Abstract
Bakgrunn
kreft stamceller (cscs) spiller en viktig rolle i startfasen, progresjon, og metastasering og er ansvarlige for høye terapeutiske feilrater. Identifikasjon og karakterisering av CSC er avgjørende for å lette overvåkning, behandling eller forebygging av kreft. Stor innsats har blitt betalt for å utvikle en mer effektiv metode. Likevel er den ideelle modellen for CSC forskning fortsatt i utvikling. I denne studien har vi opprettet en klebende kultur system for å berike cscs fra menneskelige muntlig plateepitelkarsinom cellelinjer med sfære dannelse og for å karakterisere sine CSC steder lengre.
Metoder
En klebende kultur systemet ble utformet for å generere kuler fra SAS og OECM-1 cellelinjer. En etterfølgende etterforskning av sine CSC egenskaper, inkludert stemness, selvfornyelse, og kjemo- og radioresistance
in vitro
, samt startfasen kapasitet
in vivo
, ble også utført.
Resultater
Spheres ble dannet kostnadseffektivt og tids effektivt innen 5 til 7 dager. Videre viste vi at disse kulene uttrykt antatte stamcellemarkører og utstilt chemoradiotherapeutic motstand, i tillegg til tumor initiere og selvfornyelse evner.
Konklusjoner
Ved hjelp av dette klebende kultursystem, vi lykkes etablert en rask og kostnadseffektiv modell som viser egenskapene til cscs og kan brukes i kreftforskning
Citation. Chen SF, Chang YC, Nieh S, Liu CL, Yang CY, Lin YS (2012) klebende Kultur System som en modell av Rapid Sphere-formasjonen med kreft stamcelleegenskaper. PLoS ONE 7 (2): e31864. doi: 10,1371 /journal.pone.0031864
Redaktør: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, USA
mottatt: 15 desember 2011; Godkjent: 14 januar 2012; Publisert: 16 februar 2012
Copyright: © 2012 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble delvis støttet av Tri-service General Hospital og National Defense Medical Centre: Grant No. TSGH-C100-007-009-10-S02, TSGH-C100-161, TSGH-C100-155 og i-29; Department of Dental Hygiene, Kina Medical University: Grant No. CMU99-N1-04-1; National Science Council, Republikken Kina (Taiwan): Grants No. NSC 99-2320-B-039-028-My3 og NSC 100-2320-B-016-009; Department of Health Executive Yuan, Kina (Taiwan): DOH100-TD-PB-111-TM007-22. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Oral plateepitelkarsinom (OSCC) er en av de mest vanlige og dødelige hode- og nakke maligniteter i Taiwan og på verdensbasis [1], [2]. OSCC er en sykdom som er vanskelig å behandle på grunn av de ulike behandlingsstrategier tilgjengelig og den variable naturlig oppførsel av kreft. Lokal invasjon og hyppige regionale lymfeknutemetastaser, sammen med relativ resistens mot cellegifter, føre til en uforutsigbar resultat [2] – [4]. Til tross for økt erfaring i kirurgisk teknologi og adjuvant behandling, de samlede prognoser for OSCC forbli uberørt, noe som resulterer i akutt behov for en ny strategi for OSCC behandling [3], [5].
Betydelige bevis fra nyere studier viser som faste tumorer inneholder en subpopulasjon av kreft stamceller (cscs) [6] – [8]. Det er vel kjent at cscs spiller en viktig rolle i tumor initiering, progresjon, metastase, og terapeutisk motstand [9] – [11]. Men de antatte cscs fra OSCC har ikke blitt godt karakterisert. Det er en hypotese at cscs har flere egenskaper som gjør dem motstandsdyktige mot konvensjonell kjemoterapi og strålebehandling, inkludert høy uttrykk for legemiddeltransportører, relative cellesyklus quiescence, høy funksjon av DNA-reparasjon maskiner, og motstand mot apoptose [12], [13] . Identifiseringen og karakteriseringen av cscs fra OSCC er avgjørende for å lette overvåkning, behandling og forebygging av sykdommen.
