Abstract
Bakgrunn
I tillegg til å være ansvarlig for energiproduksjon i cellen, mitokondrier er sentrale aktører i apoptose så vel som den viktigste kilden til skadelige reaktive oksygenforbindelser. Derfor kan det som en hypotese at sekvensvariasjon i det mitokondrielle genomet er en medvirkende faktor til etiologien av sykdommer relatert til disse forskjellige cellulære hendelser, inkludert kreft. Formålet med denne studien var å vurdere hyppigheten av haplogruppene og polymorfismer i kontrollområdet (CR) av mitokondrisk DNA av perifere mononukleære blodceller fra pasienter med prostata carcinoma (n = 304) som funksjon av pasienter screenet for prostatasykdom, men funnet å være negativ for kreft på biopsi (n = 278) i Midt europeiske befolkningen.
metodikk /hovedfunnene
de ni store europeiske haplogrupper og CR polymorfismer ble identifisert ved hjelp av primer extension analyse og DNA-sekvensering, respektivt. Vi fant ut at mitokondrie haplogroup hyppighet og CR polymorfismer ikke signifikant forskjellig mellom pasienter med og uten prostatakreft, noe som tyder på ingen innvirkning arvet mitokondrie-DNA variasjon på predisposisjon for prostata kreft i Midt europeiske befolkningen.
Konklusjon /Betydning
Våre resultater kontrast med en fersk rapport hevder en sammenheng mellom mtDNA haplogruppe U og prostatakreft i en nordamerikansk befolkning på kaukasisk avstamming
Citation. Mueller EE, Eder W, Mayr JA, Paulweber B , Sperl W, Horninger W, et al. (2009) mitokondrie Haplogroups og kontrollområdet Polymorfisme er ikke knyttet til prostatakreft i midtre europeiske kaukasiere. PLoS ONE 4 (7): e6370. doi: 10,1371 /journal.pone.0006370
Redaktør: Andrew Vickers, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, USA
mottatt: 24 april 2009; Godkjent: 24 juni 2009; Publisert: 28.07.2009
Copyright: © 2009 Mueller et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra «Oesterreichische Krebshilfe – Krebsgesellschaft Tirol» og Paracelsus Medical University Salzburg (07/05/027). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er en viktig dødsårsak i den industrialiserte verden. Det er den hyppigste kreftformen blant menn i USA og den nest vanligste i EU [1], [2].
En endring i cellenes energiproduksjon fra oksidativ fosforylering i mitokondriene til anaerob glykolyse, kalt Warburg effekten, er en grunnleggende egenskap av kreftceller. På grunn av den vesentlige rollen som enzymer kodet av mitokondrie DNA (mtDNA) i energiomsetningen, har endringer i mitokondrie genome vært mistenkt for å være i stand til å forårsake en metabolsk endring i tumorer [3]. Videre er mitokondrie respiratorisk aktivitet forbundet med generering av reaktive oksygenarter (ROS), som kan bidra til etiologien og progresjon av kreft [4]. Fordi mitokondrier spiller viktige roller i både ROS produksjon og apoptose, er konklusjonen at de kunne påvirke forekomsten av kreft lett trekkes.
De fleste eukaryote celler inneholder hundrevis av mitokondrier som rommer mange kopier av mtDNA [5], [ ,,,0],6]. Den sirkulære og dobbelt-trådet mitokondrielle genom er i området rundt 16 kilobasepar lang og kan videre deles inn i to regioner: den kodende region og kontrollområdet. Den kodende region består av 37 gener 24 som koder for komponenter av det mitokondrielle translasjonelle maskineri og 13 gener som gir vesentlige subenheter av energigenererende enzymer fra oksidativ fosforylering (OXPHOS) pathway [5], [7]. Kontrollområdet (CR), som er ikke-kodende, inneholder to hypervariable regioner (HVI og HVII) og en forskyvning (D-løkke) region, og er involvert i mtDNA replikasjon og transkripsjon [8].
