulovillous adenomer valgt for studien. Patologisk svulst staging ble klassifisert i henhold til Dukes «kriterier [27]. Pasient chart anmeldelser har blitt utført for å oppnå kliniske kjennetegn ved svulst, inkludert tumorlokalisering, scene og alder ved diagnose.
Tumor Behandling og RNA Utvinning
Frozen vev ble kuttet på en cryostat å generere hematoxylin og eosin (H E) farget lysbilder. For polypper, områder med minst 50% adenom var makro dissekert. For kreft, områder som inneholder minst 70% neoplastiske celler eller høyere ble makro dissekert. Tissue størrelser som tilsvarer 7 mm
2 og 10 mikron tykt ble seksjonert og plassert i en ampulle inneholdende 400 pl av RLT-buffer (Qiagen, Chatsworth, CA) med 4 pl av β-merkaptoetanol. Beholderen ble deretter lagret ved -80 ° C inntil benyttes for RNA ekstraksjon ved hjelp av TRIzol® LSTrizol © (Invitrogen, Corp., Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner.
DNA MMR Status
de fleste tumorer med defekt DNA-reparasjon mismatch som er valgt for dette studiet var de samme som de som tidligere er rapportert over, og har blitt grundig karakterisert [28]. Tumor MSI ble vurdert ved å sammenligne tumorsammenkoblet og normal slimhinne DNA isolert (Qiagen DNA-ekstraksjon kit) fra formalinfiksert, parafin-innleiret (FFPE) materiale med bruk av 3-18 mikrosatellittmarkører, slik som tidligere beskrevet [28]. Svulster ble klassifisert som MSI-H hvis ≥30% av markører demonstrert ustabilitet, MSI-L hvis. 30% demonstrerte ustabilitet, og MSS hvis ingen av markørene demonstrerte ustabilitet
Immunhistokjemisk (IHC) analyse for protein ekspresjon ble utført på FFPE-prøver for MLH1 og MSH2 (alle tilfelle) og MSH6 og PMS2 (undergruppe), som tidligere beskrevet [29]. DNA dMMR ble definert ved nærværet av MSI (MSI-H) og /eller fravær av protein uttrykk for MLH1, MSH2, MSH6 eller PMS2. DNA pMMR ble definert av fravær av høye nivåer av mikrosatelitt ustabile (MSS /MSI-L) og ved nærvær av normale protein uttrykk for MLH1, MSH2, MSH6 og PMS2.
Tumorer med dMMR viser et fravær av MLH1 ble videre testet for å finne årsaken til genet inaktivering, dvs. epigenetisk (sporadisk) versus germline (arvet). Enten en metylering-spesifikk PCR-baserte assay, eller en HpaII enzym digest baserte analysen ble anvendt for å teste for-promoteren hypermethylation [30]. I tillegg ble en PCR-basert assay for endringer innenfor V600E mutasjon i BRAF også utført. MLH1 tilfeller demonstrerer
MLH1
promoter hypermethylation ble klassifisert som sporadisk (dMMR1). MLH1 tilfeller med villtype BRAF og uten
MLH1
promoter hypermethylation ble klassifisert som germline (dMMR2). Saker MSH2, MSH6 eller PMS2 (ved tap av protein uttrykk ved IHC eller kimcellelinje testing) ble også klassifisert som germline (dMMR2).
miRNA profilering
Globalt miRNA (735 miRNA mål) ekspresjon ble evaluert ved bruk av BeadArray ™ plattformen (Illumina, Inc.) i det vesentlige som beskrevet av Sarver et al. [16]. For hver prøve ble testet, ble 200 ng av total RNA benyttes for analysen.
Statistical Analysis
Studiedesign.
Separate randomisering ordningene ble opprettet for å bestemme rekkefølgen av vev cryosectioning, RNA ekstraksjon og tildeling av prøvene til 96-brønns Sentrix Array Matrix (SAM) plater for å sikre at vareprøve grupper av renter og demografiske karakteristika var godt balansert over flere potensielle eksperimentelle effekter.
kvalitetsvurderinger.
det er totalt 336 vevsprøver (281 svulster og 55 prøver normalt vev) fra 282 forsøkspersoner ble først testet med Illumina plattform. For 54 av pasientene ble både normalt og tumorvev oppnådd fra det samme individet (tabell 1). For kvalitetskontroll formål, ble 8 prøver testet i en ytterligere tid og 5 prøver ble testet ytterligere tre ganger (test for reproduserbarhet), noe som resulterer i totalt 23 gjentatte prøver som ble testet (total testet = 359). Tjuefem flere negative og skjære kontroller ble også benyttet for å vurdere generelle kvaliteten.