Isoleringen av cscs fra kreftceller er blitt oppnådd med hell ved bruk av forskjellige teknikker. Isoleringen av cscs blir utført ved hjelp av strømningscytometri basert på ekspresjonen av spesifikke celleoverflatemarkører, så som CD133, CD44 og ALDH1, ved cscs [14] – [20]. På grunn av den terapeutiske motstand av cscs, sortering side populasjoner av kreftceller via intracellulær Hoechst 33342 utelukkelse eller valg av kjemoterapeutisk-medikament-resistente celler har også blitt brukt for å identifisere og karakteriseringen av cscs [21] – [23]. Samtidige studier bekreftet at kula kultur systemet er så effektiv i å skille cscs fra mange solide tumorer eller kreftcellelinjer. Disse studier har antydet at cscs kan anrikes i områder når disse dyrkes i serumfritt medium supplert med tilstrekkelig mitogener, slik som basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) og epidermal vekstfaktor (EGF) [11], [24] – [26]. Imidlertid avledning av cscs fra faste tumorer og kreftcellelinjer dyrket i serumfritt medium supplementert med bFGF og EGF er en tidkrevende prosess og for 2-6 uker for sfære formasjon [11], [24] – [26 ]. Videre er de valgte vekstfaktorer, så som blodplate-avledet vekstfaktor, bFGF, og EGF, er kostbare og ineffektive. For å overvinne disse ulempene og begrensningene, brukte vi en spesialdesignet klebende sfære kultur system for å identifisere og berike cscs fra etablerte menneske OSCC cellelinjer, og å karakterisere sine CSC steder lengre ved hjelp av fenotypiske /genotypisk karakterisering.
Resultater
kulen formasjonen fra humane cellelinjer OSCC
OSCC cellelinjer (SAS og OECM-1) ble forsiktig dissosiert til enkeltceller og sådd ut i kultur og plast med et ikke-klebende belegg, slik som vist i figur 1. en del av suspensjonen av celler kan gjennomgå apoptose i løpet av de første 2 dager, når dyrket i et ikke-klebende, suspendert miljø. Noen av de suspenderte cellene samlet og deretter slått sammen og differensiert i tredimensjonale (3D) kuler med en sfæroide konfigurasjon. Den påfølgende morfologiske endringer (~3-5 dager) besto av flytende kuler. Etter 5-7 døgns dyrking, ble sfærer med en rund og glatt kontur observert. Disse kulene vokste gradvis over tid (figur 1A). Morfologisk kulene først på mer tett festet, clustering eller overlappende i en 3D-konfigurasjon, sammenlignet med de som ble observert i foreldrecellene. En tidligere studie antydet at utledningen av kuler fra cancercellelinjer eller primære kultur celler kan utføres sammen med endring av fenotypiske /genotypisk egenskaper, for eksempel den epiteliale-mesenkymale overgang (EMT) [27]. De representative EMT markører E-cadherin og fibronektin ble valgt til å identifisere og sammenligne forskjellene mellom, foreldre celler og kuler i OECM-en og SAS celler. Mikroskopisk undersøkelse av immunhistokjemisk fargede parentale celler og kuler viste tilstedeværelse av generaliserte og diffus ekspresjon av E-cadherin og sparsom ekspresjon av fibronektin i parentale celler, mens kuler oppviste tap av ekspresjon av E-cadherin og overekspresjon av fibronektin (figur 1B).
(A) Phase kontrast photomicrographs av kulene dyrket fra SAS (øverst) og OECM-en (nederst) cellelinjer ved hjelp av en ikke-klebende design (fire lengst til venstre over- og underpanelet: fra dag 0 til dag 7, forstørrelse 200 ×, og lengst til høyre øvre nedre paneler: dag 10, forstørrelse, 100 ×). (B) immunhistokjemi resultater som viser ulike uttrykk mønstre av representative epitel-mesenchymale overgang (EMT) markører i OECM1 foreldre celler og kuler (forstørrelse, 200 ×).
Uttrykk av antatte stamcelleoverflatemarkører
for å belyse hvorvidt kuler kunne berike celler som uttrykker mulige kreftstamcellemarkører, valgte vi å analysere uttrykket profilen til to representative stamcelleoverflatemarkører OSCC, CD133 og ALDH1 [11], [14] – [18]. Som vist i figur 2A og B, foreldrecellene og kuler (etter 7 dager med ikke-klebende kultur) ble positivt farget for CD133 og ALDH1. Uttrykk for CD133 og ALDH1 var vanligvis fraværende eller svært lav i foreldre celler. Vi oppdaget en 3-4% økning i CD133 uttrykk og en 20-30% økning i ALDH1 uttrykk i kuler sammenlignet med foreldre celler. Nivåene av uttrykk av CD133 og ALDH1 var signifikant høyere i områder enn de var i foreldre celler (figur 2C).
