Abstract
Kreft celle invasjon, en av de avgjørende hendelsene i lokal vekst og metastatisk spredning av svulster, har et bredt spekter av mekanismer, særlig endret uttrykk for matriksmetalloproteinaser. LFG-500 er en roman syntetisert flavonoid med sterk anti-kreft aktivitet, hvis eksakte molekylære mekanismen forblir ufullstendig forstått. Denne studien er designet for å undersøke effekten av LFG-500 på tumormetastase ved hjelp av
in vitro
og
in vivo
analyser. LFG-500 kunne inhibere adhesjon, migrasjon og invasjon av MDA-MB-231 humane bryst carcinom-celler. I mellomtiden, det reduserte aktivitetene og ekspresjon av MMP-2 og MMP-9 via undertrykke den transkripsjonelle aktivering av NF-kB i stedet for AP-1 eller STAT3. Videre LFG-500 trykt TNF-α indusert celle invasjon gjennom inhibering av NF-kB og påfølgende MMP-9 aktivitet. Ytterligere belysning av den mekanisme viste at PI3K /AKT men ikke MAPK-signalreaksjonsveien var involvert i den inhiberende effekt av LFG-500 på NF-kB-aktivering. LFG-500 kan også undertrykke lungemetastaser av B16F10 murine melanomceller
in vivo
. Samlet utgjør disse resultatene viste at LFG-500 kan blokkere kreftcelle invasjon via nedregulering av PI3K /AKT /NF-kB signalveien, som gir nye bevis for den anti-kreft aktivitet av LFG-500.
Citation: Li C, Li F, Zhao K, Yao J, Cheng Y, Zhao L, et al. (2014) LFG-500 Hemmer invasjonen av kreftceller via nedregulering av PI3K /AKT /NF-kB signalveien. PLoS ONE 9 (3): e91332. doi: 10,1371 /journal.pone.0091332
Redaktør: Zhe Zhang, Xuzhou medisinsk høyskole, Kina
mottatt: 01.11.2013; Godkjent: 09.02.2014; Publisert: 11 mars 2014
Copyright: © 2014 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av stiftelsen Natural Science of China (nr 21072232), Project Program of State Key Laboratory of Natural Medicines, Kina Pharmaceutical University (No. JKGZ201101, SKLNMZZ201210, SKLNMZZCX201303, SKLNMZZJQ201302), Foundation i Jiangsu-provinsen Natural Science (No . BK2011620, BK20130220), Program for Changjiang Scholars og Innovativ Research team i University (IRT1193), National Science Teknologi Major Project (No. 2013ZX0 9103-001-007, 2012ZX09304-001), Kina Postdoktor Science Foundation finansiert prosjekt (2013M 541 733), Jiangsu planlagte prosjekter for postdoc Funds (1301015B), og Foundation of Higher Natural Science utdanningsinstitusjoner i Jiangsu-provinsen (13KJB350007). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Aktivering invasjon og metastasering, nøkkelen kjennetegn på kreft [1], har blitt anerkjent som en primær årsak til kreft relatert dødelighet. Overdreven basalmembraner og ekstracellulære matriks (ECM) nedbrytning er avgjørende for tumorinvasjon og metastase [2]. Matriksmetalloproteinaser (MMP), en familie av sink-avhengige endopeptidaser, er forbundet med tumorcelle invasjon og metastasering [3], [4]. Tumor-utskilt MMP’er kan hydrolysere ECM komponenter i vev som omgir tumoren, noe som letter den invasjon av tumorceller inn i grunnmembranen til fjerntliggende organer, og som fører til metastase [5]. Blant de MMP’er, MMP-2 (gelatinase A, 72 kDa) og MMP-9 (gelatinase B, 92 kDa) spiller sentral rolle i ECM degradering [6]. Følgelig er de rikelig uttrykt i forskjellige ondartede tumorer [7]. Derfor MMP og deres regulatoriske trasé anses som lovende mål for anti-kreft narkotika og kjemoterapeutika [8].