I tillegg til laboratorie kvalitetskontroll vurderinger, ble global kvalitet og bias vurdert gjennom flere plotting teknikker. Alle analyser ble utført på log
2 skala og resultatene blir presentert på fold-endring skala. Box-and-whisker tomter ble brukt for å vurdere globale gjennomsnitts skift i miRNA distribusjon eller konsentrasjon mellom prøver og Sams. Parvis minus gjennomsnittet (MVA) tomter for to prøver versus, definert som den per-probe forskjell mellom de to prøvene (vertikal akse) versus den per-probe gjennomsnitt (horisontal akse) for de to prøvene [31], ble brukt til å vurdere avtalen mellom tekniske replikater. Rest MVA plott for en gitt prøve, definert som forskjellen mellom det prøven og gjennomsnittet av alle prøvene (vertikal akse) som funksjon av gjennomsnittet av alle prøver (horisontal akse) [32], ble brukt for å vurdere om eksistensen av og funksjonell form av , for eksempel, (non) linearitet skjevheter som en funksjon av overflod. Plott av prinsipal komponent analyse (PCA) Resultatene ble brukt til å undersøke (dis) likheten av prøver til negative kontrollprøver og eksistensen av SAM-effekter. Boksplott og prikkplotter ble brukt for å vurdere arten og konsistensen av pr-probe SAM effekter. Deteksjon priser ble vurdert for hver prøve, med sonde gjenkjenning definert som p-verdier. 0,01
Basert på disse kvalitetsvurdering analyser, totalt 21 av de 359 prøvene (inkludert noen paralleller) ble fjernet fra videre studere. Tolv ble funnet å være mer like i uttrykket distribusjon til negative kontrollprøver basert på boksplott, deteksjon priser og PCA-plott og en prøven hadde en ekstremt høy, men smalt spekter av uttrykk. Ytterligere syv prøvene hadde tydeligvis ulike gulv og tak virkninger i rest MVA tomter og gruppert nærmere de negative kontrollprøver i PCA. En tilleggsutvalget ble eliminert, siden det var den eneste i sin klasse. Dermed var det 338 prøver (318 unike og 20 replikater) fra 268 emner som gjenstår for analyse.
Forbehandling.
overflod fordelingen av 735 miRNA og 20 kontroll sonder spredte et bredt spekter, med 40% -60% av sonder påvist i prøver som passerer kvalitetsvurdering (ved hjelp av en 0,01 deteksjon p-verdi terskel). I tillegg var det ingen
a priori
grunn til å forvente en asymmetrisk fordeling av endringer [16]. Dermed ble de 338 prøvene som passerer den innledende kvalitetsvurdering normalisert sammen via quantile normalisering [31]. Post-normalisering rest MVA plott viste at gjennomsnittlig ikke-lineær skjevhet ble fjernet. Imidlertid plott av PCA Resultatene viste at en SAM virkning forble. estimater kontrast og prikkplotter avdekket at, mens det var nesten ingen SAM effekt for de fleste av sonder, en håndfull viste forandringer opp til to ganger mellom Sams som var konsistente på tvers av alle prøvene på hver SAM og ble ikke drevet av uteligger poeng. Det vil si, konsekvent SAM-by-probe interaksjoner ble observert. Dermed ble rester fra lineære modeller med SAM i modellen passer på en per-probe grunnlag for å quantile normaliserte data brukes som de endelige normaliserte, SAM-justerte tall. Disse lineære modeller ga resultater innen desimal støv av empiriske Bayes metoder ettersom utvalgsstørrelsen er stor [33].
