Abstract
Bakgrunn
Autophagy er en evolusjonært konservert protein degradering veien. En defekt i autofagi kan bidra til tumorigenesis. Autofagi indusere kan ha en potensiell funksjon i tumor forebygging og behandling.
metodikk /hovedfunnene
Våre resultater viste at Rhabdastrellic syre-A, en isomalabaricane triterpenoid isolert fra svampen Rhabdastrella globostellata, hemmet spredning av humane kreftcellelinjer Hep3B og A549 og indusert caspase-uavhengig celledød i begge cellelinjene. Videre undersøkelser viste at Rhabdastrellic syre-A indusert autofagi av kreftceller bestemt ved YFP-LC3 tegnsettings og økt LC3-II. Forbehandlingen med autofagi inhibitor 3-MA hemmet Rhabdastrellic syre-A-indusert celledød. Knockdown av autophagy relatert gen Atg5 hemmet Rhabdastrellic syre-A-indusert celledød i A549-celler. Også, fosfo-Akt og nedstrøms mål signifikant redusert etter behandling med Rhabdastrellic syre-A i begge kreftcellelinjer. Transfeksjon av konstitutiv aktiv Akt plasmid opphevet autofagi og celledød indusert av Rhabdastrellic syre-A.
Konklusjoner /Betydningen
Disse resultater antyder at Rhabdastrellic syre-A kan indusere autofagi-assosiert celledød gjennom å blokkere Akt reaksjonsveien i kreftceller. Det gir også bevis for at Rhabdastrellic syre-A fortjener videre undersøkelser som en potensiell kreft eller kreft forebyggende middel
Citation. Li DD, Guo JF, Huang JJ, Wang LL, Deng R, Liu JN, et al . (2010) Rhabdastrellic Acid-A Induced Autophagy-Associated celledød gjennom Blokkering Akt Pathway i humane kreftceller. PLoS ONE 5 (8): e12176. doi: 10,1371 /journal.pone.0012176
Redaktør: Gian Maria Fimia, INMI, Italia
mottatt: 19 februar 2010; Godkjent: 21 juli 2010; Publisert: 17 august 2010
Copyright: © 2010 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien er støttet med tilskudd fra Nature Science Foundation National of China (30873085, 30972882) (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default124.htm). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Marine svamper har vist seg å være en spesielt fruktbar kilde til uvanlige terpenoids [1], [2]. Rhabdastrellic syre-A (Fig. 1), en isomalabaricane triterpenoid, ble isolert fra den gule svampen Rhabdastrella globostellata (Carter) samlet inn fra Sør-Kinahavet i nærheten Hainan Island, Folkerepublikken Kina. Dens struktur ble etablert på grunnlag av UV, IR, MS,
1 H-NMR,
13C-NMR, og 2D NMR spektroskopi [3], [4]. De relative og absolutte stereochemistries ble løst ved NOESY og CD-studiene. Det har blitt rapportert at Rhabdastrellic syre-A kan hemme veksten av kreftcellelinje HCT-116. Tasdemir et al. funnet at stellettin B og E, to terpenoider fra Rhabdastrella globostellata med struktur som ligner på Rhabdastrellic syre-A, fortrinnsvis hemme p21 – /- HCT-116 celleveksten [5]. Andre isomalabaricane triterpenoids ble funnet å indusere reaktive oksygenarter (ROS), redusere mitokondriemembranpotensialet, øke nivået av Bax og cytokrom c, reduserer nivåene av Bcl-2 og medierer en caspaser-3 apoptotisk reaksjonsvei, men de molekylære mekanismer som er ansvarlig for triterpenoids-indusert celledød er ikke blitt klarlagt ennå [5]. Dessuten våre undersøkelser viste at Rhabdastrellic syre-A indusert apoptose i HL-60-celler [4], men utviklingen av apoptotiske egenskaper i Hep3B og A549-celler etter eksponering til Rhabdastrellic syre-A ble ikke observert.