Det er generelt vist at phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /AKT og mitogen-aktivert protein kinase (MAPK) signalveier regulere metastase i en rekke kreftceller [9], [10]. Aktiveringen av nedstrøms transkripsjonsfaktorer inkludert aktivator protein-1 (AP-1), STAT3, og nukleær faktor-kB (NF-kB) er rapportert å stimulere ekspresjonen av MMP’er ved transkripsjonsnivået [11]. Spesielt, NF-kB, den ekstremt viktig transkripsjonsfaktor i kreftceller, har vært implisert i mange kjennetegnene til kreftutvikling, inkludert vekstfaktor-uavhengig proliferasjon, forhindrer apoptose, ubegrenset replikasjonspotensial og vev invasjon og metastase [12], [13] . NF-kB-proteiner omfatte en familie av strukturelt beslektede-transkripsjonsfaktorer, inkludert P50 (NF-κB1), p65 (Rela), c-Rel, P52, og relB. Blant disse faktorene, bare p65, relB, og c-Rel inneholde potente transaktiveringsdomener sekvensene C-terminale til den Rel homologi domene (RHD), som inneholder DNA-bindende og dimerisering regioner. Aktivert NF-kB er til stede i cellekjernen hvor det bindes til spesifikke DNA-sekvenser som kalles responselementer og regulerer transkripsjon av mål-gener. Mens i cytoplasma, er NF-kB holdt i en inaktiv tilstand, som komplekser med hemmende IkB proteiner. NF-kB kan aktiveres gjennom den klassiske IKK-avhengige vei som fører til kjernefysisk translokasjon av p50 /p65 heterodimerer [14].
Flavonoider er en gruppe forbindelser som er rik på frø, sitrusfrukter, olivenolje, te, og rødvin. I de senere år har anti-tumor-effekter av flavonoider blitt anerkjent og studert, spesielt deres potente antimetastase-aktivitet [15], [16]. I henhold til tidligere studier, kan flavonoider hemme invadopodia dannelse og MMP-sekresjon [17] og forhindre cellemigrering ved opp-regulerer ekspresjonen av transgelin [18]. De mange handlinger er tilskrives deres poly-fenoliske struktur. Men flavonoider har svært lav oral biotilgjengelighet på grunn av sin omfattende førstepassasjemetabolisme, noe som mest sannsynlig ville skje i deres hydroksylgrupper. Derfor, basert på strukturen av flavonoider, LFG-500 (C
30H
32N
2o
5, fig. 1A) er designet for å øke oral biotilgjengelighet og forhindre metabolismen av flavonoider ved dens hydroksyl grupper ved å innføre et piperazin og en benzylgrupper. Disse erstatningene ga også LFG-500 bedre lipid løselighet, noe som gjør det lettere å komme inn i intracellulære plass. Vår tidligere studie viste at LFG-500 indusert apoptose gjennom en reaktive oksygenforbindelser (ROS) -mitochondrial-mediert sti i HepG2 celler [19]. Siden metastase er ekstremt viktig i progresjon av kreft, er det viktig å undersøke effekten av LFG-500 på kreft metastase og den mekanisme som er involvert. De påfølgende funn kan gi ny bevis på anti-kreft-aktivitet av LFG-500, så vel som flavonoider.
(A) Kjemisk struktur av LFG-500. (B) Hemmende effekt av LFG-500 på veksten av MDA-MB-231-celler i 24 timer. MTT-analysen ble benyttet. (C) Trypan blått fargestoff utelukkelse analyse av LFG-500 på veksten av MDA-MB-231-celler. Celler ble behandlet med indikerte konsentrasjoner av LFG-500 i 24 timer. (D) LFG-500 (8 pM) har ingen innflytelse på normal størrelse og form av cellene (x 200, representerer målestokken 30 um). (E) Hemmende effekt av LFG-500 på adhesjon av MDA-MB-231-celler til fibronektin. Cellesuspensjonen (100 pl, 2 x 10
5 celler /ml) ble tilsatt til fibronektin pre-belagte plater og inkubert ved 37 ° C i 1 time. Deretter kultur media var nøye suges ut. Hver brønn ble vasket tre ganger med PBS. MTT analysen ble vedtatt for å bestemme antall heftende celler. (F) LFG-500 hemmer cellemigrering. Cellemonolaget ble såret av en 200 mL gul pipettespissen etterfulgt av behandling med forskjellige konsentrasjoner (2, 4, og 8 pM) av LFG-500 i 24 timer. Antallet av cellene i ribbet sonen ble kvantifisert i henhold til et invertert mikroskop. Hvite linjer indikerer såret kanten. De migrerte celler på tvers av de hvite linjene ble telt i seks tilfeldige felt fra hver behandling. Fotografier av sår i celler behandlet med LFG-500, x 100 (til venstre). Kvantifisering av de migrerte celler (høyre). (G) LFG-500 hemmer celle invasjon. Fotografier av invadert cellen farget av hematoxylin og eosin, × 200 (til venstre). Kvantifisering av den invaderte celler (høyre).