den menneskelige befolkning har samlet et stort antall mtDNA basesubstitusjoner sammen stråler mors slektsnavn, av hvilke spesifikke kombinasjoner utgjør de såkalte mitokondrielle haplogrupper [7], [9]. Ni forskjellige europeiske mtDNA haplogruppene (H, U, J, T, K, W, I, V, X) ble definert av Torroni et al. [10], [11]. Selv om de fleste mitokondrielle polymorfismer antas å være nøytral, kan populasjonsspesifikke mtDNAs være funksjonelt forskjellige og utøve ulike påvirkninger på utfallet av sykdommer [7], [12] -. [14]
MITOKONDRIELLE haplogrupper og polymorfismer ha vist seg å ha sammenheng med kreftutvikling. For eksempel er mtDNA 10398A polymorfisme innblandet i økt ROS produksjon, og ble funnet å være en risikofaktor for brystkreft og spiserørskreft i indisk pasienter, og for invasiv brystkreft i afrikansk-amerikanske kvinner [4], [15]. I tillegg ble det asiatiske haplogruppe D funnet å være assosiert med en høyere risiko for å utvikle livmorkreft i Kina [16]. I kaukasiske populasjoner, ble haplogruppe K forbundet med en betydelig økning, og haplogruppe U en betydelig reduksjon i risikoen for brystkreft [17].
Booker et al. [18] rapporterte en forhøyet frekvens av haplogruppe U i prostata karsinom pasienter i en studie av nordamerikanske hvite. Dette kaukasisk haplogruppe ble korrelert med en to-fold risiko for å utvikle sykdommen [18].
Vi forsøkte å gjenskape den sistnevnte studien på en Middle europeiske befolkningen. Fordi sammenslutninger av aldersrelaterte sykdommer har blitt demonstrert ikke bare med mitokondrielle haplogrupper, men også med enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) i CR [19], vi også undersøkt sekvensvariasjoner i HVI og HVII i våre kohorter.
Resultater
Vi vurderte de ni store europeiske haplogrupper samt CR polymorfismer i perifert blod mononukleære celler av 582 kaukasiske menn, 304 av dem ble diagnostisert med prostatakreft; de resterende 278 ble identifisert med forhøyede serum PSA-nivå, men var histologisk negative for kreft ved prostatabiopsi og tjente som kontrollgruppe. Kliniske kjennetegn ved kreftpasienter og kontroller er vist i Tabell 1. Det ble observert Alle ni europeiske haplogruppene i vår kohort. Frekvensen av mitokondrielle haplogrupper var ikke signifikant forskjellig mellom pasienter med prostatakreft og kontrollpersoner (tabell 2). Når mitokondrie haplogroup hyppighet ble sammenlignet mellom kreftpasienter med biopsi Gleason Score ≤6 til kreftpasienter med biopsi Gleason Score ≥7 heller ingen signifikante forskjeller ble observert (Tabell 3).
den mitokondrielle CR ble sekvensert og analysert mellom nucleotide posisjoner 16145 og 530. To hundre og nitten polymorfismer ble funnet blant de 582 forsøkspersoner, med 197 homoplasmic enkelt base pair-utveksling, 10 enkeltrom base par slettinger og 5 enkeltbase pair innsettsammenlignet til den reviderte Cambridge Reference Sequence. To prøver presenteres samme seks basepar sletting av nukleotider 106 til 111. Et CA-sletting i posisjonene 514 og 515 forekom 40 ganger, og CA-innsettinger og caca-innsett ble også funnet på dette området 64 ganger. CC-innsettinger skjedde ved posisjonene 302 og 310, og heteroplasmy ble funnet i en prøve (A 16280 A /G). Av disse 219 polymorfismer, er 16 ikke oppført i MITOMAP eller menneskelige mitokondrie Genome Database (www.mitomap.org; www.genpat.uu.se/mtDB/). Alle polymorfismer og deres frekvenser i kontroll- og kreft studiegrupper er oppført i tabell Tilsetnings S1
To av de 219 polymorfismer -. A 189 G, og T-310 C – ble funnet å ha en betydelig lavere frekvens i kreftpasienter sammenlignet med kontrollpopulasjon (p 0,05) (tabell 4, Supplementary Tabell S1). Men betydningen ble tapt etter korreksjon for multiple sammenligninger (Bonferroni analyse), som fører til en ny obligatorisk signifikansnivå på 0,00023. Tabell 4 lister de 35 polymorfismer med en frekvens ≥ 5% i enten kontroll eller prostatakreft studiegruppen.