Autophagy er en lysosomal degradering sti som er avgjørende for overlevelse, utvikling og homeostase [6]. Autophagy tjener først og fremst en adaptiv rolle for å beskytte organismer mot forskjellige sykdommer, inkludert infeksjoner, kreft [7], neurodegenerering [8], aldring, og hjertesykdom. Autophagic celledød har de morfologiske og biokjemiske egenskaper som skiller det fra både apoptose og nekrose. På et tidlig stadium av tumorutvikling, Autophagy fungerer som en tumor suppressor
39. Defekter i autofagi føre til genomisk ustabilitet og tumorigenesis. Imidlertid tumorcellene som er plassert i det sentrale området av tumormassen gjennomgår autofagi for å overleve under lav-oksygen- og lave næringsforhold. Det ble rapportert at autofagi beskyttet av enkelte kreftceller overfor antikreftbehandlinger ved å blokkere den apoptotiske reaksjonsvei. Derimot, kan andre kreftceller gjennomgå autophagic celledød etter kreftbehandling [9].
Rollen autofagi i formidling av cellulær respons på stress har blitt undersøkt av interferencing uttrykket av pattedyr orthologues av ATG-genet [ ,,,0],10]. For eksempel, Beclin 1 (BECN1, også kjent som Atg6) er en del av et kompleks som inkluderer klasse III fosfatidylinositol-3-kinase som er stimulerende for autofagi. Beclin 1 (ATG6) er også kjent for å samhandle med BCL-2 familiemedlemmer, Bcl-2 og Bcl-xL [11], [12]. Induksjonen av Beclin 1-ekspresjonen kan bli funnet i løpet av autophagy i forskjellige celletyper [13]; og ATG5 er nødvendig for autofagi, men kan også føre til celledød via sin interaksjon med Fas assosiert protein ved døden domene [14]; Derfor er resultatene av disse viktige eksperimenter er ikke i øyeblikket tas som et endelig bevis for rollen autophagy som enten en overgriper eller en skade-forbedrende middel under stress, men mer som en demonstrasjon av de viktige roller sine regulatorer spiller i cellulær homeostase og tumorigenesis [15].
En rekke signalveier er involvert i reguleringen av autofagi. En av de sentrale regulatorer av autofagi er målet for rapamycin, TOR kinase, som er den viktigste hemmende signal som undertrykker autophagy i nærvær av vekstfaktorer og rikelig næringsstoffer. Klassen jeg PI3K /Akt signalmolekyler lenker reseptor tyrosin kinaser til TOR aktivering og dermed undertrykke autofagi i respons til insulin-lignende og andre vekstfaktor signaler [16]. Noen av de andre regulatoriske molekyler som styrer autofagi inkluderer 5′-AMP-aktivert protein kinase (AMPK), som reagerer på lav energi; den eukaryote initiering faktor 2α (eIF2α), som reagerer på nærings sult, dobbelt-trådet RNA, og endoplasmatisk retikulum (ER) spenning [17], [18]. Undertrykkelse av autophagic celledød av caspase-8 i pattedyrceller indikerte at caspases kan regulere både apoptotiske og ikke-apoptotisk celledød [19].
I de siste tiårene har forskere fokusert på den sentrale rollen Akt i mange humane cancere [20], [21], [22], [23], [24], [25]. Akt signalveien har dukket opp som en sentral rute for regulering av flere cellulære prosesser, herunder overlevelse og formering av mange celletyper. Til dags dato, mange humane kreftformer viser hyperaktive av Akt kinaser, og derved inhibering av Akt reaksjonsveien er ansett som en lovende strategi for behandling av kreft [26], [27], [28], [29], [30], [31], [32].
i denne studien, utforsket vi at muligheten for at Rhabdastrellic syre-A drept humane kreftceller via induksjon av autophagy. Vi fant at Hep3B og A549-celler behandlet med Rhabdastrellic syre-A gikk morfologiske og biokjemiske forandringer i samsvar med induksjon av autophagy og celledød. Mekanismen for autofagi induksjon ved Rhabdastrellic syre-A er forbundet med hemming av Akt veien.
