Abstract
aldehyd dehydrogenase isoform 1 (ALDH1) har blitt vist seg å være nyttig for identifisering av kreft stamceller. Imidlertid er vår kunnskap om uttrykk og aktivitet av ALDH1 i felles epiteliale kreftformer og tilhørende normalt vev fortsatt i stor grad fraværende. Derfor preges vi ALDH1 uttrykk i 24 typer normale vev og en stor samling av epitel vevsprøver (seks krefttyper, n = 792) ved immunhistokjemisk farging. Bruke ALDEFUOR analysen ble ALDH1 aktivitet også undersøkt i 16 primær vevsprøver og 43 etablerte epiteliale kreftcellelinjer. I tillegg ble en eggstokkreft transgen musemodell og 7 murine eggstokkreft cellelinjer analysert. Vi fant at uttrykket nivåer og mønstre av ALDH1 i epiteliale kreftformer er bemerkelsesverdig tydelig, og de korrelerer med tilhørende normalt vev. ALDH1 protein ekspresjonsnivåer er positivt korrelert med ALDH1 enzymatisk aktivitet målt ved ALDEFLUOR assay. Langsiktig
in vitro
kultur påvirker ikke signifikant ALDH1 aktivitet i epiteliale kreftceller. I samsvar med forskning på andre kreftformer, fant vi at høy ALDH1 uttrykk signifikant assosiert med dårlig klinisk utfall i serøs kreftpasienter på eggstokkene (n = 439, p = 0,0036). Endelig ALDH
br kreftceller utvise kreftstamcelleegenskaper og er motstandsdyktig mot cellegift. Som en roman kreftstamcelle markør, kan ALDH1 brukes for svulster som tilsvarer normalt vev uttrykke ALDH1 i relativt begrenset eller begrenset nivå som bryst, lunge, eggstokk eller tykktarmskreft
Citation. Deng S, Yang X , Lassus H, Liang S, Kaur S, Ye Q, et al. (2010) Tydelig uttrykk nivåer og mønstre for Stem Cell Marker, aldehyd dehydrogenase isoform 1 (ALDH1), i menneskelige epiteliale cancere. PLoS ONE 5 (4): e10277. doi: 10,1371 /journal.pone.0010277
Redaktør: Yihai Cao, Karolinska Institutet, Sverige
mottatt: 01.12.2009; Godkjent: 30 mars 2010; Publisert: 21 april 2010
Copyright: © 2010 Deng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Breast Cancer Alliance (LZ), den Ovarian Cancer Research funnet (Liz Tilberis Scholar, LZ), Mary Kay Ash Charitable Foundation (LZ), National Cancer Institute (R01CA142776 og eggstokkreft SPORE P50-CA83638-7951 prosjekt 3, LZ) og US Department of Defense (W81XWH-10-1-0082, LZ). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
forskning har gitt sterk støtte for den kreftstamcelle hypotese, som foreslår at et forholdsvis sjeldent subpopulasjon av tumorceller har den unike evne til å initiere og oppretttumorvekst [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10]. Disse cellene, kalt kreft stamceller eller tumor-initiering celler, dele ulike egenskaper med embryonale og somatiske stamceller inkludert selvfornyelse og multi-potent differensiering [11], [12], [13], [14], [15] , [16], [17]. Cancer stamceller kan være meget motstandsdyktig mot stråling eller kjemoterapi, [18], [19], [20], derfor, utvikling av mer effektive behandlinger for kreft krever effektiv målretting av denne cellepopulasjon [11], [12], [13 ], [14], [15], [16], [17]. Cancer stamceller kan bli identifisert og isolert ved hjelp av markører spesifikke for normal progenitor eller stamceller av samme organ [16], [21]. Flere markører har vist seg nyttig for isolering av undergrupper anriket for epiteliale kreft stamceller, inkludert CD44 /CD24 (HAS /PGP1) [3], CD133 (PROM1) [4], ATP-bindende kassett B5 (ABCB5) [22], CD90 (THY1) [23], CD61 (β3 Inte) [24], 26S-proteasomet aktivitet [25], så vel som Hoechst33342 utelukkelse [6], [26], [27].