Diskusjoner
Formålet med denne studien var å gjenskape undersøkelse av Booker et al. [18], som utførte en case-control studie på 221 hvite menn med prostatakreft og 246 hvite kontroller i Nord-Amerika og fant mitokondrie haplogruppe U for å bli overrepresentert i kreftgruppen sammenlignet med kontrollgruppen (OR: 1,95). I Mellom-Europa kaukasiere vi fant ikke signifikante forskjeller mellom de haplogroup utdelinger i prostatakreftpasienter sammenlignet med kontrollene. Justering for multiple sammenligninger brukt til studiet av Booker et al. også ført til tap av statistisk signifikans [18]. Den haplogruppe fordeling av det nordamerikanske studien ligner fordelingen i våre kreftpasienter, mens kontrollgruppen i studiet av Booker et al. [18] er underrepresented for haplogroup U med omtrent 45% sammenlignet med vår kontrollgruppen (tabell 5). Når vi sammenlignet amerikanske tilfelle gruppen til den østerrikske kontrollgruppen ingen signifikant sammenheng av haplogruppene til prostatakreft ble oppdaget
For å utelukke at det å ha prostataproblemer generelt -. Indikert av forhøyet PSA serumnivåer i vår pasientgruppen og kontrollgruppen – er assosiert med en høyere haplogruppe U frekvens, vi videre vurdert haplogruppe U frekvens blant deltakerne i SAPHIR studien (Salzburg Åreforkalkning forebyggende program, som tidligere publisert [14], [20]). Frekvensen av haplogruppe U i våre kontroll- og prostatakreft gruppene er ikke signifikant forskjellig fra disse sunne SAPHIR fag. En undergruppe av denne gruppen, som bare består av menn (n = 988, gjennomsnittsalder 49 år), har også en frekvens på haplogroup U lik den prostatakreft gruppen (data ikke vist). Videre hyppigheten av haplogruppe U blant 277 tilfeldig vesteuropeiske kaukasiere studert av Brandstätter et al. [21] er heller ikke vesentlig forskjellig fra den frekvens i vår kontrollgruppen (tabell 5). De fagene som studien ble registrert på samme Universitetssykehus i Østerrike hvor våre pasient og kontroll kohorter ble recruted.
I mtDNA relaterte epidemiologiske studier betydningen av kontrollgrupper har blitt understreket tidligere [22], [ ,,,0],23]. Det er flere grunner som kan forklare avvikende resultater. For eksempel kan regionale variasjoner, alder eller kjønnsforskjeller påvirke utfallet av statistiske beregninger. Booker et al. [18] definerer ikke om deres kontroll befolkningen besto utelukkende av menn eller også inkludert kvinner. Deres kontroll kohorten besto av organdonorer, som i USA må tydelig uttrykke sitt ønske om å bli organdonor; dermed avhengig av tilbøyeligheter av ulike etniske grupper til å donere organer, organdonor banker kan ha forskjellige haplogroup distribusjoner sammenlignet med den generelle befolkningen. Den midlere alder på sine kontroller var mindre enn den til pasienter med kreft. Alder kan ha en innvirkning på regional befolkning variasjon, spesielt i et land som USA med en stor innvandrerbefolkning. Innvandring mønstre kan ha endret seg over en periode, noe som fører til forskjellige haplogroup distribusjoner i ulike aldersgrupper av befolkningen.
I en annen studie fra USA som søkte å gjenskape resultatene av Booker et al. [18] med hensyn til en assosiasjon mellom haplogruppe U og prostatakreft hos hvite menn, Canter et al. [24] rapporterte haplogroup U prosenter av 26,7% for deres prostatakreft gruppe (n = 71) og 11,7% for deres kontrollgruppen (n = 128). En begrensning av studiet er det lave antall pasienter med prostatakreft. Videre gjør sitt korte rapporten ikke gi karakteristikker av deltagerne eller hvordan de ble valgt.