Resultater
1. Rhabdastrellic syre-A indusert caspase-uavhengig celledød i Hep3B og A549-celler
behandling av Hep3B og A549-celler i 3 dager med forskjellige konsentrasjoner av Rhabdastrellic syre-A resulterte i inhibering av cellevekst på en doseavhengig måte. IC
50 verdien var 0,42 pg /ml og 2,50 pg /ml (fig. 2A). Hemning av cellevekst kan være resultatet av induksjon av apoptose, autophagy og /eller cellesyklus-stans. Hep3B og A549-celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Rhabdastrellic syre-A i 48 timer og analysert for cellesyklus ved strømningscytometri. Fig. 2B viste at Rhabdastrellic syre-A ikke induserer cellesyklus arrest i Hep3B og A549 celler innenfor disse konsentrasjonsområder på 48 timer. Dermed undersøkte vi om Rhabdastrellic syre-A kan indusere apoptose eller autofagi-assosiert celledød i Hep3B og A549 celler.
A. Kreftceller ble platet med en tetthet på 8000 celler /brønn i en 96-brønns plate. Bestanden av Rhabdastrellic syre-A ble tilsatt til brønnene. Celler ble dyrket i 3 dager. MTT-analysen ble utført. B. Hep3B og A549-celler ble behandlet med indikerte konsentrasjoner av Rhabdastrellic syre-A i 48 timer og analysert for DNA-innhold ved strømningscytometri. Resultatene var representative for 3 forsøk.
Mange typer cytostatika fungere å indusere apoptose av kreftceller som er preget av caspase-3 og PARP cleavage. For å avgjøre om celledød var caspase-avhengige, vi først oppdaget spalting av caspase-3. Ved hjelp av immunblotting-analyse, ble spaltingen av caspase-3 både i kreftceller ikke observert etter behandling med Rhabdastrellic syre-A. Spaltingen av PARP var også umulig å oppdage (fig. 2A). Spalting av kaspase-3 og PARP ble også påvist i begge cellelinjer behandlet med adriamycin. Resultatene viste at pro-kaspase-3 ble spaltet under dannelse av et 17 kd fragmentering og PARP ble spaltet i 89 KDa fragmentering følgende adriamycin behandling (Fig. 3A). Videre er det pan-kaspase-inhibitor, z-VAD-FMK, ikke hemmer Rhabdastrellic syre-A indusert celledød (Fig. 3B). For ytterligere å bekrefte at Rhabdastrellic syre-A indusert hovedsakelig ikke-apoptotisk celledød, Hep3B og A549-celler eksponert for forskjellige konsentrasjoner av Rhabdastrellic syre-A ble analysert ved 48 timers intervaller etter Annexin V-FITC /PI farging assay. Som vist på fig. 3C, de høyeste apoptotiske ratene var 4,4% i Hep3B cellene og 0,2% i A549-celler etter behandling. Disse resultatene sterkt indikerte at Rhabdastrellic syre-A induserte en caspase-uavhengig celledød i Hep3B og A549 celler.
A. i Hep3B og A549-celler, ble Cellelysater fremstilt fra 0,1% DMSO, 1 ug /mL Rhabdastrellic syre-A eller 4 pM adriamycin i 24 timer og 48 timer. Western blot-analyse ble utført med kaspase-3 og PARP-antistoffer. B. Celler ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av Rhabdastrellic syre-A i nærvær eller fravær av 20 pM Z-VAD-FMK i 3 dager. MTT-analysen ble utført. Resultatene (gjennomsnitt ± bred singlett.) Representerer gjennomsnittet av tre forsøk. C. Hep3B og A549-celler ble behandlet med 0 og 4 ug /ml Rhabdastrellic syre-A i 48 timer. Etter behandling ble cellene samlet opp sekvensielt og farget med Annexin V og PI og analysert ved strømningscytometri-analyse.
2. Autophagy-forbundet celledød indusert av Rhabdastrellic syre-A i kreftceller
Rhabdastrellic syre-A induserer dannelsen av autophagosomes.