(A) Foreldre celler og kuler ble enten farget med en negativ-kontroll IgG antistoff (åpen plass) eller anti-CD133 eksperimentelle antistoffer (fast plass). (B) Sammenligning av ekspresjonen av ALDH1 mellom parentale celler og kuler; DEAB, en inhibitor av ALDH1, ble anvendt som en negativ kontroll. (C) Kvantitative og statistiske sammenligninger av andelen positive signaler for CD133 og ALDH1 mellom foreldre celler og kuler (*
P
0,05).
Uttrykk for kreft stamcelle gener og relaterte proteiner
uttrykk for stamcelle gener og relaterte proteiner, inkludert
SOX2
,
Oct4
, og
Nanog
, ble undersøkt ved transkripsjonelle og translasjonelle nivåer. Totalt RNA ble renset fra parentale celler og kuler etter 7 dager med ikke-klebende kultur. Nivåene av SOX2, Oct4, og Nanog transkripsjoner ble betydelig økt i områder sammenlignet med foreldre celler, som målt ved hjelp av revers transkripsjon PCR-analyse (figur 3A). Western blotting av data viste at ekspresjonen av SOX2, Oct4, og Nanog proteiner ble også oppregulert i kuler sammenlignet med foreldreceller (figur 3B). Videre brukte vi immunfluorescens farging for å vurdere de cellulære nivåer av CD133, ALDH1, SOX2, Oct4, og Nanog i kuler. Vi har observert mangfoldige uttrykksmønstre for disse proteinene, som vist i figur 3C, noe som antyder at heterogeniteten til OSCC. CD133 ble uttrykt i cellemembranen og ALDH1 ble uttrykt i cellemembranen og cytoplasma, mens SOX2, Oct4, og Nanog ble uttrykt i kjernen.
(A) A RT-PCR-analyse viste at ekspresjon av
SOX2, Oct4, og Nanog
gener ble oppregulert i områder sammenlignet med foreldre celler. (B) Western blot-analyse viste at ekspresjon av SOX2, ble Oct4, og Nanog oppregulert i kuler sammenlignet med foreldreceller. (C) Immunofluorescensanalyse av CSC markører i sfærer viste nærvær av cscs med variable nivåer av ekspresjon av CD133, ALDH1, SOX2, Oct4, og Nanog, som antydet med pilene (forstørrelse 200 x).
Radio- og kjemosensitivitet
for å vurdere Radiosensitivity av foreldre celler og kuler, vi behandlet disse cellene og kuler med stråledoser opp til 10 Gy å vurdere celle levedyktighet, som ble målt ved hjelp av en MTS analyse etter 36 timer med strålebehandling. Sfærer var mer radioresistant enn parentale celler (figur 4A). Vi har også undersøkt kjemosensitivitet av foreldre celler og kuler ved hjelp av cisplatin. Parentale celler og kuler ble behandlet med cisplatin i 48 timer og cellelevedyktigheten ble målt deretter ved hjelp av en MTS-analyse (figur 4B). Sfærer var mer resistente overfor cisplatin enn parentale celler. For å etterligne den kliniske tilstand, vi administreres en kombinert kjemo- og stråleterapi (CCRT) behandling med (1) innledende kjemoterapi bestående av 20 uM cisplatin i 24 timer fulgt av bestråling (figur 4C) eller (2) initial stråling etterfulgt av kjemoterapi ved hjelp 20 uM cisplatin i 24 timer (Figur 4D). Resultatene av behandling ved bruk av disse to CCRT regimer viste at kombinasjonene var mer effektive i å redusere overlevelsesraten av de parentale celler og kuler, sammenlignet med enkelt behandling av enten stråling eller kjemoterapi. I tillegg sfærer var mer resistente enn foreldrecellene (med variabel signifikansnivåer) ved bruk av den kombinerte behandling.