Det kan ikke utelukkes at geografisk variasjon av haplogroup hyppighet i kontrollstudiepopulasjoner er til stede mellom Østerrike og USA.
I samsvar med våre resultater, en koreansk studie fant ingen sammenheng mellom eventuelle mitokondrielle haplogrupper og prostata kreft [25]. Den felles sett av 22 østasiatiske haplogrupper ble undersøkt og ble observert noen statistisk signifikant forskjell i fordelingen av mtDNA haplogruppe frekvenser mellom sak (n = 139) og kontrollgrupper (n = 122).
Sammenligning CR polymorfismer av kreftpasienter til kontroller fant vi to av 219 statistisk signifikante forskjeller, som mistet sin betydning etter korreksjon for multiple sammenligninger.
som vi analysert bare mitokondrielle haplogrupper og kontroll regionens polymorfismer, vi kan ikke utelukke at polymorfismer i mitokondrie-kodende regionen, er ikke inkludert i de forhåndsdefinerte haplogroup polymorfismer, kan være forbundet med prostatakreft. En annen begrensning av analysen er den lave studien strøm. Svært store utvalgsstørrelsene ville være nødvendig å pålitelig oppdage en beskjeden forskjell i haplogroup hyppighet mellom to grupper [26].
Somatiske mutasjoner av mtDNA er rapportert i en rekke kreftformer, inkludert prostata kreft [27], [ ,,,0],28]. I denne studien bare blod genomiske DNA-prøver var tilgjengelig for oss, og derfor ingen assosiasjoner mellom somatiske mutasjoner /polymorfismer kunne fastsettes.
I konklusjonen, vi fant ikke noen mitokondrielle haplogrupper eller CR polymorfismer å bli assosiert med prostatakreft i en østerriksk befolkningen.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
undersøkelsen ble gjennomført i henhold til den østerrikske genteknologiloven og holdt Helsinkideklarasjonen. Studien og bruk av arkiv prøvene for studien ble godkjent av etikkomiteen i Innsbruck Medical University (studie UN 3174). Prøver arkivert i 1995-2006 ble brukt i studien. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra og med 2001.
Pasienter og kontrollpersoner
Totalt 582 kaukasiske fagene ble analysert; alle ble rekruttert fra Institutt for Urologi av Innsbruck Medical University. Pasienter og kontroller ble inkludert i den tyrolske tidlig deteksjon program for prostatakreft, som er basert på vanlig PSA (prostataspesifikt antigen) testing [29], [30]. Saken gruppen består av 304 menn i alderen 51 til 84 år, diagnostisert med prostatakreft ved histopatologisk evaluering i henhold til Verdens helseorganisasjons anbefalinger. Som en sykdom kontrollgruppe, 278 menn i alderen 46 til 80 år med benigne Resultatene av prostatabiopsi ble rekruttert som tidligere beskrevet [29] (tabell 1). For sykdommen kontrollgruppen en gjennomsnittlig oppfølgingstid på 4,3 år etter biopsi er tilgjengelig varierer fra null til 12 år, der ingen kreft ble diagnostisert.
DNA og mtDNA analyser
DNA ble isolert fra frosne perifere mononukleære blodceller (PBMC) ved hjelp av AllPrep DNA /RNA Mini Kit 50 (Qiagen, Hilden, Tyskland). Et hierarkisk system for mtDNA haplogrouping som kombinerer multipleks PCR-amplifisering, multiplex enkelt-base-primer-forlengelse, og kapillar-baserte elektroforetisk separasjon for å analysere ti haplogroup-diagnostisk mitokondrielle SNP’er (mtSNPs) ble anvendt for å bestemme haplogruppen fordeling av de mest vanlige europeiske haplogroups, H, U, J, T, K, i, V, W og X, som beskrevet tidligere [20]
Men følgende endringer ble gjort i denne protokollen. for å fjerne primere og kommunefritt deoksynukleotider fra PCR-produktene, et ExoSAP-IT (USB, Cleveland, OH, USA) fordøye i et volum på 4,5 ul inneholdende 0,5 mL ExoSAP og 2 ul PCR-produktet ble utført ved 37 ° C i 60 minutter, etterfulgt av enzyminaktivering ved 80 ° C i 15 min. Multiplex primerekstensjonsreaksjoner ble utført i et totalt volum på 5 pl inneholdende 1 pl av SNP start Master Mix (GenomeLab ™ SNP Start Primer Extension Kit, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA), 1 pl av PCR-produktet, og 1 ul av primer mix. To SNP primere ble endret til 8251r: (A)
15GAGGGGGTGCTATAGGGTAAATACGGG og 16391r: (A)
6TGATTTCACGGAGGATGGTGGTCAAGGGA. Som en intern standard, fluorescensmerkede primere (Biomers, Ulm, Tyskland) lengder 15 og 60 baser ble brukt (15 baser standard DY781: CACATGTCGGAGTCT, 60 baser standard DY781: TACAGTTCGTGCACACCGGCATCAGCTGTGTGCGAGAGTACTTACTATTGGTTGGCCAGA).