aldehyd dehydrogenase ( ALDH) katalyserer irreversibel oksydasjon av en rekke alifatiske og aromatiske aldehyder til de tilsvarende karboksylsyrer [28]. Høy ALDH-aktivitet er detektert i stamceller og forløperceller i ulike linjene, inkludert hematopoetisk [29], [30], [31], mesenchymale [32], neural [33], bryst-[34], [35] og prostata [36] . Den ALDEFLUOR analysen ble opprinnelig utviklet for å oppdage ALDH aktivitet i blodkreft vev; det fluorescerende ALDEFLUOR reaksjonsproduktet akkumuleres i stamceller og korrelerer med ALDH-aktivitet [29]. ALDH konverterer ALDH substratet, BAAA (BODIPY-aminoacetaldehyd), inn i det fluorescerende produkt BAA (BODIPY-aminoacetat), som fastholdes inne i levedyktige celler. Celler som uttrykker høye nivåer av ALDH bli sterkt fluorescerende (ALDH
br), og kan identifiseres og telles ved anvendelse av en standard flowcytometer eller isolert ved cellesortering for ytterligere rensing og karakterisering. ALDECOUNT® er et FDA-godkjent
in vitro
diagnostisk produkt som er basert på ALDEFLUOR analysen og brukes for identifikasjon og telling av stamceller for kliniske anvendelser. I det siste har det ALDEFLUOR analysen blitt brukt til å oppdage tidlig forløper og kreftstamceller i ikke-blodkreft vev som brystkjerteltumorer og brystkreft [34]. Den ALDEFLUOR reagens som er kjent for å virke som et substrat for ALDH1. Viktigere, kan en ALDH1 spesifikke antistoff som brukes for å påvise kreft stamceller i parafininnstøpte kliniske prøver [34]. Flere uavhengige grupper har rapportert at ALDH1 uttrykk kan anvendes som en prognostisk markør for epiteliale cancere [34], [37], [38], [39], [40], [41], [42], [43]. Derfor kan ALDEFLUOR analysen og ALDH1 farging være nyttig for påvisning og isolering av kreft stamceller i epiteltumorer, og dermed legge til rette for innføring av kreftstamcelle konsepter til klinisk praksis [34]. Imidlertid vår kunnskap om ekspresjon og aktivitet av ALDH1 i humane epitel-kreftformer og deres tilsvarende normale vev, så vel som dens kliniske betydning, er fremdeles i sin barndom. For å fremme vår kunnskap på dette viktige området, karakterisert vi ALDH1 ekspresjon i 24 typer av normale humane vev, så vel som en stor samling av parafininnstøpte humane epitel-tumorprøver (seks krefttyper, n = 792) ved immunhistokjemisk farging. Bruke ALDEFUOR analysen ble ALDH1 aktivitet også undersøkt i 16 primær vevsprøver og 43 etablerte menneske epiteliale kreftcellelinjer. I tillegg ble en eggstokkreft transgen musemodell og 7 murine eggstokkreft cellelinjer analysert i vår studie.
Materialer og metoder
Fresh vevsprøver
Vev ble oppnådd etter under en generell vev samling protokoll godkjent av institusjonens Institutional Review Board (IRB) ved University of Pennsylvania pasienter skriftlig samtykke. Alle prøver ble oppsamlet på tidspunktet for kirurgi debulking fra tidligere ubehandlede pasienter med sent stadium eggstokkreft. Erytrocytter ble lysert med ammoniumkloridoppløsning. Enkeltcellesuspensjoner ble fremstilt ved anvendelse av en 40 um celle sil. Døde celler ble eliminert ved hjelp av magnetiske kuler (Døde Cell fjerning kit, Miltenyi Biotec) og en MidiMACS separator
Tissue microarrays
Tissue rekke nettverk kohort.
En FDA normalt menneske organ vev microarray ble brukt for å karakterisere ALDH1 uttrykk i normale organer. Dette vevet array plattform inkludert 24 typer normale menneskelige organer basert på FDA retningslinjene, og hvert organ ble samplet fra 3 normale individer. Seks typer av humant epitel svulstvev mikromatriser ble brukt for å karakter ALDH1 uttrykk i epiteltumorer. Hver pasient ble representert med minst to kjerne vevsbiopsier.
Helsinki kohort:
En eggstokkreft vev microarray ble brukt til å undersøke den prognostiske betydningen av ALDH1 i eggstokkreft. Matrisen inkludert pasienter behandlet i primær serøs ovarialcancer ved Helsinki University Central Hospital.