* P
0,05 eller
** P
. 0,01 representerer signifikant forskjell fra kontrollgruppen
Materialer og metoder
etikk Uttalelse
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk i Kina Pharmaceutical University. Alle operasjoner ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Material
LFG-500 (99,1% renhet), levert av professor Zhiyu Li (Kina Pharmaceutical University, Kina), ble løst opp i dimetylsulfoksyd (DMSO) til en konsentrasjon på 10 mM som primær stamløsning. Løsningen ble lagret ved -20 ° C og fortynnet med medium før hvert eksperiment. Kontrollene ble behandlet med den samme mengde av DMSO (0,1%) som anvendt i tilsvarende eksperimenter. For
in vivo
studien, LFG-500 ble fremstilt ved School of Pharmacy i Kina Pharmaceutical University. Dakarbazin (DTTC, Nanjing farmasiselskap, China) ble vedtatt som positiv kontroll, som ble oppløst i 0,9% NaCl før bruk. Fibronectin og matrigel ble kjøpt fra BD Biosciences (Bedford, MA, USA) [20]. Antistoffer mot MMP-9 (H-129) (sc-10737), MMP-2 (H-76) (sc-10736), c-Jun (D) (sc-44), c-Fos (4) (sc -52), NF-kB p65 (C-20) (sc-372), Lamin A (133A2) (sc-56137), IKKα /β (H-470) (sc-7607), IgG (H-270) (sc-66913), GFP (FL) (sc-8334), p-ERK1 /2 (Thr 177 /Thr 160) -R (sc23759-R), JNK (D-2) (sc-7345), p- JNK (G-7) (sc-6254), p38 (H-147) (sc-7149), p-p38 (Thr 180) (sc-101 758), akt1 /2/3 (H-136) (SC- 8312), ble β-aktin (sc-130 301), og protein A-agarose (sc-2001) oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Antistoffer mot STAT3 (T721) (BS-1336), p-STAT3 (S727) (BS-4180), p-STAT3 (Y705) (BS-4181), ERK1 /2 (L352) (BS1112), PI3K p85α /γ (Y463) (BS-3006), og p-AKT (S246) (BS-4286) ble kjøpt fra BioWorld (St. Louis Park.nneapoli, MN, USA). Antistoffer mot p-IKKα /β (Ser176 /180) (16A6) (# 2697), IκBα (44D4) (# 4812), og p-IκBα (Ser32) (14D4) (# 2859) var fra Cell Signaling Technology, Inc . (Beverly, MA, USA). MTT, trypanblått, gelatin, paraformaldehyd, formaldehyd, glycin, Triton X-100, DAPI, Tris, NaCl, Hepes, KOH, KCl, EDTA, NP-40, PMSF, NaF, SDS, DTT, og NaHCO
3 ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA).
Dyr
Mann C57BL /6 mus (6-8 uker gamle) som veier 20-25 g ble oppnådd fra Shanghai Laboratory Animal senter (Shanghai, Kina). Dyrene ble holdt i et temperatur- og fuktighetskontrollert miljø med en 12: 12-timers lys /mørke syklus. Fôr og vann var tilgjengelig
ad libitum
. Alle dyrestudier og kirurgiske prosedyrer ble strengt utført i samsvar med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr.
Cell kultur
MDA-MB-231 (en human brystkreft cellelinje) og B16F10 (en svært metastatisk murine melanoma cellelinje) ble kjøpt fra celle~~POS=TRUNC Bank of Shanghai Institute of Cell Biology (Shanghai, Kina). MDA-MB-231-celler og B16F10-celler ble dyrket i Leibovitz s L15 og DMEM-medium (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), henholdsvis, som begge inneholder 10% føtalt bovint serum (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ), 100 U /ml penicillin (Beyotime, Nantong, Kina), og 100 mikrogram /ml streptomycin (Beyotime, Nantong, Kina). Cellene ble holdt i en fuktig atmosfære med 95% luft /5% CO
2 ved 37 ° C.
kolorimetrisk MTT-analysen
Cells (10
4 /brønn) ble sådd ut på Falcon 96-brønners plater (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) i 24 timer og deretter eksponert for forskjellige konsentrasjoner av LFG-500. Etter inkubering i 24 timer, 20 ul av 5 mg /ml MTT ble tilsatt til mediet, og cellene ble inkubert ved 37 ° C i ytterligere 4 timer. Deretter ble kulturmediet ble fjernet og 100 ul DMSO ble tilsatt til hver brønn for å oppløse bunnfallet. Absorbans (A) ble målt ved 570 nm ved anvendelse av en automatisert Microplated Reader ELx800 (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA). Cellevekst inhiberingsgraden (I%) ble beregnet ved den følgende ligning: hvor A
behandlede og A
kontroll var den gjennomsnittlige absorbans av tre parallelle forsøk fra behandlede og kontrollgruppene, respektivt. IC
50 ble tatt som den konsentrasjon som forårsaket 50% inhibering av cellevekst, og ble beregnet ved hjelp av Logit-metoden.
