Abstract
Glioblastoma ( GBM) er den vanligste primær hjernesvulst, og står for ca 40% av alle sentralnervesystemet maligniteter. Til tross for standard behandling som består av kirurgisk reseksjon, strålebehandling og /eller kjemoterapi, er prognosen for GBM dårlig; med en median overlevelse på 14,6 måneder. Kreften stamcelle eller kreft-initiere cellemodell har gitt et nytt paradigme for å forstå utvikling og tilbakefall av GBM etter behandling. Berbamine (BBM) er en naturlig forbindelse avledet fra
Berberis amurensis
anlegget, og sammen med dets derivater, har vist seg å utvise antitumor aktivitet i flere kreftformer. Rapporterte vi at et nytt syntetisk berbamine derivat, BBMD3, hemmer cellenes levedyktighet og induserer apoptose av kreft stilk-lignende celler (cscs) i en tids- og doseavhengig måte når cscs fra fire pasienter (GBM PBT003, PBT008, PBT022 og PBT030) ble dyrket. Disse cscs vokste i Neurosfærene og uttrykte CD133 og nestin som markører. Behandling med BBMD3 ødelagt neurosfærene morfologi, og førte til induksjon av apoptose i cscs. Induksjon av apoptose i disse cscs er avhengig av aktivering av kaspase-3 og spaltning av poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). MikroRNA-4284 (MIR-4284) ble vist å være over-uttrykt ca 4 ganger i cscs følgende BBMD3 behandling. Videre transfeksjon av syntetisk anti-sense oligonukleotid mot humant MIR-4284 delvis blokkert av kreft effekter av BBMD3 på GBM avledet cscs. BBMD3 også økt fosforylering av c-Jun N-terminal kinase (JNK) /spenning-aktivert proteinkinase (SAPK), noe som resulterer i en økning ekspresjon av fosforylert c-Jun og total c-Fos; de viktigste komponentene i transkripsjonelle faktor AP-1. JNK-c-Jun /AP-en signalveien spiller en viktig rolle i induksjon av apoptose i respons på UV-bestråling og noen medikamentell behandling. Målrette glioblastom stilk-lignende celler med BBMD3 er derfor roman, og kan ha løftet som en effektiv terapeutisk strategi for behandling av GBM pasienter
Citation. Yang F, Nam S, Brown CE, Zhao R, Starr R, Horne DA, et al. (2014) A Novel berbamine Derivative Hemmer Cell Livskraftig og induserer apoptose i kreft Stilk-lignende celler of Human glioblastom via oppregulering av miRNA-4284 og JNK /AP-1 Signa. PLoS ONE 9 (4): e94443. doi: 10,1371 /journal.pone.0094443
Redaktør: Jeffrey K. Harrison, University of Florida, USA
mottatt: 12 november 2013; Godkjent: 17 mars 2014; Publisert: 14 april 2014
Copyright: © 2014 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Midler til studien ble gitt av en bevilgning fra National Institutes of Health /National Cancer Institute # CA-1155674 til RJ og oppstart midler til RH fra Beckman Research Institute. Forskning rapportert i denne publikasjonen inkludert arbeid utført i translasjonell biomarkører Core, som er støttet delvis av National Cancer Institute of National Institutes of Health i henhold award nummer P30CA33572. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Glioblastoma (GBM) er den mest vanlige og dødelige primær hjernesvulst. Til tross for fremskritt i omløps multimodalitet terapi, som omfatter kirurgi, stråling og kjemoterapi, gjenstår prognose svært dårlig for pasienter, som typisk har en median overlevelsestid på mindre enn 15 måneder [1], [2]. Flertallet av GBM lesjoner raskt utvikle seg fra en mindre ondartet forløper lesjon hvor det er liten eller ingen klinisk radiologisk eller morfologiske tegn, og det har vist seg at en sterkt tumorigen subpopulasjon av kreftceller, kalt GBM stamceller, fremmer resistens overfor kjemo- og radio- terapi [3] – [5]. Disse kreft stamceller eller tumor-celler initierer dele noen viktige egenskaper med normale neuralstamceller, inkludert ekspresjon av flere biomarkører, og evnen til selvfornyelse, differensiering og proliferasjon. På grunn av dårlig prognose for GBM pasienter etter tilgjengelige behandlinger, utvikling av mer effektive protokoller for behandling av GBM er stort behov for. Men fremgang bremse protokoll utvikling er fortsatt avhengig av ytterligere forbedring av vår forståelse av prosessene som kjører kreft invasjon, utbruddet av resistens mot terapeutiske intervensjoner og mekanismer som driver tumor tilbakefall i GBM pasienter. Således krever den effektive behandling av GBM GBM direkte rettet mot disse stamcellene i tumormassen, ettersom de er de celler som er resistente overfor standardbehandling [6]. I denne forbindelse, Brown et al [7] nylig gitt en begrunnelse for å utvikle et immunterapeutisk tilnærming for å utrydde GBM stamcelle befolkningen ved å rapportere at menneskelig svulst stammen /initierende celler fra GBM pasienter kunne bli anerkjent og drept av CD8
+ cytotoksiske T-lymfocytter.