Rest MVA tomter, boksplott og pr-probe prikkplotter viste ingen trend over tid for en prøve servering som en klippe kontroll med vev kutte syv ganger i løpet av de to månedene det tar å behandle alle de vevsprøver. Rest og parvise MVA tomter viste god generell enighet mellom tekniske replikater plassert på forskjellige Sams. Den største effekt som observeres SAM var 2,33 ganger (log
2 målestokk forskjell på 1,22), og kun en håndfull av sondene var SAM effekter av 2-fold. 91,5% (691/755) av sonder hadde SAM effektestimater. 1,2 ganger
Per-probe deteksjon priser sammen med plott av per-sondere standardavvik (SD) over alle normaliserte prøver (n = 338 ) sammenlignet med gjennomsnittlig ekspresjon i løpet av alle normaliserte prøvestykker viste tydelige gulv og tak effekter i overflod fordeling. A per-sonde terskelen SD av ≤0.4 i disse prøvene på log
2-skala ble anvendt for å filtrere ut «ikke-informative» prober på en måte agnostisk til gruppe [34]. Dette resulterte i 123 prober med 0% deteksjon priser, 37 mettet prober, og 376 mid-overflod sonder med lav SD blir filtrert ut, forlater 199 informative prober med et SD . 0.4
Differensial uttrykk
Per-probe lineære blandet effektmodeller med kontrast uttalelser ble brukt for å vurdere differensial uttrykk ved hjelp av kvantilregresjoner normalisert, SAM-justerte tall. Faget ble inkludert som en tilfeldig effekt for å gjøre rede for sammenhengen mellom flere observasjoner per gjenstand (tekniske replikater og sammenkoblede natur av alle, men en normal prøve). En SAM virkning ble inkludert i modellen for å ta hensyn til de frihetsgrader som brukes i per-sonde fjerning av SAM virkning. Utdeling av p-verdier og falske funnrate [35], [36] (beregnet basert på modellresultater for alle 735 miRNA sonder) ble brukt til å gi en generell følelse av om sanne forskjeller. Faktisk betydning ble vurdert ved hjelp av mer konservative Bonferroni korrigert p-verdier basert på 0,05 /735 = 6,8 × 10
-5 for hver sammenligning sammen med fold-endring cutoffs å innlemme biologisk betydning. Seks hovedgrupper ble sammenlignet: normal, polypp, pMMR1 (gamle debut), pMMR2 (unge debut), dMMR1 (sporadisk) og dMMR2 (germline). Andre sammenligninger inkludert pMMR1 Stages B, C og D (Stage A med n = 3 ble utelatt av denne sammenligningen på grunn av lite utvalg størrelse), samt pMMR1 MSS og MSI-L-grupper.
Justere variabler ble inkludert eventuelt å unngå mulige konfunderende med histologi. Tumorstadium ble inkludert som en kovariat i modeller som vurderer forskjeller mellom tumortyper for å justere for eventuelle ubalanser av sykdomsgrad på grunn av scenen. Plassering i tykktarmen ble ikke inkludert som en kovariat i modeller som sammenligner pMMR og dMMR svulster som dette ble ansett for å være en del av biologien av svulstene. Det er ingen kovariater ble inkludert i modeller som sammenligner polypp eller normale grupper med andre grupper siden hverken stadium eller plassering i tykktarmen er relevante for disse gruppene.
visualisering av data.
Visualisering for tilstedeværelse av globale effekter ble oppnådd gjennom uten tilsyn clustering og PCA utnytte unike vevsprøver bare (318 av 338 prøver); de tekniske replikater ble ekskludert fra disse analysene. For prøver med flere tekniske replikater, de replikere prøven merket «1» ble valgt. PCA-analyser ble utført på per-probe bety sentrert og SD-skalert data ved hjelp av Partek [37] og R-funksjonen prcomp [38]. Unsupervised clustering analyser ble utført på pr-probe median-sentrert data i Partek å bruke Pearsons ulikhet matrise for beregning av avstander mellom enkeltprøver og gjennomsnittlig kobling metode for beregning av avstander mellom to klynger. Poeng eller prøve etiketter ble farget på tomter med kjent klinisk gruppere informasjon.
Resultater
Sample egenskaper
Etter omfattende kvalitetsvurdering av miRNA profilering resultater (se Methods), 338 vevsprøver fra 268 pasienter ble benyttet for videre analyse. Normal og tumor vevsprøver (ikke inkludert noen av de tekniske replikater) inkludert 52 normal colonic slimhinner, 41 tubulovillous adenomer, 158 adenokarsinomer med pMMR valgt for trinn (3 Stage A, 72 Stage B, 43 Stage C og 30 Stage D) og alder for debut (148≥50 år versus 10 50 år), og 64 adenokarsinomer med dMMR valgt for både sporadisk (53 dMMR1) og arvet CC (11 dMMR2) som beskrevet i tabell 1.
Alle saker med sporadisk dMMR (dMMR1) hadde
MLH1
inaktivering på grunn av arrangøren hypermethylation. Den arvet dMMR gruppe (dMMR2) var sammensatt av saker som har: (i) en kjent germline mutasjon i enten
MLH1 product: (n = 1) eller
MSH2 product: (n = 3); eller (ii) tap av protein uttrykk for MSH2 (n = 3), MSH6 (n = 2) eller PMS2 (n = 2) ved IHC og antas å ha en mutasjon kimlinje i disse genene. Flere tilfeller med dMMR var ikke lett å kategorisere (dMMR3) og på grunn av det lille antallet, disse ble eliminert fra videre analyse. Av de 268 forsøkspersoner, 119 var kvinner og 149 var menn.