Trypan blått fargestoff utelukkelse assay
Når de utsettes for LFG-500 hos angitte konsentrasjoner i 24 timer ble cellene høstet og blandet med 0,4% trypanblått. Deretter både unstained (levedyktig) og farget (ikke-levedyktige) celler ble telt separat med en celle tellekammer (Qiujing, Shanghai, Kina) under mikroskopet. (CX21, Olympus, Tokyo, Japan)
Cell morfologisk vurdering
Celler ble sådd i 6-brønns cellekulturplater (Corning, New York, NY, USA) og behandlet med LFG-500 (8 mm) i 24 timer. Ved slutten av inkuberingen, ble cellemorfologi overvåket ved hjelp av et invertert mikroskop lys (IX51, Olympus Corp., Tokyo, Japan).
Celleadhesjon assay
Celleadhesjon-analyse ble utført som beskrevet [ ,,,0],20] med modifikasjoner. 96-brønners plater ble belagt med fibronektin (5 ug /ml) ved 4 ° C over natten og deretter blokkert i BSA (1%) i 1 time. Serum-sultet celler ble eksponert for LFG-500 (2, 4 eller 8 uM) i 24 timer før såing. Målceller ble høstet og suspendert i serumfritt medium. Cellene (2 x 10
5 /ml) ble sådd ut til fibronektin-belagte plater og så inkubert ved 37 ° C i 1 time. Ikke-adherente celler ble fjernet ved forsiktig vasking med PBS. Deretter ble kolorimetrisk MTT-analysen anvendes for å analysere adhesjonen evnen til cellene.
sårheling assay
Celler ble sådd i 6-brønns plate og tillatt å vokse til 80% konfluens. Deretter ble cellemonosjikt ripet med en pipettespiss (Axygen, Union City, CA, USA) for å skape en smal sår aktig gapet. Kort tid etter at såret ble cellene vasket to ganger med PBS og inkubert med LFG-500 (2, 4 eller 8 uM). Platene ble fotografert ved 0, 12, og 24 timer ved bruk av et invertert mikroskop lys. Antallet migrerte celler ble kvantifisert ved manuell telling og seks tilfeldig utvalgte felt ble analysert for hver brønn [21].
Cell invasjon analysen
Transwell kammersystem (10 mm diameter, 8 mikrometer pore størrelse med polykarbonatmembran, Corning Costar, Cambridge, MA) belagt med matrigel ble benyttet for å undersøke evnen invasive kreftceller
in vitro
som tidligere beskrevet [22]. I korthet Transwell kamre ble først belagt med matrigel (40 ug /100 ul /kammer) ved 37 ° C i 1 time. Cellene ble behandlet med eller uten LFG-500 (2, 4 eller 8 uM, 24 h) ble suspendert i Leibovitz s L15-medium (5 x 10
5-celler /ml) og sådd ut i det øvre kammeret, mens det medium som inneholdt 10% føtalt bovint serum ble tilsatt i det nedre kammeret. Etter inkubasjon i en fuktig atmosfære med 95% luft /5% CO
2 ved 37 ° C i 24 timer, de ikke-invaderte celler på den øvre side av membranen ble fjernet med en bomullspinne. De invaderte celler på bunnoverflaten ble fiksert med 100% metanol og farget med hematoxylin og eosin (Nanjing Sunshine Bioteknologi Ltd, Nanjing, Kina). Den invaderte celler ble kvantifisert ved manuell telling og seks tilfeldig valgte felter ble analysert for hver gruppe.
Gelatin zymografi assay
Celler ble behandlet med eller uten LFG-500 (2, 4 eller 8 pM) i serumfritt medium i 24 timer, og deretter ble supernatantene oppsamlet for prøvene. Gelatin zymografi Analysen ble utført i henhold til forrige metoden [16]. Etter behandling ble enzym-fordøyd regioner observert som hvite bånd mot blå bakgrunn. Sonene av enzymatisk aktivitet ble sett på som negativt farget band.