Cellelinjer og cellekultur
Totalt 50 etablerte kreftcellelinjer ble brukt i denne studien, inkludert 15 menneske bryst, 18 human ovarian, 7 muse-ovarie, og 10 human colon. Alle kreftcellelinjer ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen). Tre uavhengige udødeliggjorte humane ovarie overflate epitelceller (IOSEs) ble generøst gitt av Dr. Salzburg, og dyrket i en 01:01 kombinasjon av medium 199 og MCDB 105 medium (Sigma) supplementert med 15% FBS. Murine eggstokkene overflaten epitelceller (Moses) ble isolert og dyrket som tidligere rapportert [44].
gene mus
Den dyrestudie Protokollen ble gjennomgått og godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komité ( IACUC) ved University of Pennsylvania. Den eggstokkreft MISRII-SV40 transgen mus ble generert av Dr. Denise Connolly laboratorium [45].
Immunohistochemistry og bildeanalyse
Immunohistochemistry (IHC) ble utført ved hjelp av Vectastain ABC Kit som beskrevet av produsenten (Vector). De følgende primære antistoffer ble anvendt i denne studien: mus-anti-human ALDH1 (klon: 44 /ALDH, 1:250, BD Pharmingen) [34], [39], [46]; mus anti-human Ki67 (1:100, DAKO) og kanin-anti-human CD45 (1:200, Millipore). Antistoffer ble inkubert over natten ved 4 ° C. Immunreaksjonen ble visualisert med 3,3′-diaminobenzidin. Dobbelt immunofluorescerende farging ble utført som tidligere beskrevet [47].
ALDEFLUOR Assay
ALDH-aktivitet ble detektert ved å bruke ALDEFLUOR analysesett (StemCell Technologies) som beskrevet av fabrikanten. I korthet ble dissosiert enkle celler fra cellelinjer eller tumorprøver ble suspendert i ALDEFLUOR analysebuffer inneholdende et ALDH substrat, BODIPY-aminoacetaldehyd (BAAA), ved 1,5 uM og inkubert i 1 time ved 37 ° C. En spesifikk inhibitor av ALDH, diethylaminobenzaldehyde (DEAB), ved et 10-ganger molart overskudd, ble anvendt som negativ kontroll. Flowcytometri data ble analysert ved BD FACSDiva programvare V6.1.3 (BD Biosciences) eller FlowJo programvare (TreeStar).
protein isolasjon og Western blot
dyrkede celler ble lysert i 200 mL av lysis buffer inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, og 1% Triton X-100. Proteiner ble separert ved 10% SDS-PAGE under denaturerende betingelser og overført til nitrocellulosemembraner. Membraner ble inkubert med et anti-ALDH1 primære antistoff (1:300, BD Pharmingen), etterfulgt av inkubering i anti-muse-sekundært antistoff konjugert med pepperrot peroksidase (1:5,000; Amersham Biosciences). Immunreaktive proteiner ble visualisert ved hjelp av ECL Western blotting substrat (Thermo Scientific).
Mammosphere kultur
Mammosphere kulturer ble utført som beskrevet av Dontu
et al product: [48]. I korte trekk ble enkeltceller sådd ut i ultra-lav feste 24-brønners plater (Corning) med en tetthet på 20.000 levedyktige celler /ml og 5000 celler /ml i etterfølgende passeringer. Cellene ble dyrket i et serumfritt mammosphere kulturmedium (MammoCult, StemCell Technologies) supplert med MammoCult Formerinasanalyse kosttilskudd. Mammospheres ble samlet ved forsiktig sentrifugering (800 rpm) etter 7-10 dager, og dissosiert både mekanisk og enzymatisk (10 min i 0,05% trypsin, 0,53 mM EDTA-4Na-).
In vivo
tumorigent analysen
den dyrestudie protokollen ble gjennomgått og godkjent av institusjonelle animal Care og bruk komité (IACUC) ved University of Pennsylvania. Seks til åtte uker gamle hunnimmunmangelfull mus ble benyttet i disse studiene. ALDH
lav og ALDH
br (ALDH
lyse) celler ble isolert ved FACS sortering. Cellene ble suspendert i fosfat-bufret saltløsning blandet med et likt volum av Matrigel (BD Biosciences) ved 10 mg /ml. Et totalt volum på 0,3 ml, inneholdende 500; 5.000 eller 50.000 celler, ble injisert subkutant (ovariektomisert og østrogen-pellet supplert mus).