Haplogroups som ikke kunne være tilordnet en av de ni store europeiske haplogrupper ved SNP kombinasjonen ble utpekt som «andre».
CR-sekvensene ble analysert mellom nucleotide posisjoner 16145 og 530, fra en 1066-bp fragment. Fragmentet ble forsterket med primere 16098f: ACATTACTGCCAGCCACCATG og 638r: GGTGATGTGAGCCCGTCTAAAC. PCR ble utført i et volum på 30 pl inneholdende 10 x PCR-buffer B (Solis biodyne, Tartu), 2,5 mM MgCl
2, 333,3 pM av forover og revers primer, 133,3 uM av hvert deoksynukleotidtrifosfat (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og 0,083 U Hot Brann Polymerase (Solis biodyne, Tartu, Estland). Termisk sykling Betingelsene var 95 ° C i 15 minutter, 35 sykluser ved 95 ° C i 30 sekunder, 58 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 2 minutter, og til slutt 37 ° C i 2 minutter.
PCR-produktene ble renset på samme måte som beskrevet for haplogroup analyse (ExoSAP-IT, USB, Cleveland, OH, USA). Fragmentet ble sekvensert ved anvendelse av primere 16098f: ACATTACTGCCAGCCACCATG og 17f: CCCTATTAACCACTCACGGG. Sekvensering ble utført med GenomeLab ™ DTC – Quick Start Kit (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) i et volum på 10 ul som inneholder 2 mL av Master Mix og 500 pM av riktig primer. Termisk sykling betingelser for sekvensering ble utført som følger: 30 sykluser med denaturering ved 96 ° C i 5 sekunder, annealing ved 50 ° C i 5 sekunder og forlengelse ved 60 ° C i 4 minutter, etterfulgt av 25 ° C i 10 sekunder. Prøvene ble etanol-utfelt og separert med kapillær elektroforese på en Beckman Coulter CEQ ™ 2000 Genetic Analysis System.
Statistisk analyse
Frekvenser av alle mitokondrielle haplogrupper og CR polymorfismer i prostatakreftpasienter og kontroller ble testet for uavhengighet ved hjelp av Pearson chi-kvadrat statistikk og Fishers eksakte test som passer. Videre på samme måte, frekvenser av mitokondrielle haplogrupper hos pasienter med prostata kreft og biopsi Gleason Score ≤6 og pasienter med prostata kreft og biopsi Gleason score ≥7 ble testet. En p-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. For analyse av CR polymorfismer signifikante p-verdier ble korrigert for multiple sammenligninger med Bonferroni-analyse (kreves signifikansnivå = 0,05 /antall sammenligninger), som fører til en ny ønsket signifikansnivå på 0,00023 [antall sammenligninger = 219]. Alle analyser ble utført ved hjelp av SPSS 15.0 student versjon (SPSS GmbH Software, 80339 München, Tyskland).
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
kontrollregionen polymorfismer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0006370.s001 plakater (0,21 MB DOC)
Takk
Vi takker Michaela Oller for å få hjelp i DNA isolasjon, Adel Sakic om hjelp i utvalgs og DNA, og Birgit Stenzel for å forberede den kliniske datasettet. Vi takker også Neil D. Jones for kritisk lesing av manuskriptet.