Membranen-forbundet lett kjede 3 protein, MAP LC3 (Atg8) , lokaliserer til forlengelsen membran og forblir i membranen inntil autophagosome modning. Det er en viktig markør for autofagi. Ved induksjon av autophagy, er LC3-I omdannes til LC3-II, som er mest sannsynlig konjugert til fosfatidyletanolamin (PE) og tett bundet til de autophagosomal membranene som danner ringformede strukturer i cytoplasma. For å måle autofagi, ble Hep3B og A549 celler transfektert med et uttrykk konstruere for LC3 smeltet til gul fluoriserende protein (YFP-LC3). I DMSO-behandlede kontrollceller YFP-LC3 var jevnt fordelt i hele cytoplasmaet. Etter Rhabdastrellic syre-A behandling, ringformede strukturer ble påvist i cytosol, noe som indikerer foreningen av YFP-LC3 med autophagosomal membraner etter en induksjon av autofagi (Fig 4A). Ultrastructural analyse av Rhabdastrellic syre-A-behandlede A549-celler ved elektronmikroskopi viste store autophagic vakuoler i motsetning til kontrollceller hvor ingen slike vakuoler kunne påvises (Fig. 4B).
A. Hep3B og A549-celler ble transfektert med et uttrykk konstruere for LC3 kondensert til gul fluorescerende protein (YFP-LC3) i 24 timer. Deretter ble cellene behandlet med eller uten 1 mg /ml eller 4 mikrogram /ml Rhabdastrellic syre-A i 36 timer, og visualisert under et konfokalt mikroskop. B. elektronmikrograf som viser autophagic vakuolen av A549 celler Følgende 4 mikrogram /ml Rhabdastrellic syre-A-behandling. C. Rhabdastrellic syre En tidsavhengig indusert dannelse av LC3-II, en markør for autofagi. Hep3B og A549-celler ble behandlet med 1 pg /ml Rhabdastrellic syre-A i de angitte tidsrom. Lysates ble analysert ved immunoblotting med LC3 antistoff.
LC3-II uttrykk indusert av Rhabdastrellic syre-A i kreftceller.
Mengden av PE-konjugert form av LC3 (LC3- II) korrelerer godt med antallet autophagosomes. Etter Rhabdastrellic syre-A behandling i de angitte tidsrom, ble LC3 påvist ved immunblotanalyse. Resultatene indikerte at ekspresjonen av LC3-II ble gradvis oppregulert (figur 4C). Dette bekreftet resultatene av YFP-LC3 transfeksjon og indikerte at Rhabdastrellic syre-A kan indusere autofagi i Hep3B og A549 celler.
Autophagy-forbundet celledød indusert av Rhabdastrellic syre-A i kreftceller.
å bekrefte at Rhabdastrellic syre-A indusert autofagi-assosiert celledød, Hep3B-celler ble behandlet med Rhabdastrellic syre-A og /eller 3-metyladenin (en inhibitor av PI3K-C3 som vanligvis brukes for spesifikk inhibering av autophagy). I motsetning til kontrollcellene, etter Rhabdastrellic syre-A behandling, de fleste av de Hep3B cellene først rund, noen ble løsnet fra overflaten av brønner og antall celler ble redusert (figur 5A). Det ble imidlertid virkningene av Rhabdastrellic syre-A behandling reversert ved tre-MA (figur 5A). Det ble foreslått at induksjonen av celledød ved Rhabdastrellic syre-A behandling ble blokkert når cellene var i parallell behandlet med autofagi inhibitor 3-MA.
A. Hep3B celler ble behandlet med 1 pg /ml Rhabdastrellic syre-A og /eller 10 mM 3-MA i 36 timer, og deretter undersøkt ved hjelp av invertert mikroskop. *, P 0,05 vs. Rhabdastrellic syre-A- /3-MA-. **, P 0,05 vs. Rhabdastrellic syre-A + /3-MA-. B. Lysater fra A549-vektor og A549-shAtg5 celler ble analysert ved immunblotting med Atg5 og LC3 antistoffer. C. A549 vektor-celler og A549-shAtg5-celler ble dyrket ved 6000 celler per brønn i en 96-brønns plate, eksponert for forskjellige konsentrasjoner av Rhabdastrellic syre-A 0,05 til 3,2 ug /ml i 72 timer. Veksten inhibering ble påvist ved anvendelse av MTT-analysen. Rapporterte verdier er gjennomsnittet ± SD av triplikate prøver fra et representativt eksperiment. * P-vlaue 0,05 sammenlignet med celler behandlet på samme måte, men uten transfektert shRNA. D. A549-celler ble inkubert med 4 ug /ml Rhabdastrellic syre-A og /eller 10 mM 3-MA i 24 timer. Celledød ble kvantifisert ved hjelp av flowcytometri som PI farging analysen. Forsøket ble gjentatt 3 ganger.