MTT-analysen
MTT-analyser ble utført i 96-brønners plater ved bruk av celleproliferasjon Kit (I) ( Roche) etter produsentens anvisninger.
statistisk analyse
statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS og Statview statistiske programvarepakker.
Resultater
Expression og distribusjon av ALDH1 protein i normale humane vev
Som et stamcelle-markør, ALDH1 har vært brukt for å påvise kreft stamceller i flere typer humane epiteltumorer ved hjelp av immunhistokjemisk farging; imidlertid sine uttrykk og fordelingsmønstre i normal menneskelig vev er fortsatt i stor grad ukjent. For å løse dette viktige spørsmålet, preget vi uttrykket mønster av ALDH1 i normale menneskelige vev ved immunhistokjemisk farging. En FDA-godkjent normalt humant vev organ mikroarray ble anvendt i denne studien. Her ble 24 typer normale menneskelige organer inkludert basert på FDA retningslinjer, der hvert organ ble tatt fra 3 normale menneskelige individer. Mus anti-humant ALDH1 antistoff (klon: 44 /ALDH) [34], [39], [46] ble brukt til å påvise ALDH1 uttrykk. Som vist i figur 1A, ble ALDH1 positiv farging detektert hovedsakelig i cytoplasma, og ble allment uttrykt i fordøyelsessystemet (inkl epitelet av spiserør, mage, tarm og tykktarm, samt lever og bukspyttkjertel), det endokrine systemet (inkludert binyrene, hypofysen, skjoldbruskkjertelen og spyttkjertel) og reproduktive systemet (eggstokk og testikler). Det var ingen påvisbare ALDH1 positive celler i storhjernen og lillehjernen (figur 1A). I andre organer, ble ALDH1 fordelt i visse områder og i spesifikke celletyper. For eksempel, i milten, ALDH1 positive celler ble hovedsakelig funnet i leukocytter i de røde masse områder, men ikke i den hvite masse (figur 1A). Viktigere, i samsvar med andre rapporter [34], [46], [49], sterkt ALDH1-positive celler ble funnet i de områdene hvor epitelial stamceller /progenitorceller ble putatively plassert i bryst, tykktarm og mage (figur 1B). I normal bryst, ble ALDH1 positive celler hovedsakelig lokalisert i den luminal-regionen (figur 1B), og de var en forholdsvis sjelden populasjon (1-2% av luminale epitel-celler). Små ALDH1 positive celler ble også funnet i normalt bryst stroma (figur 1B). Dobbelt immunhistokjemisk farging viste at de fleste av disse cellene ( 90%) ble CD45 positive leukocytter (data ikke vist). I den normale tykktarm, selv om svakt ALDH1 positive celler ble funnet i nesten alle normale krypter, antall sterkt positive ALDH1-celler ble ganske begrenset (figur 1B). Disse sterkt positive celler ble hovedsakelig lokalisert på baser av krypter (Figur 1b). Lignende fargemønstre er også sett i magen (figur 1B).
A. En FDA normal menneskelig organ vev microarray ble brukt for å karakterisere uttrykk og distribusjon av ALDH1 i 24 vev. B. Sterkt positive ALDH1 celler ble funnet i de områdene der epiteliale stamceller /stamceller ble putatively lokalisert i bryst, tykktarm og mage.