Real-time PCR-analyse
Celler ble behandlet med LFG-500 (2, 4 eller 8 mm) i 12 timer, og deretter nivåene av MMP-9 og MMP-2-mRNA ble bestemt. Primersekvensene syntetisert av Sangon Biotech Co., Ltd (Shanghai, Kina) ble oppført som følger: MMP-9: 5′-GCA GAG GAA TAC CTG TAC CGC-3 «(fremover) og 5»-AGG TTT GGA ATC TGC CCA GGT-3 «(bakover); MMP-2: 5»-CAG GCT CTT CTC CTT TCA CAA C-3 «(fremover) og 5′-AAG CCA CGG CTT GGT TTT CCT C-3′ (bakover); p-aktin: 5»-CTG TCC CTG TAT GCC TCT G-3 «(fremover) og 5′-ATG TCA CGC ACG ATT TCC-3» (bakover). Reaksjonene ble utført som beskrevet [23]. Prøvene ble kjørt på ABI 7500 Real-Time PCR-system (ABI, Foster City, CA, USA) som følger: 30 s ved 95 ° C, etterfulgt av 40 sykluser av 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 34 s . Hver reaksjon ble utført i tre eksemplarer. Grenseverdiene (CS) for hver mRNA ble trukket fra det av β-aktin mRNA, i gjennomsnitt, og konvertert fra log-lineær lineær vilkår. Data ble analysert ved SDS-2,1-programmet.
Western blot-analyse
Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av LFG-500 (2, 4 eller 8 uM) i 24 timer, deretter oppsamlet og lysert. Western blotting-analyse ble gjennomført i henhold til tidligere metoder [24]. Deteksjon ble utført med Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Inc., Lincoln, NE, USA). Alle blotter ble strippet og reprobed med polyklonale anti-β-actin å verifisere lik protein lasting.
Utarbeidelse av cytosoliske og atom ekstrakter
samlet cellene ble lysert med buffer A (10 mM Hepes-KOH (pH 7,9), 10 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,5% NP-40, 1 mM DTT og 0,5 mM PMSF) på is i 15 min for å tillate cellene til å svelle, og deretter sentrifugert ved 14 000 x
g
ved 4 ° C i 15 min. Supernatantene ble lagret som cytosoliske fraksjoner. De nukleære pellets ble inkubert med høy-salt-buffer (20 mM Hepes, 0,5 M KCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT og 1 mM PMSF, pH 7,9) på is i 30 minutter, og deretter sentrifugert ved 12 000 rpm ved 4 ° C i 15 minutter for å oppnå atomfraksjoner.
Immunofluorescence deteksjon
Cellene ble sådd ut på dekkglass og inkubert med eller uten 8 pM LFG-500 i 24 timer. Følgende trinn ble utført som beskrevet [24] med modifikasjoner. Celler ble fiksert med 4% paraformaldehyd i PBS i 1-timers intervaller, permeabilisert med 0,5% Triton X-100, og blokkert med 2% BSA i 30 minutter. Inkubering med primært antistoff mot NF-kB p65 (fortynnet 1:50) ble utført over natten ved 4 ° C. Etter vasking ble cellene eksponert for sekvensielt FITC-konjugerte sekundære antistoffer (1:1000, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA, L42001) og DAPI. Bilder ble observert og tatt med et konfokal laser scanning mikroskop (FV1000, Olympus, Tokyo, Japan)
Elektro mobilitet shift analyse (EMSA)
Celler ble behandlet med 2, 4 og 8. uM LFG-500 i 24 timer. DNA-bindende aktiviteter NF-kB i atom ekstrakter ble undersøkt ved EMSA [25] med EMSA kit (Beyotime, Nantong, Kina) med biotin-merket dobbel-strandet NF-kB oligonukleotider (Beyotime, Nantong, Kina). Sekvensene til oligonukleotidene vedtatt var som følger: 5′-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3 «og 3′-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5». Kort sagt ble nukleære ekstrakter (6 ug /prøve) inkuberes med oligonukleotidene i reaksjonsbuffer i 30 min. Protein DNA komplekser ble adskilt på en 6% akrylamidgel nondenaturing, overført til positivt ladet nylonmembraner, og tverrbundet i et Stratagene tverrbindingsmiddel. Band skift ble oppdaget av chemiluminescence metode med Chemidoc XRS + System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
Chromatin immunoprecipitation (chip) assay