Globalt miRNA uttrykk forskjeller mellom normal tykktarm, adenom og karsinom
PCA og hierarkisk klyngeanalyser, begge uten tilsyn, ble brukt til å visualisere miRNA uttrykk mønstre til stede på et globalt nivå i vår uttrykk datasett. Totalt var det et klart skille mellom grupper bestående av normale, adenom, pMMR1 og dMMR1 stammer vev når undersøkt av både uten tilsyn PCA (figur 1A) og hierarkisk clustering (figur 1B) ved hjelp av sett av 199 «informative» prober oppnådd som beskrevet i metoder. Av interesse er imidlertid hierarkisk clustering også antyder tilstedeværelsen av to sub-populasjoner for dMMR1 gruppe av tumorer, som ser ut til å være drevet av en klynge av mirnas (flertallet fra kromosom 14) som viser lav ekspresjon i en gruppe og høy ekspresjon i den andre (angitt med pil på figur 1B).
(A) plott av hovedkomponentene fra PCA-analyser. Horisontale akse svarer til hovedkomponent 1 (PC1), vertikal akse tilsvarer PC2, dybde aksen tilsvarer PC3. Den prosentvise variasjon forklares ved en bestemt PC er indikert i aksen. Poeng blir farget av gruppen status med blå representerer normal epitel, lilla representerer polypp, grønn representerer pMMR1 og rødt representerer dMMR1. To forskjellige orienteringer er gitt. (B) Unsupervised hierarkisk clustering av miRNA profiler ved hjelp av sett av 199 «informative» prober oppnådd som beskrevet i metoder. Prøver er angitt langs den horisontale aksen og inkluderer normal tykktarm, adenomer, pMMR1 karsinomer og dMMR1 kreft med gruppemedlemskap indikeres av fargelinjen mellom dendogram og kart varmen. mirnas er angitt med den vertikale aksen. Fargen bar under indikerer nivået av uttrykk.
De globale miRNA uttrykk mønstre ble så visuelt undersøkt i ulike forhåndsdefinerte tumor undergrupper for å finne ut om disse kan skilles. PCA-plott for disse analysene er vist i figur 2 (data ikke vist for den hierarkiske klyngen analyser). Innenfor pMMR1 gruppen av svulster, var det ingen åpenbare forskjeller basert på scenen, enten på tvers av alle tre faser eller mellom to etapper (Stage A ikke inkludert på grunn av små tall), eller på grunnlag av kjønn. I tillegg ingen separasjon av gruppene var synlig mellom svulster med en eldre debutalder (≥50 y /o, pMMR1) og de med en yngre debutalder ( 50 y /o, pMMR2). En analyse av tumorer innenfor hver av de to dMMR undertyper, dMMR1 (somatisk) versus dMMR2 (germline), viste også ingen merkbar forskjell.
horisontal akse tilsvarer hovedkomponent 1 (PC1), tilsvarer vertikale aksen til PC2 og dybde aksen tilsvarer PC3. Poeng blir farget av gruppestatus. Den prosentvise variasjon forklares ved en bestemt PC er indikert i aksen. (A) pMMR1 evaluert av Dukes stadium; (B) evaluering av debutalder (pMMR1 – gamle og pMMR2 – ung). (C) evaluering av 2 grupperinger av dMMR tilfeller (dMMR1 – epigenetisk forstummet MLH1 og dMMR2 – kimcellelinje); (D) de pMMR1 gruppene MSI-L og MSS svulster. Farger for hver av gruppene som sammenlignes er vist i øvre høyre legenden boksen.
Fordi svulster er ofte klassifisert etter sin MSI status (MSS, MSI-L og MSI-H), disse tre gruppene ble videre undersøkt for uttrykk forskjeller sammen, så systematisk i par. Som forventet, MSI-H gruppe (definert som dMMR) gruppert separat fra både MSI-L og MSS grupper (begge definert som pMMR). Men MSI-L og MSS gruppene viste ingen merkbar forskjell (figur 2).