Expression og distribusjon av ALDH1 protein i menneske epiteltumorer
Deretter undersøkte vi ALDH1 uttrykk i menneskelig epiteltumorer bruker vev arrays. Som vist ovenfor, mønstre og nivåer av uttrykk for ALDH1 i normal menneskelig vev er bemerkelsesverdig forskjellig og kan deles inn i tre typer: 1) vev med fraværende eller begrenset ALDH1 uttrykk, som brystkreft eller lunge; 2) vev med relativ svak ALDH1 uttrykk, for eksempel kolon eller gastrisk epitel; og 3) vev med utstrakt og høy ekspresjon av ALDH1 slik som lever eller bukspyttkjertel (figur 1A). Derfor valgte vi seks typer (bryst, n = 69, lunge, n = 66, eggstokkene, n = 65, tykktarm, n = 67, lever, n = 67, og kreft i bukspyttkjertelen, n = 19) av epiteliale kreftformer som har tilsvarende normale epitheliums var representant for hver subtype. I alle seks tumortyper, ble et stort antall ALDH1 positiv tumor-infiltrerende stromale celler funnet (figur 2B). Dobbelt farging viste at de fleste av disse var CD45 positive celler. Prosentandelen av ALDH1 positive tumorceller i kreft holmer ble uavhengig kvantifisert ved to etterforskere med patologisk trening. Stromal ALDH1 positive celler ble ekskludert fra denne analysen. Vi fant ut at ALDH1 uttrykk var negativ i 79,7% (55/69) av bryst, 18,2% (12/66) av lunge og 23,1% (15/65) av eggstokkreft. Tvert imot, bare 6,0% (4/67) av tykktarmen og 5,3% (1/19) av pankreatiske cancere var ALDH1 negativ, og alle leverkreft prøver var ALDH1 positive. I tillegg, for de ALDH positive tumorer, prosentandelen av tumorceller som uttrykker ALDH1 ble også analysert. Den detaljerte prosentandel av ALDH1 positive cancerceller er oppsummert i figur 2C. Bortsett fra i tilfeller av brystkreft (4,3%), en høy andel av ALDH1 uttrykket (mellom 75 til 100% av tumorceller) ble funnet i hver av de fem andre krefttyper (ovarie: 29,2%, colon: 38,8%, lunge : 43,9%, bukspyttkjertel 78,9% og lever: 97,0%). Tatt sammen, var det en klar korrelasjon mellom ALDH1 uttrykk mellom tumorer og tilsvarende normale vev. For eksempel, i de krefttyper hvor ALDH1 ble sterkt uttrykt i de tilsvarende normale epitheliums, slik som lever og bukspyttkjertel kreft, ble ALDH1 uttrykt i de fleste tumorprøver ved usedvanlig høye nivåer.
microarray ble anvendt for å karakterisere ekspresjon og fordeling av ALDH1 i kreftformer (n = 353). A. Ekspresjon av ALDH1 i de tilsvarende normale vev. B. ALDH1 + tumor-infiltrerende celler ble detektert i stroma. C. Expression of ALDH1 i epiteltumorer. Andel ALDH1 + tumorceller ble oppsummert. D. høy prosentandel av ALDH1 + -celler var forbundet med dårlige kliniske resultater i serøs eggstokkreft.
Det er blitt rapportert av uavhengige grupper som en høy prosentandel av ALDH1 positive tumorceller er forbundet med kortere overlevelsestider i bryst [34], [37], [42], lunge [38], bukspyttkjertel [40], blære [41] og [43] prostata kreftpasienter. Vi testet den prognostiske verdien av ALDH1 bruke en vev utvalg av serøse eggstokkreft, den vanligste histotype av menneskelig epitelial eggstokkreft. Prøvene ble samlet inn fra Institutt for gynekologi og obstetrikk ved universitetet i Helsinki Central Hospital. Median oppfølgingstid av pasientene i live ved slutten av studieperioden var 101 måneder, alt fra 4 til 475 måneder. Pasientene ble delt inn i to grupper basert på ALDH1 farging: ALDH1 lav ( 10% tumorceller var ALDH1 positive) og ALDH1 høy (≥10% tumorceller var ALDH1 positive). I samsvar med resultatene fra bryst [34], [37], [42], lunge [38], bukspyttkjertel [40], blære [41] og prostata [43] kreftpasienter, fant vi at pasienter med høyt ALDH1 hadde kortere sykdom og total overlevelse ganger i forhold til de med lav ALDH1 (p = 0,0036 og p = 0,023, henholdsvis figur 2D).