Celler ble inkubert med LFG-500 ( 2, 4 eller 8 uM) i 24 timer, og deretter ChIP assay ble utført som beskrevet [26] med noen modifikasjoner. I korte trekk ble cellene kryssbundet med formaldehyd, stoppet med glycin, sonikert på is og sentrifugert ved 4 ° C. Aliquoter av lysater inneholdende 200 ug protein ble anvendt for hver reaksjon immunopresipitering med anti-NF-KB-p65 eller pre-immun IgG. Blandingene ble rotert ved 4 ° C over natten og deretter inkubert med protein A-agarose i 6 timer. Til slutt ble den fangede immunkompleksene ble eluert med elueringsbuffer (1% SDS og 0,1 M NaHCO
3) ved 37 ° C i 30 minutter. Protein-DNA-tverrbindinger ble reversert ved 65 ° C i 4 timer i en buffer med høyt saltinnhold (0,2 M NaCl, 50 mM Tris, pH 6,5, 10 mM EDTA og 0,2 mg /ml proteinase K). Hentet og oppløst immunopresipitert DNA ble kvantifisert ved real-time PCR-analyse med primere som omfatter NF-kB bindingssteder. De primere for MMP-9 promoter kvantifisering var 5′-CAG TGG AAT TCC CCA GCC TTG CCT-3 «og 5» CCA CAC TCC AGG CTC TGT CCT C-3 «.
Cell transfeksjon og NF- kB-avhengige reportergenekspresjon analysen
virkningen av LFG-500 på NF-kB-avhengige reportergen transkripsjon ble analysert ved luciferasereportergenet assays [27]. Celler (5 x 10
5-celler /brønn) ble sådd i 6-brønns plater. Deretter PNF-kB-luc (Beyotime, Nantong, Kina) inneholdende fire NF-kB-bindingsmotiv (GGGAATTTCC) ble transient transfektert inn i cellene ved hjelp av lipofektamin 2000 (Invitrogen Inc., Grand Island, NY, USA), ifølge fremstillingen sin instruksjon. Den pCDNA3.2 plasmidet ble tilsatt for å gjøre den totale mengden av DNA lik (4 ug /brønn i en 6-brønn plate) med GFP tjente som normaliseringskontroll. Etter LFG-500 (2, 4 eller 8 uM) behandling i 24 timer, ble luciferase-analyser utført med luciferasereportergenet Assay kit (Promega, Madison, WI, USA) ved anvendelse av Luminoskan bestigning (Thermo, Waltham, MA, USA) .
in vivo metastase analysen
B16F10 melanom celler ble samlet til en passende konsentrasjon i PBS og injisert via halevenen i syngene C57BL /6 mus. Musene ble like tilfeldig delt inn i fem grupper (10 mus /gruppe): 0,9% normal saltoppløsning kontrollgruppe, DTTC 100 mg /kg /2 dager positiv kontrollgruppe LFG-500 12,5 mg /kg /dag gruppen, LFG-500 25 mg /kg /dag gruppen, og LFG-500 50 mg /kg /dag gruppen. Etter inokulering i 24 timer, ble musene injisert intraperitonealt med testforbindelser i 21 dager. Deretter ble musene veiet og avlivet. Hvite blodceller (WBC) ble analysert ved Sysmex K-4500 hematologianalysator (Sysmex Inc., Kobe, Japan). Lungene ble fjernet og vasket med PBS. Antallet overflatetumorknuter ble talt under et disseksjonsmikroskop [20].
Statistisk analyse
Alle data i de forskjellige forsøksgruppene er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. Dataene som vises ble oppnådd fra minst tre uavhengige eksperimenter. Forskjeller mellom gruppene ble vurdert av enveis ANOVA og Dunnetts post hoc test. Signifikante forskjeller ble representert som
* P
0,05 eller
** P
. 0,01
Resultater
LFG-500 hemmer adhesjon, migrasjon og invasjon av MDA-MB-231 celler in vitro
MTT-analysen viste at cellevekst redusert systematisk med økende konsentrasjoner av LFG-500 (fig. 1B). IC
50 Verdien av LFG-500 på MDA-MB-231 celler i 24 timer var 15,67 ± 0,82 mikrometer. Imidlertid LFG-500 (opp til 8 pM) hadde ingen tydelig innvirkning på veksten av MDA-MB-231-celler (Fig. 1B), som ble bekreftet ved trypan blå eksklusjon fargestoff-analysen (fig. 1C). Cellemorfologi undersøkelse viste også at LFG-500 (8 pM) ikke påvirker den normale størrelsen og formen på cellene (Fig. 1D). Derfor, 8 uM av LFG-500 ble bestemt som den høyeste konsentrasjonen for de etterfølgende eksperimenter.