Det ble observert betydelige forskjeller i (A) Radiosensitivity og (B) kjemosensitivitet mellom parentale celler og kuler. (C) Kombinert kjemo- og stråleterapi (CCRT) med innledende kjemoterapi for 24 timer, etterfulgt av stråling. (D) CCRT med initial stråling etterfulgt av kjemoterapi i 24 timer. De to CCRT regimer var mer effektive i å redusere overlevelsen av foreldrenes celler og kuler sammenlignet med enkel behandling ved hjelp av enten stråling eller kjemoterapi (*
P
0,05).
in vivo
tumorigenicity
for å bekrefte beriket tumor initiere egenskapene til kuler
in vivo
, både foreldre celler og kuler ble injisert i nakne mus, for analyse av transplantert tumorigenitet. Kuler avledet fra SAS-celler ga opphav til svulster når 1 x 10
5-celler ble injisert i mus (to av tre mus), og kuler avledet fra OECM-11 celler ble generert tumorer når det bare er 1 x 10
4 celler ble injisert i mus (en av tre mus). I motsetning til dette, 1 x 10
6 parentale celler var nødvendig for å generere svulster, noe som tyder på at sfærer ble anriket for tumorceller å initiere ved hjelp av minst 10- til 100-ganger sammenlignet med parentale celler (Tabell 1). En sammenlignende analyse av grovt utseende mellom tumorene nylig generert fra parentale celler og kuler avslørte tilstedeværelsen av betydelige forskjeller når det gjelder størrelse og kontur. Kuler ga tumorer i et mye større størrelse med en uregelmessig, ekspansjons kontur sammenlignet med de tumorer som genereres av parentale celler (Figur 5A). En komparativ analyse av den tilsvarende histologiske og immunhistokjemiske resultater for representative EMT markører viste at svulster avledet fra sfærer syntes å være mer aggressive og har en mesenchymale-lignende utseende og fremtredende stromal invasjon sammenlignet med de svulster avledet fra foreldre celler. Vi har observert ujevn ekspresjon av E-cadherin i tumorer avledet fra parentale celler og et tap av E-cadherin ekspresjon i tumorer avledet fra sfærer. Det var en åpenbar overekspresjon av fibronektin i tumorer avledet fra kulene sammenlignet med tumorer avledet fra parentale celler (Figur 5B). Primære kulturer fremstilt av reseksjon av svulster forårsaket av kuler i NOD /SCID mus viste en gradvis endring av primær og sekundær sfære formasjon, noe som tyder på at kulene har en kraftig evne til selvfornyelse (figur 5C).
( A) Brutto utseende av en representativ tumor dannet ved inokulering av parentale celler og dissosiert kuler i NOD /SCID-mus (n = 3 i hver gruppe). (B) Tilsvarende histologiske funn og immunhistokjemiske resultater for representative EMT markører i NOD /SCID mus (forstørrelse, 100 ×). (C) Primær kultur dissosierte celler fra OECM-1-indusert kuler opprinnelig isolert fra NOD /SCID mus viste en gradvis transformasjon av primære (1
st) og sekundære (2
nd) kuler (forstørrelse, 100 × ).
Diskusjoner
begrepet cscs og deres programmer har blitt rapportert i de siste tiårene. Begrepet «kreft stamcelle» ble definert i 2006 av American Association for Cancer Research Workshop om kreftstamceller som en celle i en svulst som besitter evnen til å fornye seg selv og til å generere de heterogene linjer av kreftceller som utgjør svulst [6]. En gjennomgang av litteraturen viste at cscs først ble isolert ved Bonnet og Dijk i akutt myelogen leukemi, og Al Hajj var den første til å identifisere dem i solide tumorer [28], [29]. Hittil har cscs blitt identifisert i mange faste tumorer, inkludert hjerne, bryst, lunge, prostata og kolon-kreft [24], [25], [30] – [33] sikret CSC teori forklarer ikke bare problemet med tumor initiering, utvikling, metastaser, og tilbakefall, men også ineffektivitet av konvensjonell kreftbehandling. Ifølge nåværende kunnskap, initiering, regelmessighet, og metastase av cancer kan bli forklart, i det minste delvis, ved tilstedeværelse av cscs [6] – [8], [34]. Følgelig, blir utvikling av en pålitelig modell for cscs avgjørende for grunnleggende og klinisk kreftforskning.