Differensial uttrykk mellom normal tykktarm, adenom og karsinom
Vi gjennomførte gruppebaserte statistiske sammenligninger på en sonde by-probe basis ved hjelp av lineære modeller for flere forhåndsdefinerte analyser i et forsøk på å identifisere statistisk signifikant forskjellig uttrykt miRNAs. Total, sterkt ble observert signifikante forskjeller mellom flere av gruppene for bestemte mirnas ved hjelp av en Bonferroni korrigert p-verdi terskel for betydning (6,8 × 10
-5). Tabell 2 gir et tall for miRNAs demonstrerer betydelig uttrykk fold endringer på varierende tidsavgrensninger (≥2.0 og ≥4.0). Tabell 3 viser de ni statistisk signifikant forskjellig uttrykt mirnas med størst ganger endring (endring av ≥4), mens figur S1 viser prikkplotter for hver av disse blant de ulike vev undergrupper.
endringen i uttrykket nivå som oppstår i normal til adenom til karsinom sekvens for hver av de ni mirnas kan tydelig ses på fig S1. Fem av de ni viser konsistente endringer på tvers av alle grupper i forhold til det normale, med MIR-135b og MIR-31 oppregulert og MIR-1, MIR-137 og MIR-9 nedregulert i alle prøvene. HS_29 er oppregulert i alle de karsinom, men ikke i polypper, MIR-552 og miR592 er oppregulert i polypper og pMMR svulster, men ikke de dMMR svulster, og til slutt, miR99a er nedregulert i polypper med middels nivå i både pMMR og dMMR kreftgrupper.
Bruke Bonferroni P-verdi terskel sammen med en fold endring i uttrykket nivået av ≥2, totalt 54 miRNAs ble identifisert blant de ulike sammenligningene (Tabell 2, Tabell S1). Tretti en miRNA ble uttrykt forskjellig mellom normal tykktarm vev og adenomer. En sammenligning av normal tykktarm vev til de to viktigste karsinom grupper (pMMR1 og dMMR1) identifisert 31 og 28 betydelige mirnas henholdsvis utnytte disse kriteriene. Til slutt ble 6 og 11 signifikante mirnas identifiseres når adenomer ble sammenlignet med de to gruppene karsinom. Varmen kart, som er vist i figur 3, viser den relative uttrykk forskjellene i disse mirnas mellom gruppene blir undersøkt.
Prøvene er angitt langs den horisontale akse og omfatter normal tykktarm, adenomer, pMMR karsinomer (1 og 2 kombinert ) og dMMR karsinom (1 og 2 kombinert) med gruppemedlemskap indikeres av fargelinjen mellom dendogram og kart varmen. mirnas er angitt med den vertikale aksen. Fargen bar under indikerer nivået av uttrykk.
Av interesse, de fleste (23 av 31) av miRNAs som ble uttrykt forskjellig mellom normal og adenom med fold endringer av ≥2 ble også forskjellig uttrykt i sammenligningen av normal til både pMMR og dMMR vev-grupper, for eksempel MIR-135b og MIR-31 (tabell S1). I tillegg, nivåer og retningen av endringene i forhold til det normale for de fleste av disse var konsistente mellom adenom og carcinoma. I tillegg til likhetene angitt for adenom og karsinom-grupper, men forskjeller i ekspresjon ble også identifisert. Av de 43 mirnas som var signifikant forskjellig uttrykt med fold endringer av ≥2 i de to kreftgrupper, gjorde 20 ikke oppfyller disse kriteriene i polypp gruppe (f.eks MIR-375, mir-147, etc.), selv om flere andre mirnas hadde betydelige men mindre nivåer av uttrykk forskjell i polypp gruppe (f.eks MIR-188-5p, MIR-210) (tabell S1). Når svulsten gruppene ble sammenlignet direkte til polypp gruppen ble 20 mirnas identifisert; 9 oppregulert (f.eks MIR-483-3p, miR34b) og 11 nedregulert (f.eks MIR-552, MIR-592).
Selv om PCA og klyngeanalyse var i stand til å skille pMMR1 og dMMR1 undergrupper (figur 1), var det overraskende få mirnas som ble signifikant forskjellig uttrykt mellom disse to gruppene (Tabell 2 og Tabell S1). Bare fire mirnas (MIR-31, MIR-224, MIR-552, MIR-592,) ble funnet på en 2 ganger endring eller høyere. Som bemerket for adenom sammenligninger, de fleste av mirnas som ble differensielt uttrykte mellom normal tykktarm vev og pMMR1 gruppe med brette forandringer ≥2 ble også forskjellig uttrykt i sammenligningen av normal colon vev til vev dMMR1 gruppe. Igjen, nivåer og retning av disse endringene i forhold til normalt for de fleste av disse miRNAs var konsistente mellom disse to sammenligninger (tabell S1).
En rekke ekstra forhåndsplanlagte sammenligninger viste minimale forskjeller mellom spesifikke undergrupper.