shRNA-baserte uttømming av en essensiell autophagy protein Atg5, effektivt blokkert Rhabdastrellic syre-A-indusert LC3-II-akkumulering (figur 5B). Og inhibering av autophagy ved uttømming av Atg5 inhiberte Rhabdastrellic syre-A-indusert celledød i A549-celler i de konsentrasjonsområder 0,05 til 3,2 mg /ml (figur 5C).
A549-celler utsatt for 4 uM Rhabdastrellic syre-A og /eller 3-MA ble analysert med hensyn til celledød ved 24 timer ved strømningscytometri. Propidiumjodid (PI) positiv ble regnet som «døde» celler. Den celledød indusert av Rhabdastrellic syre-A ble undertrykket når cellene ble behandlet i kombinasjon med 3-MA (fig. 5D).
3. Rhabdastrellic syre-A hemmet Akt sti i Hep3B og A549 celler
Rhabdastrellic syre-A kan hemme Akt sti i HL-60-celler [4]. Det var derfor interessant å teste om det var det samme i andre kreftceller. Som vist i figur 6A, Sent Rhabdastrellic syre-A behandling i de angitte tidsrom eller forskjellige konsentrasjoner, Rhabdastrellic syre-A inhiberte fosforylering av Akt i Hep3B og A549-celler.
Hep3B og A549-celler ble behandlet med syre Rhabdastrellic -A i de angitte konsentrasjoner i 36 timer eller behandlet med 1 pg /ml eller 4 mikrogram /ml Rhabdastrellic syre-A i de angitte tidsrom. A. Celler ble sekvensielt høstet og lysert. cellelysater ble analysert ved immunblotting med fosfo-Akt eller Akt antistoffer. B. mTOR, fosfor-mTOR, FKHR, fosfor-FKHR, STAT3 og fosfor-STAT3 ble analysert ved immunoblotting. Forsøket ble utført 3 ganger.
mTOR, FKHR og STAT3 er tre viktige nedstrøms mål for Akt sti og spiller viktige roller i autofagi og apoptose [33]. Som vist i resultatene (figur 6B), fosforyleringen av mTOR, FKHR og STAT3 hadde dramatisk reduksjon etter Rhabdastrellic syre-A behandling i en tidsavhengig måte i begge cellelinjer. Resultatene indikerte at AKT veien ble hemmet av Rhabdastrellic AICD-A i Hep3B og A549 celler.
4. Induksjon av autofagi av Rhabdastrellic syre-A ble opphevet ved konstituerende aktiv Akt ektopisk uttrykk
Rhabdastrellic syre-A kan hemme Akt sti og indusere autofagi i Hep3B celler. For ytterligere å bekrefte en iboende rolle Akt i autophagy indusert av Rhabdastrellic syre-A, transfiserte vi Hep3B cellene med MYR-akt1 plasmider (aktivert) og valgt positiv klon ved hjelp av G418. Sammenlignet med kontrollcellene (Hep3B celler transfektert med plasmid vektor), det eksogene Akt ekspresjon betydelig øket i Hep3B /MYR-akt1 celler (Fig. 7A). Videre ble markør av autofagi bestemmes mens konstitutiv aktiv Akt uttrykk i Hep3B celler. Sammenlignet med kontrollcellene, ble massiv induksjon av autophagy observert i Hep3B celler, indikert ved økning av LC3-II. Men uttrykker konstituerende aktiv Akt blokkert økning på LC3-II (figur 7B). I samsvar med forestillingen om at noen populasjon av LC3-II blir nedbrutt i lysosomer [34], behandling med lysosomal enzymhemmere pepstatin A resulterte i akkumulering av LC3-II i kreftceller (figur 7C), ble dette fenomen også svekket mens konstitutiv aktiv Akt ektopisk uttrykk. Videre kan konstitutiv aktiv Akt ekspresjon redde Hep3B celler fra Rhabdasterllic syre-A-formidlet vekstinhibering ved behandling av Rhabdastrellic syre-A (Fig. 7D). Disse resultatene er vist i figur 7 indikerte at konstitutiv aktiv Akt ekspresjon kunne hemme Rhabdastrellic syre-A-mediert autofagi.