i tillegg til dette immunologisk metode, mikroRNA (miRNA), som er en relativt ny klasse av små ikke-kodende RNA-molekyl som finnes i eukaryote celler, er blitt vist å regulere et bredt spektrum av genekspresjon mønstre via en post-transcriptional mekanisme [8]. Og en betydelig mengde bevis tyder nå på at mirnas spiller nøkkelroller i patogenesen av kreft, og kan fungere enten som onkogener eller tumor-suppressorer [9]. Det har også blitt rapportert at høy ekspresjon av MIR-196 og miR10b i GBM pasienter som korrelerer med en dårlig prognose [10], og som nedregulering av MIR-128 fører til reduksjon i den selvfornyelse evne gliom stamceller ved å hemme Bmi1 genuttrykk. Dermed er mirnas raskt voksende som lovende mål for utvikling av nye, men svært selektive kreft terapeutiske midler.
For flere år siden, berbamine (BBM), en naturlig bis-benzylisoquinoline alkaloid, ble identifisert fra tradisjonell kinesisk medisin
Berberis amurensis
, og sammen med flere av dets derivater, ble rapportert å ha sterk antitumoraktivitet mot lymfom, myelom, leverkreft, lungekreft og brystkreft og lav ikke-spesifikk toksisitet [12] – [16] . BBM ble rapportert å indusere apoptose i humane myelom, og for å undertrykke vekst, migrering og invasjon av svært metastatiske humane brystcancerceller ved å inhibere NF-kappaB (NF-kB) aktivitet og nedstrøms mål, for eksempel cyklin D1, Bcl-xL og survivin [13], [14]. Dermed lav ikke-spesifikk toksisitet av BBM, og noen av dets derivater, som gjør videreutvikling av disse nye forbindelser potensielt lovende som effektive anti-cancer medikamenter for en rekke typer av kreft. Mot dette målet, vår lab undersøkt tretten nye BBM derivater (BBMDs), som ble syntetisert fra naturlig BBM. Vi fant at BBMD3 er den mest potente av denne serie nye BBMDs for å drepe kreftceller. BBMD3 utstilt over en 6-dobling i anticancer aktivitet mot melanom og prostata kreft celler i forhold til naturlig BBM. Dette ble tilskrevet inhibering av JAK2 /STAT3 signalveien [17]. Nylig rapporterte vi også at BBMD3 hemmer celle-levedyktighet, og induserer apoptose i humane osteosarkomceller, som i dette tilfelle ble tilskrevet aktivering av JNK /AP-en signalveien [18].
super av mitogenaktiverte proteinkinaser (MAPK) omfatter: c-Jun N-terminal proteinkinase (JNK) /spenning-aktivert proteinkinase (SAPK); p38; og ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK). Generelt, JNK og p38 er viktige mediatorer av den reaksjon på stress og inflammasjon, mens ERK-kaskaden er oftest indusert i respons til vekstfaktor stimulering [19], [20]. JNK-reaksjonsveien spenning deltar i mange forskjellige intracellulære prosesser, herunder cellevekst, differensiering og apoptose transformasjon [21], [22]. De JNK proteinkinaser er kodet av tre gener, hvorav
Jnk1 Hotell og
JNK2
uttrykkes ved alle vev, og
JNK3
genet er begrenset til et mer begrenset mønster av uttrykk slik som i hjerne og hjerte [22]. JNK ble opprinnelig identifisert ved sin evne til spesifikt å fosforylere transkripsjonsfaktoren c-Jun på sin N-terminale transaktiveringsdomenet til Ser63 og Ser73 [23]. c-Jun er en viktig komponent av aktiverende protein-1 (AP-1), som er en dimer transkripsjonen faktor, og er sammensatt av proteiner fra flere genfamilier [24]. Selv om JNK /c-Jun eller JNK /AP-1 veien har to roller i apoptose, er det klart at aktivering av JNK-reaksjonsveien er involvert i induksjon av apoptose av spesifikke celledøds stimuli, som for eksempel UV-bestråling og behandling med bestemte medikamenter [25] -. [27]
i foreliggende undersøkelse, viser vi at en ny syntetisk BBM-derivat (BBMD3) induserer apoptose i cancer stilk-lignende celler, som er dyrket fra GBM pasienter. Vi viser også at celledreping er knyttet til oppregulering av miRNA-4284 og JNK /AP-1 signalveien.