tumormetastasering skjer gjennom en kompleks serie av hendelser. Tumorceller oppviser en rekke egenskaper, inkludert endrede klebeevne, økt bevegelighet og invasive kapasitet, for å fullføre den metastatiske prosess [28]. Derfor, for å tumor celle adhesjon ECM og grunnmembranen er ansett som en grunnleggende trinn for kreft metastasering. Vi har undersøkt forholdet mellom LGF-500 på den klebende evne til MDA-MB-231-celler til substratene på forhånd belagt med fibronektin, en viktig komponent av ECM. LFG-500-behandling (4 og 8 pM) undertrykket MDA-MB-231-celler adhesjon til fibronektin med 33,6 ± 8,6% (n = 3,
P
0,05) og 42,7 ± 9,1% (n = 3
P
. 0,05), henholdsvis (figur 1E). Videre er virkningene av LFG-500 på cellemigrering og invasjon detektert. Som vist på fig. 1F, de migrerte celler over sårede plass ble redusert med 41,2 ± 8,4% (n = 3,
P
0,05), 64,9 ± 9,2% (n = 3,
P
0,01), henholdsvis, når cellene ble behandlet med 2, 4, og 8 pM LFG-500 i 24 timer. I tillegg LFG-500 (4 og 8 mm) redusert invasjonen evne til MDA-MB-231-celler ved 51,9 ± 9,3% (n = 3,
P
0,05) og 74,7 ± 10,2% ( n = 3,
P
. . 0,01), henholdsvis (figur 1G)
LFG-500 undertrykker aktivitet og uttrykk av MMP-2/9 i MDA-MB-231 celler
MMP-2/9, utskilt og aktivert av kreftceller, hydrolysere basalmembran og ECM, noe som letter invasjonen av maligne celler og fører til metastase [29]. For å utforske mulige anti-metastasering mekanisme av LFG-500, gelatinolytisk aktiviteten til MMP-2/9 utskilt fra MDA-MB-231-celler ble påvist etter LFG-500 behandling. Som vist på fig. 2A, LFG-500 (8 pM) naturligvis undertrykkes aktiviteten av MMP-2 og MMP-9, med inhiberingsgraden av 62 ± 8,2% (n = 3,
P
0,01) og 81 ± 7.9 % (n = 3,
P
0,01), respektivt. Videre er den hemmende virkning på aktiviteten av MMP-9 var mer betydelig.
(A) LFG-500 hemmer aktiviteten til MMP-2/9 i MDA-MB-231-celler. Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner (2, 4, og 8 pM) av LFG-500 i 24 timer. De kondisjonerte medier ble oppsamlet, og deretter MMP-2/9 aktivitet ble bestemt ved gelatin zymografi assay. (B) LFG-500 reduserer nivåene av MMP-2/9 mRNA. Celler ble inkubert med angitte konsentrasjoner av LFG-500 i 12 timer. De mRNA-nivåer ble påvist ved sanntids-PCR-analyse. (C) LFG-500 undertrykker protein ekspresjon av MMP-2 /til 9. MDA-MB-231 cellelysater ble utsatt for immunblotting med antistoffer mot MMP-2 (1:400) og MMP-9 (1:400).
* P
0,05 eller
** P
. 0,01 representerer signifikant forskjell fra kontrollgruppen
For ytterligere å forstå ned regulerende virkningene av LFG-500 på MMP-2 og MMP-9, ble utført real-time PCR-analyse. Som vist på fig. 2B, inhibering av genekspresjon ble observert åpenbart, med nivået av MMP-2 mRNA reduseres med 47,5 ± 9,5% (n = 3,
P
0,05) og MMP-9 mRNA ble redusert med 68,1 ± 7,1% (n = 3,
P
0,01), henholdsvis, etter behandling av 8 pM LFG-500 i 12 timer. De LFG-500-medierte endringer i nivåene av MMP-2 og MMP-9-mRNA var samsvarende godt med sine proteinekspresjon, som vist ved Western blot-analyse (Fig. 2C). Disse resultatene indikerte at LFG-500 kan regulere MMP-2/9 ved transkripsjonsnivået. Enda viktigere, de hemmende effekter på MMP-9 var mer merkbar.