A. A. den positive klon som stabilt uttrykte myr-akt1 ble analysert ved immunblotting med Akt antistoff. B. Hep3B celler ble behandlet med 1 pg /ml Rhabdastrellic syre-A i 36 timer i fravær eller nærvær av konstitutiv aktiv Akt ektopisk ekspresjon. Deretter LC3 protein-ekspresjon ble analysert. C. Kreftceller ble behandlet med 1 pg /ml Rhabdastrellic syre-A og /eller 10 mikrogram /ml pepstatin A (Pepa) i 36 timer, ble deretter LC3 proteinekspresjon analysert. D. Etter behandling ble levedyktige celler av to cellelinjer målt. *, P. 0,05 vs. Rhabdastrellic syre-A (vektor)
For å undersøke om andre veier er involvert i autofagi indusert av Rhabdastrellic syre-A, vi analyserte nivåer av Bip, CHOP, fosfor -EIF2α og fosfo-AMPK i Hep3B celler etter Rhabdastrellic syre-A-behandling. Resultatene viste at fosforylering av AMPK, EIF2a og CHOP økte etter Rhabdastrellic syre-A behandling i en doseavhengig måte i Hep3B celler. Men en økning av Bip ble ikke detektert (vist i fig. S1). Resultatene indikerte at flere veier kan være involvert i Rhabdastrellic syre-A-indusert autofagi.
Diskusjoner
Resultatene er beskrevet her viser at Rhabdastrellic syre-A kan indusere autofagi i den menneskelige kreftcellelinjer . Rhabdastrellic syre-A kan blokkere Akt bane i Hep3B og A549-celler, og konstitutiv aktiv Akt ekspresjon kunne hemme Rhabdastrellic syre-A-mediert autophagy. Disse resultatene indikerer at inhibering av Akt /mTOR svei er involvert i Rhabdastrellic syre-A indusert autofagi og celledød.
Autophagy har blitt rapportert å være en fremgangsmåte hvorved dobbel membran vakuoler betegnet autophagosomes formen rundt, sluker, og cytosol organeller. Selv om autofagi ble rapportert å bevirke som en prosurvival reaksjon, i noen tilfelle, blir cytotoksisiteten av arsentrioksyd, imatinib, ioniserende stråling etc. til noen celletyper mediert ved induksjon av autophagy. I slike tilfeller utgjør autophagy en nonapoptotic bane for programmert celledød. Mange rapporter viser at triterpenoids ha potensial cytotoksisitet mot kreft cellelinjer [35], [36]. Rhabdastrellic syre-A er en av de triterpenoids som induserte ikke-apoptotisk celledød i Hep3B og A549-celler. Derfor utforsket vi hvorvidt induksjon av autophagy var nødvendig for Rhabdastrellic syre-A-mediert celledød i disse to kreftcellelinjer. Autophagic celler forstørre uten permeabilization av plasma membran, konvertere LC3-I til LC-II, viser punktat cytoplasma LC3 trans og utvikle autophagosome. I denne studien Hep3B og A549 celler utstilt morfologiske og biokjemiske egenskaper som er karakteristiske for celler som gjennomgår autofagi, ikke apoptose følgende Rhadastrellic syre En behandling. Også, veksthemming av Rhabdasterllic syre-A på A549-celler var svakere enn den i Hep3B celler. Men Rhabdasterllic syre-A økte mer LC3-II uttrykk. Omdannelse av LC3-I til LC3-II kan observeres i autophagy initiering. Men delvis LC3-II kan bli degradert når autofagi modning. Bare LC3-II uttrykket kan ikke indikere følsomhet for autofagi.