ALDH1 enzymatisk aktivitet i epiteliale kreftceller
ALDEFLUOR reagens, opprinnelig utviklet for å detektere ALDH-aktivitet i hematopoietiske vev [29], er kjent for å virke som et substrat for ALDH1. Nylig har ALDEFLUOR analysen blitt brukt til å påvise ALDH
br i kreftstamceller fra ikke-hematopoietiske tumorer [34]. I denne studien, benyttet vi denne analysen å undersøke ALDH1 enzymatisk aktivitet i epiteliale kreftceller
in vitro
. Først, for å validere resultatene av vev matrisen, valgte cellelinjer fra tre epiteliale krefttyper, inkludert bryst (n = 15), eggstokk (n = 18) og kolon (n = 10). Som vist i figur 2, er prosentandelen av tumorer med en høy frekvens av ALDH1 positive celler var større i tykktarmskreft i forhold til brystkreft eller eggstokk-cancer. I samsvar med dette funnet, fant vi at andelen av ALDH
br celler i tykktarm kreft cellelinjer (15,5 ± 11,5%) var bemerkelsesverdig høyere enn i bryst (3,5 ± 4,8%) eller eggstokkene (6,2 ± 13,5%) kreftcelle linjer (Figur 3B og Tabell S1). For ytterligere å bekrefte dette resultatet, vi har oppdaget ALDH1 protein uttrykk av vestlige blotter i disse cellelinjene. Som forventet, ble ALDH1 protein ekspresjonsnivåer positivt korrelert med prosentandelen av ALDH
br-celler i cellelinjer (figur 3C og fig S3). Selv om det var en klar positiv korrelasjon mellom
in situ
farging og ALDEFLUOR analyseresultatene i disse tre tumortyper, prosentandelen av celler som oppviser ALDH1 enzymatisk aktivitet ved strømningscytometri var mindre enn prosentandelen av ALDH1 positive celler ved immunfarging . For eksempel, 4,3%, 29,2% og 38,8% av bryst, ovarier og tykktarmskreft prøver høyt uttrykte ALDH1 (mellom 75 til 100% av tumorcellene var ALDH1 positive, figur 2C), men ingen av de tumorcellelinjer var sammensatt av større enn 75% av ALDH
br-celler (Tabell S1). Deretter valgte vi eggstokkreft som et eksempel for å undersøke ALDH enzymatisk aktivitet i primærtumorceller. Seksten sent stadium eggstokkreft prøvene ble undersøkt. Siden vi fant ut at tumor-infiltrerende leukocytter uttrykte høye nivåer av ALDH1 (figur 2B), vi først separert ascitesceller av CD326 (EpCAM, en epitelial markør til gate svulsten cellepopulasjon) eller CD45 (en lymfocytt maker til gate Lymfocyttpopulasjonen) etter fjerne døde celler ved hjelp av magnetiske kuler. Den ALDEFLUOR-analysen ble brukt til å påvise celler med ALDH-aktivitet i hver av ovennevnte populasjon (figur 4A). Vi fant at 2,6 ± 3,1% (0,1 til 11,3%) av CD45 positive celler var ALDH
br (figur 4B). I samsvar med cellelinjen studien, 1,1 ± 1,9% (0,1 til 7,0%) av CD326 positive tumorceller var ALDH
br (figur 4B), en lavere andel enn i farging resultater.
A. ALDH1 enzymatisk aktivitet ble detektert ved å anvende den ALDEFLUOR analysen. DEAB ble anvendt for å inhibere reaksjonen av ALDH med ALDEFLUOR reagens, noe som gir en negativ kontroll. B. Oppsummering av ALDH1 enzymatisk aktivitet i etablert bryst (n = 15), eggstokk (n = 18) og kolon (n = 10) cancercellelinjer. C. ALDH1 protein uttrykk ble oppdaget av vestlige blotter. Det var en positiv korrelasjon mellom ALDH1 protein uttrykk og ALDH1 enzymatisk aktivitet. Full-lengde blotter er presentert i Supplemental Figur S3.
A. ALDH1 enzymatisk aktivitet i celler isolert fra en eggstokkreft prøven. Døde celler ble eliminert ved hjelp av magnetiske kuler og en MidiMACS separator. For immunfenotyping av ALDH
br ascitesceller, APC-CD45 eller APC-CD326 ble brukt for kontra. DEAB ble anvendt for å inhibere reaksjonen av ALDH med ALDEFLUOR reagens, noe som gir en negativ kontroll. B. Oppsummering av prosenter av ALDH
br i hver celle befolkningen fra 16 sene stadier av eggstokkreft kreftpasienter.