Materialer og metoder
Reagenser og antistoffer
BBMD3 ble syntetisert ved å omsette naturlig BBM med NH
2-holdige substituenter. Strukturen og renheten av produktene ble analysert ved hjelp av NMR-spektroskopi. BBMD3 viste over 98% renhet ved NMR-analyse. Menneskelige miRNA hemmere (syntetiske oligonukleotider) mot HSA-miRNA-4284 og har-miRNA-27a ble kjøpt fra GeneCopoeia. RNAiFect Transfeksjon reagens ble kjøpt fra Qiagen Inc. Rekombinant human epidermal vekstfaktor (EGF) og fibroblast vekstfaktor enkel (FGF) ble oppnådd fra R D Systems Inc., og Accutase ble kjøpt fra Innovative Cell Technologies. B-27 serum-fritt supplement (50X) for vekst og vedlikehold av neuroner ble oppnådd fra Gibco. Heparin (1000 enheter /ml) ble kjøpt fra APP Pharmaceuticals, LLC. Pepperrot peroksidase-merket anti-mus og anti-kanin sekundære antistoffer ble kjøpt fra GE Healthcare. Anti-nestin antistoff ble kjøpt fra EMD Millipore. Alle andre antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling, Inc.
cellekulturer
GBM eksemplarer brukt i denne studien, (ble evaluert av en behandlende nevropatologen, og tildeles en grad IV klassifisering ved hjelp av World Health Organization (WHO) etablerte retningslinjer), ble innhentet fra pasienter som gjennomgår kirurgisk behandling på City of Hope Medical Center, i henhold til Institutional Review Board (IRB) -godkjent protokoller. Vevsprøver ble gitt unik pasient hjernesvulst (PBT) tall, (dvs. PBT003, PBT008, PBT022 og PBT030). GBM neurosfære (NS) kulturer ble dyrket og ekspandert som beskrevet tidligere [7]. Kort sagt ble NS kulturene opprettholdt i neurale stamcellemedium (DMEM /F-12), supplert med 01:50 B27 serumfritt supplement, 20 ng /ml EGF, 20 ng /ml FGF enkel og 0,84 enhet /ml heparin. Normale humane neurosfærer eller ikke-maligne neurosfærer ble dyrket fra humant føtalt hjerne vevet under samme dyrkingsbetingelser som GBM neurosfærene. Den etablerte human glioblastoma cellelinje U87, ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC), og både den U87 og de vedlagte eller differensierte celler utledet fra de GBM neurosfærene (stilk-lignende celler), ble dyrket i DMEM medium (inneholdende L -glutamine), supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% Antibiotikum-Anti-fungal (AA). Alle dyrkede celler ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2.
Behandling av BBMD3
BBMD3 ble løst opp i dimetylsulfoksyd (DMSO) og fortynnet med celle kulturmediet. For å oppnå enkeltceller fra GBM neurosfærer ble neurosfærer behandlet med accutase i 10 minutter ved 37 ° C og ledet gjennom en celle sil (70 um nylon). Cellene ble deretter sådd ut i cellekulturflaske eller retter med fullstendig stilk cellekulturmedium i henhold til protokollen som er beskrevet i den eksperimentelle design delen. Fem timer senere, ble forskjellige konsentrasjoner av fortynnet BBMD3 tilsatt til cellene; mens kontrollene mottok like stor mengde av bare bæreren.