Flere teknikker er blitt brukt for å isolere cscs fra kreft (Tabell 2 og figur S1). Til å begynne med, da de spesifikke overflatemarkører CD34 og CD38 hadde blitt omfattende validert i identifisering av normale hematopoetiske stamceller, ble disse molekylene anvendt som markører i den opprinnelige studier av leukemi stamceller [28]. Deretter ble CD24 og CD44 valgt som CSC markører i brystsvulster [29]. Ikke desto mindre, som for tiden er det ingen åpenbar enighet om den «beste markør (er)» som brukes for identifikasjon av cscs i en bestemt cancer. Det finnes noen rapporter, viste at CD44 er en selektiv markør for cscs fra HNSCC [19], [20]. Imidlertid våre data viste at CD24 og CD44 var rikelig tilstede i både parentale celler og kuler (opp til 20-40%) (fig S2). Vi har valgt to andre representative stilk celleoverflatemarkører OSCC, CD133 og ALDH1, for å påvise ekspresjonsprofilen av både parentale celler og kuler [11], [14] – [18]. Ekspresjonen av CD133 og ALDH1 var vanligvis fraværende eller meget lav i parentale celler, sammenlignet med høyere CD133 (3-4%) og ALDH1 (20-30%) ekspresjon i kuler. Selv om uttrykket av CD133 og ALDH1 var betydelig høyere i områder enn i foreldreceller, CD133 og ALDH1 var relativt tilstrekkelig CSC markører i OSCC, men var ikke egnet for isolering av cscs fra kreft riktig på grunn av svulst heterogenitet og uforutsigbar reproduserbarhet (figur S1 A). Identifiseringen av spesifikk overflatemarkør (e) for identifisering av cscs og terapeutiske mål er fortsatt en utfordring. Sortering side populasjoner av kreftceller via intracellulær Hoechst 33342 utstøting og /eller valg av kjemoterapeutisk-medikament-resistente celler har også blitt brukt for å identifisere og karakteriseringen av cscs [21] – [23], [31]. Imidlertid er metoden for sortering side populasjonene via Hoechst 33342 utelukkelse ga bare et lite antall cscs (0,23 til 22,3%), noe som er utilstrekkelig for ytterligere eksperimentering [21], [22], [31]. Nyere studier har vist at CSC valg via isolering av kjemoterapeutisk-legemiddelresistente celler kan gi et begrenset antall cscs (20-40%); imidlertid, produksjon av større mengder av cscs var kostbar og tidskrevende (figur S1B) [17]. Nyere studier har også antydet at cscs kan anrikes i områder når de dyrkes i serumfritt medium supplert med tilstrekkelige vekstfaktorer, [11], [24] – [26]. Fremstillingen av cscs avledet fra OSCC celler dyrket i serumfritt medium supplementert med bFGF og EGF var en lang, tidkrevende og kost ineffektiv fremgangsmåte for sfære formasjon [11], som vist i den øvre del av fig S1C.
Tidligere studier viser at mange celletyper er blitt beskrevet med hensyn til dannelsen av 3D-kuler når de dyrkes i suspensjon eller i et ikke-adhesivt miljø [35], [36]. 3D-kuler er mye brukt som studiemodeller for kreft metastase og invasjon og for terapeutisk screening; Men den beste til vår kunnskap, ingen av dem nevnte egenskapene cscs [36] – [39]. I denne studien har vi etablert en modell for rask og tilstrekkelig sfære formasjon fra menneskelige OSCC cellelinjer. Basert på et ikke-adhesivt kultursystem, denne modellen var tidseffektiv fordi kulene ble samlet i løpet av 5 til 7 dager (Figur 1a). I tillegg er denne modifiserte klebende kultursystem kostnadseffektivt og ikke krever vekstfaktorer sammenlignet med foregå sfære kultursystemet. Det kan ikke bare lykkes berike sfære formasjon fra OSCC cellelinjer (SAS, OECM-en, Cal27, SCC25, og Ca922), men også genererer kuler fra kreftcellelinjer fra andre deler av hode og hals (Fadu og TW205), fra kolon (HT29 og COLO320), og fra lungene (NCI-H23 og NCI-H661) (data ikke vist). Enkelte studier viser at kula dannelse kan nås innen 10-15 dager i serumfritt medium tilsatt vekstfaktorer [30], [40]. Men disse kulene er morfologisk mer sannsynlig å være aggregater av drue-lignende organer med uregelmessig kontur, og egentlig ikke kuler, som de sett i vår studie (tabell 2 og figur S1). I vår klebende kultur system, kulene dukket opp tettere knyttet, ball-aktig, runde, og glatt i kontur. Videre uttrykk for representative kreft stamcelle gener og relaterte proteiner, inkludert