For å ta opp spørsmålet om langsiktig
in vitro
kultur vil påvirke ALDH aktivitet i kreftcellelinjer, vi valgte en eggstokkreft transgen musemodell, hvor en onkogen (den transformerende region av SV40) ble overuttrykt av eggstokkreft overflaten bestemt Mullerian hemmende stoff type II reseptor (MISRII) promoter (Figur S1 A). Den ALDEFLUOR Analysen ble utført på både primære isolerte tumorceller og to langsiktige kulturer av tumorcellelinjer (mer enn 40 passasjer) som ble isolert fra den samme modellen. Vi fant ut at det var ingen signifikant forskjell i andelen ALDH
br celler mellom primære tumorer (9,5 ± 7,6%, n = 5) og langsiktige cellekulturer (6,8 ± 4,9%, n = 2, P 0,05 Figur S1B). Siden bare et begrenset antall cellelinjer ble analysert i denne studien, trenger denne konklusjonen ytterligere validere i andre modeller.
Til slutt sammenlignet vi ALDH aktivitet i eggstokkreft celler og deres tilsvarende normale epitheliums, eggstokkene overflate epitelceller. Tre udødeliggjort menneskelige eggstokkene overflaten epiteliale cellelinjer ble sammenlignet med 18 menneskelige eggstokkreft cellelinjer, og primær isolerte murine eggstokkene overflateceller ble sammenlignet med 7 muse eggstokkreft cellelinjer (inkludert to linjer fra MISIIR-SV40 transgene mus). Vi har funnet at andelen av ALDH
br-celler var relativt høyere i normal ovarie flate epitel-celler (human: 13,1 ± 6,72%, n = 3; murine: 7,6%, n = 1) sammenlignet med eggstokkreft celler (human: 6,2 ± 13,5%, n = 18; murine: 3,8 ± 2,92%, figur S2). Tilsvarende prosentandelen av ALDH
br-celler var relativt høyere i normale bryst epitelceller (8,18 ± 4,31%, n = 14) [34] i forhold til brystcancerceller (3,5 ± 4,8%, n = 15, figur 3) .
ALDH
br kreftceller har kreftstamcelleegenskaper og motstått kjemoterapi
Det er vist at ALDH
br kreftceller isolert fra primære humane svulster eller fra kort -term passasjer av celler fra NOD /SCID mus har kreft stamcelleegenskaper [34] og er motstandsdyktig mot kjemoterapi [50], [51]. For å undersøke kreftstamcelleegenskaper av ALDH
br celler isolert fra etablerte langsiktige dyrkede cellelinjer, ALDH
lav og ALDH
br tumorceller ble isolert fra etablert human bryst- og eggstokk-kreft cellelinjer ved FACS sortering. Først ble deres selvfornyelse evne undersøkt ved hjelp av mammosphere analyse [48] i fire brystkreft celler. Antallet mammospheres dannet av ALDH
br tumorceller var signifikant høyere enn ved ALDH
lave tumorceller (figur 5A). ALDH
lave celler fra T47-D og ZR-75-1 cellelinjer som manglet evnen til å danne mammospheres i suspensjonskultur. Deretter undersøkte vi deres
in vitro
tumorvekst evner å bruke den kolonidannelse analysen i fem brystkreftcellelinjer. ALDH
br kreftceller dannet synlig større kolonier i forhold til ALDH
lave tumorceller (figur 5B). I tillegg koloni tall fra ALDH
br kreftceller var betydelig høyere enn fra ALDH
lave tumorceller (figur 5B). Til slutt,
in vivo
tumorigent evne ALDH
lav og ALDH
br tumorceller ble undersøkt ved hjelp av kreftceller som ble pode-transplanterte (500; 5000, eller 50 000) til immunmangelfull mus . Vi fant ut at 500 ALDH
br men ikke ALDH
lave kreftceller var i stand til å generere xenografttumorer
in vivo plakater (figur 5C). Histologi av tre xenografttumorer ble undersøkt av HE farging. I MCF-7 og SKBR-3 cellelinjer, var det ingen signifikant histologisk forskjell mellom ALDH
br og ALDH
lave svulster. Men i BT-474 svulster, ble det begrenset stromale celler i ALDH
br svulster i forhold til ALDH
lave svulster (figur 5D).
In vivo
celleproliferasjon ble også undersøkt ved hjelp av Ki-67 farging. Vi fant ingen signifikant forskjell i indeksen spredning (prosentandel av Ki-67 positive celler) mellom ALDH
br og ALDH
lave svulster i alle tre cellelinjer (figur 5E).