cellenes levedyktighet Analyser
cellenes levedyktighet ble utført med den CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay fra Promega, som inneholder 3- (4- , 5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium (MTS). Hver brønn i en 96-brønners plate ble sådd med 5000 celler suspendert i kulturmedium. Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av medikament. Etter 24 timer eller 48 timer etter behandling, ble MTS tilsatt til cellene i henhold til leverandørens protokoll, og absorbansen av reaksjonsproduktet som dannes ved de dyrkede celler ble målt ved 490 nm ved anvendelse av en ELISA-plateleser.
apoptose Assay
Celler (2 x 10
5) avledet fra neurosfærene ble sådd i 6-brønns plater med fullstendig stamcelle medium. Den følgende dag ble cellene behandlet i ytterligere 48 timer med de angitte konsentrasjoner av BBMD3. Etter behandling ble alle cellene oppsamlet, og de apoptotiske celler ble detektert ved anvendelse av en Annexin V-FITC Apoptose Detection Kit (BD Biosciences). Cellene ble farget med Annexin V-FITC og propidiumjodid (PI) i henhold til leverandørens anvisninger. Levedyktige og apoptotiske celler ble oppdaget av flowcytometri i vår Analytical Cytometry Kjerne her på City of Hope National Medical Center. Apoptotiske celler omfatter både tidlig apoptotisk del (Annexin V-positiv) og avdøde apoptotiske del (Annexin V og PI-positive).
Photography
Normal NS kultur, ubehandlede GBM NS kulturer avledet fra pasienthjernesvulster (dvs. PBT003, PBT008, PBT022, PBT030) eller PBT003 NS behandlet med ulike konsentrasjoner av BBMD3 ble fotografert på 10X forstørrelse ved hjelp av et Nikon ECLIPSE TE2000-U mikroskop.
Total protein Forberedelse og Protein Assay
Etter en 24 timers inkubering med 5 uM BBMD3, ble celler avledet fra pasientens hjernesvulster (dvs. PBT003, PBT008, PBT022 og PBT030) oppsamlet og vasket med kald fosfatbufret saltløsning (PBS). Deretter ble hver celle pellet tilsatt til 150 ul av cellesignalisering Lysis-buffer (EMD Millipore), der vi hadde plassert en protease inhibitor cocktail tablett (Roche, Inc., Indianapolis, IN). Etter tre etterfølgende sykluser av frysing i tørris /etanol-bad og tining i et 37 ° C vannbad, ble det totale proteinkonsentrasjonen av løsningen bestemmes ved anvendelse av en Bio-Rad Protein Assay Kit.
Immunoblotting analyse
Tyve mikrogram av totalt protein ble løst gjennom et pre-støpt 4-15% gradient Tris-HCl polyakrylamidgel kjøpt fra BIO-RAD (Hercules, CA). Etter gelelektroforese ble proteinene overført til Hybond-C-membraner (Amersham), blokkert i 1 time ved romtemperatur (RT) i 10% ikke-fett tørrmelk, som ble oppløst i PBST (1 x PBS inneholdende 0,1% Tween-20 ), og inkubert over natten ved 4 ° C med primære antistoffer (gjenkjenner proteiner som er beskrevet i teksten) suspendert i PBST inneholdende 2% ikke-fettholdig tørrmelk. Etter vasking av membranene i PBST, ble pepperrot peroksidase-merket anti-mus eller anti-kanin sekundære antistoffer inkubert med membranene i 1 time ved RT. Plasseringen på Hybond-C membran av de antigene proteiner spesifikt bundet til antistoffer ble detektert med SuperSignal West Pico substrat (Pierce).
Kvantitativ analyse av microRNAs
Totalt mikroRNA ble isolert fra PBT003 , PBT008, PBT022 og PBT030 neurosfærene etter en 15 timers behandling med 5 mikrometer BBMD3 eller bilen kontroll med miRNeasy Mini kit (Qiagen). Kvantifisering av den relative overflod av hver enkelt mikroRNA, med eller uten BBMD3 behandling, ble ferdigstilt i Genomics Kjerne på City of Hope National Medical Center. Kort fortalt ble mikro-RNA sekvensering utføres ved hjelp av Illumina HiSeq2000 etter produsentens protokoll (TruSeq små RNA Sample Prep kit, opplyse, Inc.) med mindre optimalisering. 500 ng av mikro-RNA ble ligert til 3′-adapter (5 «TCTCTGTAGGCACCATCAATC) med T4-RNA-ligase 2 i 1 time ved 22 ° C. De unligated 3 «adaptere ble blokkert ved å varmebehandle dem med RT primer (5» ATTGATGGTGCCTACAGAGA) ved 75 ° C i 5 minutter og 25 ° C i 15 minutter. Den kvantifiserte denaturert mikro-RNA-bibliotek ble fylt i 1 ml hybridiserings-buffer til en sluttkonsentrasjon på 10 pm.