SOX2
,
Oct4
, og
Nanog
ble oppregulert i områder sammenlignet med de oppdaget i foreldre -celler, både RNA og proteinnivåer (figur 3A og B). Ved hjelp av immunfluorescens analyse, viste vi at kuler vise eksplisitt histologisk heterogenitet, samt CSC egenskaper (Figur 3C). Bevis for forbedret terapeutisk motstand ved cscs, som er en annen viktig egenskap ved disse cellene, er blitt rapportert. Fenomenet tilbakefall av mange kreftformer etter kjemo- eller radioterapi kan resultere fra overlevelsen og opprettholdelsen av cscs. I vår studie har vi vist at kulene var mer radio- og kjemoresistent sammenlignet med foreldre celler (figur 4A og B). På grunn av ulik opprinnelse og karakteristika for SAS og OECM-1-celler, var det en annen behandlingsresultat i disse to typer celler. SAS-celler var mer følsomme overfor kjemoterapi, men mer motstandsdyktig mot stråling; i motsetning til dette OECM-1-celler var mer følsomme for stråling, men mer motstandsdyktig mot kjemoterapi. CCRT var mer effektive i å redusere overlevelsesrate for både parentale celler og kuler, sammenlignet med en enkelt behandling med enten stråling eller kjemoterapi. Ikke desto mindre kuler var fremdeles mer motstandsdyktig enn parentale celler ved bruk av kombinert behandling. Bruken av denne ikke-klebende kultursystem kan tilveiebringe en ny innsikt og en ny modell for cscs som er anvendelig i terapeutiske forskning. Xenotransplantasjon studier kan også bidra til å identifisere og bekrefte hverandre tumorigent evnen til klebende kultursystemer. Inokulering av både parentale celler og kuler i NOD-SCID-mus ble generert ny tumor (e) 7 dager etter implantasjon og førte til en økning i tumorstørrelse over tid. En sammenlignende analyse viste at kule-genererte tumorer oppviste et mye større størrelse med en uregelmessig, ekspansjons kontur sammenlignet med de som genereres av parentale celler (Figur 5A). Basert på primærkultur av de oppløste cellene i kule-genererte tumorer, som ble bearbeidet ved hjelp av de samme protokoller, ble primære og sekundære sfærer ble generert, noe som indikerer deres evne til selvfornyelse (figur 5C). Interessant, de tilsvarende histologiske og immunohistokjemiske Resultatene viste at svulster avledet fra sfærer viste et tap av E-cadherin og oppregulering av fibronektin, som syntes å være mer aggressiv, og hadde en mesenchymale lignende utseende sammenlignet med tumorer avledet fra parentale celler (figur 5B) .
Som nevnt tidligere er de anrikede kulene dyrket fra OSCC cellelinjer via et ikke-adhesivt kultursystem kan i utgangspunktet bli suspendert og løsrevet fra foreldrecellene, og danne små klaser. Slike kuler dyrket i et ikke-klebende tilstand senere utviser redusert celle-celle eller celle-matriks interaksjoner, mister sin forankring, og ble hjemløse. Dette utløser et fenomen som kalles «anoikis», antagelig som resulterer i apoptotisk respons [41]. Flytende kuler i en tilstand av anoikis i kulturmediet er isolert, og selv om de forsøker å følge, ikke klarer å feste til underliggende eller omkringliggende plate som forventes å forsvinne til slutt. Hvordan kan disse kreftcellene overlever og sprer å overvinne trusselen om anoikis? Hva mekanisme er involvert i oppkjøpet av overlevelsessignaler som tilbyr muligheten til å overleve og formere seg i et flytende svulst befolkning som mangler normal fast-fase stillas, som utgjør en utfordret mikromiljøet? Flere studier har antydet at motgang møtt av kuler i et ikke-klebende, suspendert tilstand kan bli stimulert av EMT og også oppmuntre til påmelding av potensialet i CSC egenskaper [42], [43]. Litteraturen viser også at noen signalveier megle EMT og CSC egenskaper, for eksempel WNT, Sonic pinnsvin, Snail /Slug, og HAKK [44] – [46]. Det er økende bevis som tyder på at det eksisterer en sammenheng mellom EMT og cscs som involverer celle morfologi endring og motilitet. Disse konseptene forklare hvorfor vårt ikke-adhesivt kultursystem kan anvendes for å berike cscs fra kreftcellelinjer.