LFG-500 undertrykker celle invasjon gjennom inhibering av den transkripsjonelle aktivering av NF-kB og påfølgende MMP-9 aktivitet
Det er vanligvis rapportert at transkripsjonsregulering ved aktivering av transkripsjonsfaktorer, inkludert AP-1 [30], STAT3 [31], eller NF-kB [32] oppstår under moduleringen av MMP-9-genekspresjon. For ytterligere å klargjøre mekanismen bak LFG-500 undertrykke MDA-MB-231 celle invasjon, undersøkte vi effekten av LFG-500 på disse transkripsjonsfaktorene. Dataene i fig. 3A viste at LFG-500 hadde ingen signifikant effekt på atomnivå c-Jun eller c-Fos (komponenter av AP-1). Dessuten var det ingen merkbar forandring i fosforyleringen av STAT3 når det gis den samme behandling (Fig. 3A). Imidlertid LFG-500 hemmet den nukleære translokasjon av NF-kB p65, med en redusert atomnivå, men en øket cytoplasmisk nivå (Fig. 3B), som ble bekreftet ved immunofluorescens-analyse (Fig. 3C). Dessuten ble den totale mengde av NF-kB p65 ble redusert etter LFG-500-behandling (fig. 3D). På grunn av at NF-kB aktivering resulterer fra hurtig fosforylering, ubiquitinering, og til slutt proteolytisk nedbrytning av IicB [33], så vel som ikk er nødvendig for fosforylering av IicB [34], fosforyleringen nivåene av IKKα /β og IκBα ble detektert . LFG-500 (4 mikrometer og 8 mm) hemmet effektivt fosforylering av IKKα /β og IκBα, mens de totale steady-state nivåer forble uendret (Fig. 3D). Disse resultatene indikerte at NF-kB i stedet for AP-1 eller STAT3 kan være involvert i den anti-invasiv effekt indusert ved LFG-500.
(A) LFG-500 ikke har noen signifikant effekt på AP-1 eller STAT3. Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner (2, 4, og 8 pM) av LFG-500 i 24 timer. De kjernefysiske nivåer av proteiner ble påvist ved Western blot-analyse ved bruk av spesifikke antistoffer. Lamin-A ble brukt som atom lasting kontroll. (B) LFG-500 hemmer kjernefysiske translokasjon av NF-kB. Cytosoliske og nukleære ekstrakter i cellene ble fremstilt i henhold til «Materialer og metoder». De nukleære og cytoplasmiske nivåer av NF-kB p65 ble bestemt ved Western blot analyse. (C) Den hemmende virkning av LFG-500 på den nukleære translokasjon av NF-kB. MDA-MB-231 celler ble immunostained med anti-NF-kB p65 (01:50) og DAPI (× 400, målestokken representerer 30 mikrometer). (D) Virkningene av LFG-500 på fosforylering nivåer av IKKα /β og IκBα. Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner (2, 4, og 8 pM) av LFG-500 i 24 timer, og ekspresjon av target-proteiner ble påvist ved Western blotting ved anvendelse av spesifikke antistoffer hvor β-aktin ble benyttet som kontroll lasting.
* P
0,05 eller
** P
. 0,01 representerer signifikant forskjell fra kontrollgruppen
Deretter DNA-bindende aktivitet av translocated NF-kB ble ytterligere evaluert.
In vitro
, atom ekstraktene ble inkubert med DNA-prober som er spesifikke for NF-kB, og deres binding ble bestemt ved bevegelighet skift. Som vist på fig. 4A, LFG-500 bemerkelsesverdig blokkerte den DNA-bindende aktivitet av NF-kB. For ytterligere å bekrefte dette, ble ChIP analyse utført for å teste bindingsaktiviteten av NF-kB til promoteren til MMP-9, som er NF-kB målgenet. Resultatene viste at bindingsaktiviteten ble betydelig hemmet etter LFG-500-behandling (fig. 4B). Fordi DNA-bindende alene ikke alltid korrelerer med NF-kB-avhengige gentranskripsjon [35], ble effekten av LFG-500 på NF-kB-avhengig rapportøraktivitet, også analysert. MDA-MB-231-celler ble ko-transfektert med GFP og PNF-kB-Luc plasmider. LFG-500 åpenbart undertrykt luciferase aktivitet, med om en tre-fold nedgang etter 8 mikrometer behandling (fig. 4C). Som vist på fig. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting.