Behandling av mikro-RNA Inhibitorer
8000 enkeltceller avledet fra PBT008 og PBT030 neurosfærer i fullstendig stilk cellekulturmedier ble inokulert i hver brønn i 96-brønners plater. Fem timer senere ble 60 nM MIR-4284 eller MIR-27a anti-sense-hemmere transfektert inn i cellene ved RNAiFect transfeksjon reagens. Kontroll-celler ble transfektert med en styre mikro-RNA-inhibitor. 24 timer etter transfeksjon med mikro-RNA-inhibitorer, ble 5 uM BBMD3 tilsatt til cellekulturplater. 24 timer etter BBMD3 behandling, ble celleviabilitet bestemt.
statistikker
Student
t
test ble brukt for å vurdere statistisk signifikans av forskjeller mellom to grupper og
p
0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Neurosfærer Kultur fra prøver av GBM pasienter viser Kjennetegn på Kreft stamcellene
Vi dyrket og utvidet kort. begrepet kreft neurosfærene i serumfrie stamcelle media, (supplert med EGF og FGF), som ble hentet fra fire primære GBM pasienter, (dvs. PBT003, PBT008, PBT022 og PBT030). Disse GBM neurosfærer oppviste en morfologi som ligner den for normale neuralstamceller (Fig. 1A). Det er rapportert at GBM stilk-lignende celler (GBMSCs) og normale nevrale stamceller (NSC) deler ekspresjonen av flere markører, så som CD133 og nestin [28]. CD133 er en celleoverflate markør uttrykt på normale humane NSCs, og dets ekspresjon blir nedregulert i differensierte cellelinjer. Nestin er et mellomliggende filamentprotein som produseres under utvikling i stamceller som oppstår i pattedyrsentralnervesystemet. Co-ekspresjon av CD133 og nestin er assosiert med en dårlig prognose for maligne gliomer pasienter [28]. Vi har observert ved Western blot-analyse som CD133 og nestin ble uttrykt i GBM neurosfærer dyrket fra hver av de fire GBM pasientene, mens ingen ekspresjon av CD133 og nestin ble observert i en etablert GMB-cellelinje (dvs. U87-celler), (fig. 1B). β-actin-ekspresjonsnivåer ble overvåket for å sikre at ekvivalente mengder av celleprotein ble anbrakt i hver kolonne av gelen. Når dyrket i medium med serum, neurosfærene avledet fra PBT003, PBT008, PBT022 og PBT030 GBM pasienter som har evnen til å differensiere til adherente og neuron-lignende celler, (Fig. 1C). Cellekulturer avledet fra prøvene til de fire GBM pasienter (PBT003, PBT008, PBT022 og PBT030) vokste i typiske neurosfærer, og beholdt muligheten for selvfornyelse og uttrykte nevrale stamcellemarkører, som CD133 og nestin når dyrket i serum- frie medier. Disse neurosfærer hadde også evne til å differensiere i serum-inneholdende vekstmedium. I denne rapporten har vi derfor definert disse Neurosfærene som enten GBM stilk-lignende celler eller kreft stamceller-lignende celler.
(A) morfologi PBT003, PBT008, PBT022 og PBT030 Neurosfærene i stamcelledyrkingsmedium. (B) GBM Neurosfærene uttrykt spesifikke biomarkører for normale nevrale stamceller. (C) GBM Neurosfærene vise evnen til å differensiere.