EN. ALDH
br celle populasjoner (blå) generert betydelig høyere antall mammospheres forhold til ALDH
lav befolkning (gul). B. tumorigenitet av ALDH
br og ALDH
lave celler ble undersøkt
in vitro
bruker kolonidannelse analyser. C. tumorigenitet av ALDH
br og ALDH
lave celler ble undersøkt
in vivo
. D. Histologi av ALDH
br og ALDH
lave BT-474 svulster ble undersøkt av HE farging. E. spredning av ALDH
br og ALDH
lave BT-474 svulster ble undersøkt ved Ki-67 farging.
Raskt akkumulere bevis tyder på at kreftstamceller kan være svært motstandsdyktig mot stråling eller kjemoterapi, [18], [19], [20]. I samsvar med disse funnene, fant vi at ALDH
br cellepopulasjonen er utvidet i et sett av platina resistente eggstokkreft cellelinjer, A2780 /CP70, A2780 /C200 og A2780 /C30, sammenlignet med foreldre platina sensitiv linje, A2780 /WT (Figur 6A). Videre behandling av celler med cisplatinaindusert (1XIC
50) betydelig beriket ALDH
br cellepopulasjon i eggstokkene og brystkreftcellelinjer
in vitro plakater (Figur 6B). Den ALDH
br befolkningen var betydelig mer motstandsdyktig mot platina behandling i forhold til ALDH
lav befolkning (figur 6C). Til slutt tester vi de ovennevnte observasjon
in vivo
ved hjelp av en eggstokkreft xenograft mus modell. Tre uker etter implanteringen av tumorceller, A2780 (5 x 10
6 per dyr) ble musene tilfeldig inndelt i tre eksperimentgrupper for å motta behandling ved i.p. injeksjon med 1) kontrollbehandling (n = 4), 2) 2 mg /kg cis-platina-behandling (½ maksimalt tolererte dose (MTD), n = 3) og 3) 4 mg /kg cis-platina behandling (full MTD, n = 3). Den q7d × 4 i.p. behandlingsplan (figur 6D) ble anvendt for den eksperimentelle behandling. Andel av ALDH positive befolkningen ble analysert ved ALDEFLUOR analysen. I samsvar med vår
in vitro
data, cis-platina behandling betydelig økt ALDH
br cellepopulasjonen i xenograft tumor
in vitro plakater (Figur 6D, ½ MTD: 8,44 ganger i gjennomsnitt , fulle MTD: 4.67 ganger i gjennomsnitt, sammenlignet med ikke-behandlede svulster). Det tyder på at ALDH
br tumor cellepopulasjonen er resistent mot kjemoterapi. Lignende resultater ble også rapportert i tykktarmskreft
in vivo
sist av en uavhengig gruppe [50].
A. ALDH
br celler ble bemerkelsesverdig utvidet i platina resistente cellelinjer (A2780 /CP70, A2780 /C200 og A2780 /C30) i forhold til foreldre platina sensitiv linjen (A2780 /WT). B.
In vitro
platina behandling økt betydelig de ALDH
br cellepopulasjon i eggstokkene og brystkreftcellelinjer etter tre dager. C. ALDH
br celler var resistente mot platina behandling. ALDH
br og ALDH
lave celler ble isolert ved FACS sortering. D. ALDH
br tumor cellepopulasjonen var resistent mot kjemoterapi
in vivo
. Den q7d × 4 i.p. behandlingsopplegg ble benyttet for den eksperimentelle behandling. Svulster ble samlet og tilknytningen av enzymoppslutning. Andel av ALDH
br befolkning ble analysert ved ALDEFLUOR analysen.
Diskusjoner
Som en ny tilnærming, kan ALDEFLUOR analysen og ALDH1 farging være nyttig for påvisning og isolasjon av kreft stamceller i epiteltumorer, og dermed legge til rette for bruk av kreftstamcelle konsepter til klinisk praksis [34]. Vi fant at mønsteret og graden av ekspresjon av ALDH1 i normale humane vev er bemerkelsesverdig forskjellig og kan bli klassifisert i tre typer: 1) vev med fraværende eller begrenset ALDH1 uttrykk, slik som brystkreft eller lunge; 2) vev med relativ svak ALDH1 uttrykk, for eksempel kolon eller mage epitheliums; og 3) vev med utstrakt og høy ekspresjon av ALDH1, slik som lever eller bukspyttkjertel (figur 1A).