Som konklusjon, ved hjelp av en modifisert ikke-adhesivt kultursystem og en etterfølgende serie forsøk vi ikke bare validert CSC-egenskapene til kuler isolert fra OSCC cellelinjer, men også opprettet en rask og økonomisk metode som kan gi ny innsikt og en nylig anvendelig modell for CSC forskning.
Materialer og metoder
Cells
den humane tunge kreftcellelinje SAS, erholdt fra det japanske Collection, ble dyrket i DMEM supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i nærvær av 5% CO
2. Det humane gingival plateepitel carcinom-cellelinjen med et p53 missens OECM-1, ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% FBS ved 37 ° C i nærvær av 5% CO
2. Disse to godt etablerte cellelinjer ble vennlig levert av Dr. Yi-Shing Shieh fra Institutt for oral Diagnostisering og patologi, Tri-service General Hospital, Taipei, Taiwan [47].
Sphere kultur
De to cellelinjer ble dyrket i kultur og plast med klebende overflaten. 10 cm plate er laget av ikke-adhesivt for celler ved å belegge med agarose tynne filmer. Cellene ble sådd ut i en tetthet på 5 × 10
4 levende celler /10 cm tallerken, og kulturmediet ble endret annenhver dag inntil kula formasjonen.
Immunohistochemistry
Tissue seksjoner eller celleblokk ble de-vokset i xylen og rehydrert i alkohol. Antigen gjenfinning ble utført ved inkubering i 10 mM citratbuffer (pH 6,0) ved 95 ° C i 40 min. Endogen peroksidase ble blokkert med 0,3% hydrogenperoksid i 10 minutter og deretter inkubert med 5% normalt hesteserum i fosfat-bufret saltvann (PBS) i 60 minutter ved romtemperatur for å blokkere ikke-spesifikke antistoff-reaksjon. Etter en vask med Tris-bufret saltvann plus 0,1% Tween 20 (TBST), ble objektglass inkubert over natten ved 4 ° C med primære antistoffer, E-cadherin (sc-8426; 1:800) og fibronetin (SC-18825; 1: 500) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA. USA). Etter å ha blitt skylt i TBST, ble slides inkubert i 30 minutter ved romtemperatur med biotinylert sekundært antistoff, etterfulgt av streptavidin-biotinylert-enzymkompleks (streptABComplexes kit; Dako, Glostrup, Danmark). Deretter ble de farget med 0,003% 3,3-diaminobenzidintetrahydroklorid, kontra med Mayers hematoksylin, dehydrert, og montert.
Flowcytometri
1 × 10
6 enkeltcellesuspensjon fra tryptinisert celler og kuler ble besvart i 1 ml PBS og farget med CD133 (klone C24B9, 1:200) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) og aldehyd dehydrogenase 1 (ALDH1) (ALDEFLUOR analysesett, StemCell Technologies, Durham, NC , USA). Etter merking ble cellene vasket med PBS tre ganger, og deretter farget med FITC- eller PE-merket sekundært antistoff i 30 min i mørket. Cellene ble analysert på et strømningscytometer etter tre vaskinger med PBS.
Revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR)
Total RNA ble isolert med TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, California , USA) og kvantifisert ved hjelp av spektrofotometri ved 260 nm. På en GeneAmp® PCR System 9700 thermocycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 5 ug av hvert total RNA ble revers transkribert med Superscript III (Invitrogen) ved 55 ° C i 1 time i totalt antall komplementære DNA, som ble benyttet som mal for de påfølgende PCR reaksjoner og analyse. PCR-reaksjonene involverte en innledende denaturering ved 94 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 25 eller 30 sykluser ved 94 ° C i 30 sekunder utsettes for et passende glødetemperatur (58-62 ° C) i 30 sekunder, og deretter en endelig inkubering ved 72 ° C i 45 sekunder. PCR-primere for analyse av mRNA var: glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH), følelse (5′-AGCCGCATCTTCTTTTGCGTC-3 «) og antisense (5′-TCATATTTGGCAGGTTTTTCT-3»);
okt-4- , følelse (5′-CGCACCACTGGCATTGTCAT-3 «)
og antisense (5′-TTCTCCTTGATGTCACGCAC-3′);
Nanog, følelse (5′-AATACCTCAGCCTCCAGCAGATG-3 «)
og antisense (5′-CTGCGTCACACCATTGCTATTCT-3 «);
SOX2, følelse (5′-GGCAGCTACGCATGATGCAGGAGC-3′)
og antisense (5′-CTGGTCATGGAGTTGTACTGCACG-3) . Amplified RT-PCR produktene ble så analysert på 1% agarose geler og visualisert ved hjelp etidiumbromidfarging og et kamerasystem (transilluminator /SPOT, diagnostiske instrumenter, Sterling Heights, MI, USA). Gel bilder av RT-PCR-produkter ble direkte skannet (ONEDscan 1-D Gel Analysis Software, Inc. Scanalytic Fairfax, VA, USA), og de relative tettheter ble oppnådd ved å bestemme forholdet mellom signalintensiteten til det GAPDH bandet. Genekspresjon mellom test (cyklosporin A behandlet) og kontrollgruppene ble sammenlignet.
Western blotting
Hele cellelysatene ble separert ved elektroforese på 12% SDS-PAGE og overført til polyvinylidenfluorid membranen . Membranene ble blokkert med 5% fettfri melk ved romtemperatur i 1 time. De primære antistoffer ble brukt: GAPDH (ab9482; 1:5000 fortynning) (Abcam, Cambridge, MA, USA), Oct-3/4 (sc-8630, 1:1000), Nanog (sc-81961; 1:1000) og SOX2 (SC-17320; 1:500) (Santa Cruz Biotechnology) i TBST-buffer inneholdende 3% fettfri melk ved 4 ° C over natten og deretter med anti-mus og kanin-anti-geit-sekundært antistoff konjugert med peroksidase (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology) ved 25 ° C i 1 time. De immunoblotter ble utviklet ved hjelp av en forbedret chemiluminescence system, og luminescens ble visualisert på X-ray film.
immunfluorescens
De levende celler og kuler ble fiksert i 4% paraformaldehyde, permeabilized i 0,1% Triton X-100, og blokkert i 5% normalt geite serum-PBS. Celler ble inkubert med primære antistoffer, Oct-3/4 (sc-8630, 1:200), Nanog (sc-81961,1:200), SOX2 (SC-17320; 1:500) (Santa Cruz Biotechnology), CD133 (klone C24B9,1:200) (Cell Signaling Technology) og ALDH1 (klon 44, 1:200) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) vasket tre ganger i PBS, og deretter inkubert med geit anti-mus eller sekundære antistoffer konjugert med FITC (grønn) eller PE (rød). DAPI ble brukt som kjerne flekk (blå). Bilder ble innhentet ved hjelp av fluorescerende mikroskopi og et digitalt kamera.
kjemosensitivitet og Radiosensitivity analysen
Celler ble seeding i 10 cm tallerken med en tetthet på 1 x 10
6 celler /fatet. For kjemosensitivitet analysen ble cellene behandlet med 10-200 mikrometer Cisplatin (Sigma, St. Louis, MO, USA) i 48 timer. For radioresistance analysen ble cellene bestrålt ved hjelp av et Cyberknife radiosurgery system (Accuray, USA) for å levere ulike doser (2-10 Gy). Relativ overlevelse brøkdel av celler ble bestemt ved MTS analysen bruker CellTiter 96 vandige løsning Cell Proliferation Assay kit (Promega, Madison, WI, USA) etter 36 timer med strålebehandling.
In vivo
tumorgenisitetsstudie
in vivo tumorgenisitetsstudie ble utført følgende lokale etikkutvalg retningslinjer som hadde full akkreditering tildelt av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care i National Defense Medical Center. Musene ble holdt ved 18-26 ° C, 30-70% luftfuktighet, og uavhengig aircondition under en 12 h mørk /12 h lys syklus i 7 dager før xenograft injeksjon. Foreldre OSCC celler og kuler ble injisert inn i BALB /c nakne mus (6 uker). Cellesuspensjonen (100 pl) ble injisert subkutant i hver mus med forskjellige celle tall fra 1 x 10
6, 1 x 10
5, 1 x 10
4 celler. Tumorer ble dannet i 7 dager etter injeksjonen. Nivået av statistisk signifikans ble satt til 0,05 for alle tester.