BBMD3 forstyrrer struktur Neurosfærer og Hemmer Livskraftig av kreft Stem lignende celler dyrket fra de fire GBM Pasienter
GBM avledet kreft stilk-lignende celler, er mindre følsom for, (eller blir resistente mot), konvensjonell kjemoterapi [4], [5]; fremhever et kritisk behov for å finne nye og mer selektivt potente legemidler for behandling av glioblastom. Berbamine, et naturlig produkt avledet fra
Berberis amurensis
anlegget, ser ut til å ha cytotoksisk aktivitet mot en rekke kreftformer; spørre fremstilling av en serie av analoger av berbamine. Disse analogene ble evaluert for å bestemme om noen av dem kan være mer effektive i å drepe kreftceller enn moderforbindelsen. Vi fant at den anticancer virkning av en av de nye syntetiske derivater, (dvs. BBMD3), på melanom og prostata kreftceller som overskredet av de andre analoger [17]. Dermed har vi undersøkt kreft effekter av BBMD3 på GBM stilk-lignende celler, som ble hentet fra Neurosfærene dyrkede fra GBM pasientens PBT003, PBT008, PBT022 og PBT030. I løpet av studien, ble disse celler behandlet i 24 eller 48 timer i nærvær av fullstendig stilk cellekulturmedium inneholdende 1, 3, 5, 8 eller 10 uM BBMD3. Kontrollcellekulturene ble behandlet med vehikkel (DMSO) i stedet for BBMD3, og cellelevedyktigheten ble bestemt som beskrevet i fremgangsmåtene. BBMD3 sterkt inhibert levedyktigheten til hvert sett av de GBM stammeliknende kreftceller, avledet fra de individuelle pasient neurosfærene, i en tids- og doseavhengig måte (fig. 2A). En 48-timers behandling av neurosfærene med 10 pM BBMD3 hemmet cellelevedyktighet nesten 100%, og forstyrret strukturen av neurosfærer i en doseavhengig måte. Figur 2B viser at PBT003 avledet neurosfærer, behandlet med 0, 1, 3, 5 eller 10 uM BBMD3 i 48 timer, avbrytes den sfæriske morfologi av neurosfærene følgende BBMD3 behandling, og at forstyrrelse av neurospherical formen ble companied ved fremkomsten av flytende døde celler.
(A) celler fra PBT003, PBT008, PBT022 og PBT030 neurosfærene ble behandlet med 0, 1, 3, 5, 8, 10 mm BBMD3 for 24 og 48 timer, og levedyktighet ble bestemt ved hjelp av MTS assay, som beskrevet i Metoder. Hvert forsøk ble utført in triplo. Toppen av hver søylediagram representerer gjennomsnittet av 3 eksperimenter, og
feilfelt
representerer ± standardavvik fra gjennomsnittet (SD). (B) BBMD3 forstyrrer strukturen i neurosfærer, og indusert celledreping i en doseavhengig måte i disse PBT003 utledet neurosfærer, når cellene ble behandlet i 48 timer med stoffet.
BBMD3 Induserer caspase -3 Avhengig Apoptose of Cancer Stem lignende celler dyrket fra Four GBM Pasienter
Fordi drept BBMD3 behandling GBM avledet kreft stilk-lignende celler, undersøkte vi om celledreping ble formidlet av en apoptotisk prosess. Celler (2 x 10
5) fra PBT003, PBT008, PBT022 og PBT030 neurosfærer ble sådd inn i seks-brønns vevskulturplater, og behandlet i 48 timer med forskjellige konsentrasjoner (0, 1, 3, 5, 10 uM) av BBMD3. Alle cellene ble samlet og analysert for ekspresjon av Annexin V ved anvendelse av anti-Annexin V-FITC-antistoff og propidiumjodidfarging fulgt av relative mengdebestemmelse via strømningscytometri. Apoptotiske celler, er vist i figur 3A, ble Annexin V positive (tidlig apoptotiske celler), eller Annexin V og propidiumjodid dobbel-positive (slutten av apoptotiske celler). Våre resultater viser at BBMD3 indusert apoptose i disse GBM stilk-lignende celler på en doseavhengig måte. En 48-timers behandling med 10 uM BBMD3 drepte nesten alt av tumorcellene. Aktivering av kaspase-3, en kritisk induser av den apoptotiske prosess [29], resulterte i spaltning av poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), som bidrar til å opprettholde cellene deres levedyktighet [30]. For ytterligere å bekrefte at celledreping indusert av BBMD3 er en apoptotiske prosess, ble Western blotting analyser utført for å detektere aktivering av kaspase-3 og spaltingen av PARP i en totalt cellelysat etter en 24 timers behandling med 5 uM BBMD3. BBMD3 øket spaltning av caspase-3 til den aktive formen, og spaltingen av PARP til det inaktive form i celler avledet fra de fire neurosfære kulturer (fig. 3B). Disse data peker mot BBMD3 å indusere apoptose i disse GBM stilk-lignende celler via aktivering av kaspase-3 kaskade. Våre data antyder også at flere mekanismer kan være involvert i induksjon av celledreping, og tapet i celleviabilitet, siden, på det tidspunkt undersøkes, PBT003 NS inkubert med 5 uM BBMD3 induserte en nærmest totale tapet i celleviabilitet, med en apoptose hastighet på ca 60%; mens for den PBT030 NS cellenes levedyktighet var ca. 20% etter inkubering med 5 uM BBMD3, mens apoptose var nesten 100% i denne kulturen.
(A) apoptotiske celler ble analysert for Annexin V-FITC reaktivitet og PI farging ved strømningscytometri. Celler fra PBT003, PBT008, PBT022 og PBT030 neurosfærer ble behandlet med BBMD3 (0, 1, 3, 5, 10 pM) i 48 timer. Apoptotiske celler ble identifisert som å være reaktivt med Annexin V-FITC-antistoff (tidlig stadium av apoptose), eller PI og Annexin V-FITC /PI dobbel-positive (sent stadium av apoptose) celler. Hvert eksperiment ble utført i duplikat eller triplikat, og gjentatt to ganger som en uavhengig replikere. Toppen av hver søylediagram representerer gjennomsnittet av de observerte verdiene fra disse gjentak, og
feilfelt
representerer ± standardavvik fra gjennomsnittet (SD). (B) Omfanget av spaltingen av kaspase-3 og PARP ble bestemt etter en 24 timers behandling med BBMD3 ved hjelp av Western blotting analyser. β-actin fungerer som en intern kontroll.
BBMD3 Reduserer også Livskraftig og induserer apoptose i Non-stammen lignende GBM Cells
Som vi har rapportert, er BBMD3 cytotoksiske å demme -liker GBM tumorceller; noe som tyder på at det skal også være cytotoksisk til ikke-stammen lignende GBM kreftceller. For å undersøke denne muligheten, brukte vi dyrkede U87 celler, som er en etablert non-stammen lignende GBM kreftcellelinje. Vi har observert at U87-celler som ikke uttrykker det neurale stamcellemarkører CD133 og nestin (se fig. 1B for sammenligning med de stammeliknende GBM tumorcellelinjer). Som vi forventet, BBMD3 hemmet celleviabilitet og induserte apoptose i U87-celler (Fig. 4A) på en lignende måte som den som sees med GBM stilk-lignende celler (fig. 2A og 3A). Våre data indikerer at BBMD3 kan drepe både stilk-like og ikke-stilk-lignende GBM tumorceller.
(A)
Venstre panel
, U87-celler ble behandlet med 0, 1, 3, 5, 8 eller 10 uM BBMD3 i 24 og 48 timer, og levedyktigheten ble bestemt ved bruk av MTS-analysen, som beskrevet i Metoder.
Høyre panel
, U87-celler ble behandlet med 0, 1, 3, 5, eller 10 uM BBMD3 i 48 timer og apoptotiske celler ble analysert for Annexin V-FITC reaktivitet og PI farging ved strømningscytometri. (B)
Venstre panel
viser morfologi av et normalt menneske neurosfære.
Høyre panel
viser levedyktigheten til normale fosterets hjerne avledet og svulst avledet Neurosfærene etter 24 timers behandling med 1, 5 eller 10 mikrometer BBMD3. Hvert forsøk ble utført in triplo, og replikert som et uavhengig forsøk minst to ganger. Toppen av hver søylediagram representerer gjennomsnittet av de observerte verdiene fra disse gjentak, og
feilfelt
betegne ± standardavviket fra gjennomsnittet (SD).
Normal Menneskelig neurosfærer er mindre følsom overfor BBMD3 enn GBM Avledet neurosfærer
berbamine og dets derivater har også blitt rapportert å utøve mindre av en cytotoksisk effekt mot normale humane celler [17] enn mot GBM og andre typer av tumorceller. For ytterligere å evaluere differensial cytotoksisitet av BBMD3 mot normale neurosfærer, testet vi effekten av BBMD3 på normale menneskelige Neurosfærene avledet fra det normale fosterets hjerne. Figur 4B viser morfologien av normale neurosfærer, og effekten av BBMD3 på normal neurosfærer og neurosfærene avledet fra de fire GBM pasienter etter en 24 timers eksponering for medikamentet. I sammenligning med de tumor-avledet neurosfærene er normal neurosfære levedyktighet redusert ved eksponering overfor økende konsentrasjoner av BBMD3, men disse normale neurosfære kulturer er mindre følsomme overfor den cytotoksiske effekten av BBMD3 enn neurosfærene kulturer avledet fra de 4 GBM pasientene.
BBMD3 Øker uttrykk av MIR-4284 og MIR-27a i PBT003, PBT008, PBT022 og PBT030 Neurosfærer
Selv om mirnas har vært kjent for bare noen få år, har de vist seg å spille viktige roller i prosesser som medierer tumorgenese, angiogenese, celle invasjon, og apoptose i en rekke forskjellige tumortyper. Vi har derfor undersøkt om BBMD3 behandling kan forandre uttrykket profilen til miRNAs i GBM stilk-lignende celler. Neurosfærer, avledet fra PBT003, PBT008, PBT022 og PBT030 GBM pasienter, ble behandlet med 5 uM BBMD3 i 16 timer, mens kontrollcellene ble behandlet med vehikkel (DMSO). Total miRNA ble isolert fra disse neurosfære kulturer, og uttrykk for hver miRNA ble kvantifisert. I forhold til kontrollene, BBMD3 behandling oppregulert uttrykk for noen miRNAs, og nedregulert uttrykk for andre miRNAs. Tabell 1 viser de gjennomsnittlige miRNA ekspresjonsprofilen, i forhold til de ubehandlede kontroll GBM stilk-lignende celler, for hver av de fire GBM pasienter etter BBMD3 behandling. MIR-7 er den mest nedregulert miRNA, med en nedgang i ekspresjon av 1,06 fold. I motsetning til de to mest up-regulerte mirnas er MIR-4284 og MIR-27a; øker henholdsvis 4,48 og 2,25 ganger. Det ble rapportert at opp-regulering av MIR-23a, 27a, og 24-2 induserer både caspase-avhengig og-uavhengig apoptose i humane embryoniske nyreceller [31]. Hittil har vi ikke vært i stand til å finne enhver publikasjon som beskriver regulerende funksjon (e) av MIR-4284.
Mir-4284 inhibitor blokkerer effekten av BBMD3 på levedyktigheten til GBM Neurosfærer
for å bekrefte hvorvidt økt uttrykk av MIR-27a og MIR-4284 indusert av BBMD3 behandling korrelerer med reduksjon i GBM neurosfære levedyktighet, undersøkte vi om MIR-27a og MIR-4284 anti-sense-sekvenser kan hemme den cytotoksiske aktiviteten av BBMD3. Vårt første skritt var å undersøke hvorvidt disse hemmere alene hemmet celle levedyktighet. 60 nM av menneskelige anti-sense miRNA hemmere (dvs. syntetiske oligonukleotider) mot HSA-miRNA-4284 og HSA-miRNA-27a ble transfektert inn i celler avledet fra PBT008 og PBT030 neurosfærer. Urelatert anti-sense mikro-RNA-inhibitor ble anvendt som en negativ kontroll, og 48 timer etter transfeksjon med disse miRNA inhibitorer ble cellelevedyktigheten bestemt. Resultatene er vist i fig. 5A viste at MIR-27a og MIR-4284 hemmere alene ikke effektivt å redusere cellenes levedyktighet i forhold til den av de ikke-transfekterte celler (untran). Vi testet da effekten av MIR-27a og Mir-4284 hemmere på cytotoksiske aktiviteten til BBMD3 hjelp PBT008 og PBT030 neurosfærer. Etter disse GBM Neurosfærene ble transfektert med, og lov til å uttrykke i 24 timer, Mir-27a og MIR-4284 anti-sense-hemmere, eller styre miRNA inhibitor sekvens ble cellene inkubert med 5 mikrometer BBMD3 i ytterligere 24 timer, hvor punkt cellelevedyktigheten ble bestemt. Hvert forsøk ble utført in triplo.