Tidligere studier på mekanismen bak reguleringen av autophagy i kreftceller viste at autofagi ble regulert av flere signalveier så forskjellige som klasse III PI 3-kinase og proteinkinaser mTOR, ERK, og p38. Avvikende aktivering av Akt /mTOR-signalreaksjonsveien ble innblandet i en rekke humane malignances [20], [21], [22], [23], [24], [25], [37]. Fosforylert Akt spiller sentrale roller i noen grunnleggende prosesser, herunder celleproliferasjon, celledød, cellemotilitet /vedheft, celletransformasjon, og neovaskularisering. Når den er aktivert, Akt fungerer som en overlevelsesfaktor ved å hindre frigjøring av cytokrom c fra mitochondria og inaktiverer FKHR som er kjent for å indusere ekspresjon av pro-apoptotiske faktorer som Fas-ligand [38]. Hemming av mTOR induserer apoptose i noen typer kreftceller, mens de utløser autofagi i andre sammenhenger. Rapamycin, en hemmer av mTOR, ble rapportert å indusere den klassiske autophagic celledød i kreftcellene. Vår tidligere studie viste også at Rhabdastrellic syre-A hemmet PI3K /Akt sti og indusert apoptose i human leukemi HL-60 celler [4]. Så hemming av Akt kan aktivere enkelte autofagi relaterte proteiner og indusere autofagi. I tråd med dette funnet, observerte vi at Rhabdastrellic syre-A kunne hemme fosforyleringen av Akt i Hep3B og A549-celler. Fosforylering av mTOR, FKHR og STAT3 også dramatisk redusert etter Rhabdastrellic syre En behandling. Videre kan ektopisk konstituerende aktiv Akt uttrykk blokkere autofagi indusert av Rhadastrellic syre-A. Til sammen Rhadastrellic syre-A indusert autofagi gjennom hemming av Akt /mTOR sti.
I sammendraget, dagens studier viser at Rhabdastrellic syre-A dreper Hep3B og A549 celler via induksjon av autophagy. Hemming av Akt /mTOR pathway spiller en nøkkelrolle i Rhabdastrellic syre-A-mediert autofagi. Som kreftceller ofte skaffe defekter i autofagi sammenlignet med normale celler, farmakologisk aktivering av autofagi gjennom hemming av Akt /mTOR sti kan drepe kreftceller og begrense tumorigenesis, spesielt i kreft med defekter i apoptose. Vår studie gir også bevis for at Rhabdastrellic syre-A fortjener videre undersøkelser som en potensiell kreft agent eller kreft forebyggende middel.
Materialer og metoder
Narkotika og reagenser
Rhabdastrellic syre -En ble isolert fra svampen Rhabdastrella globostellata og først løst i 100% Dimethylsulfoxid (DMSO) og lagret ved -20 ° C. Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium-bromid (MTT) og 3-metyladenin (3-MA) ble innkjøpt fra Sigma Co. (Sigma Aldrich, M2128). RPMI medium 1640 ble kjøpt fra Invitrogen (Invitrogen, 11875).
Cellelinjer og cellekultur
Menneskelig leverkreft cellelinje Hep3B [39] og human lunge adenokarsinom epitelcellelinje A549 [40] ble dyrket i RPMI-1640 supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum, penicillin (50 U /ml) og streptomycin (50 ug /ml). Cellene ble inkubert ved 37 ° C i fuktig 5% CO2.
MTT-analysen
Celler ble sådd ut i 96-brønns plate. Beholdningen av Rhabdastrellic syre-A ble fortynnet, tilsatt til brønnene for den ønskede endelige analysekonsentrasjonen. Etter 3 dagers eksponering til Rhabdastrellic syre-A, ble 10 ul av MTT (5 mg /l) tilsatt til hver brønn og inkubert i fire timer, deretter væske i brønnene ble dampet inn. 100 ul DMSO ble tilsatt til hver brønn. Absorbansen ble påvist i mikroplateleser modell 550 med 565 nm bølgelengde (Bio-Rad Co, 17024). Veksthemming ble beregnet og IC
50 verdi ble bestemt ved hjelp av Bliss Software.
Annexin V-FITC /PI farging assay
Celler med forskjellige behandlinger ble oppsamlet, resuspendert med 10% 1640 medium, justert cellesuspensjonen konsentrasjon til ca. 1 x 10
6 celler /ml, og overført 0,5 ml cellesuspensjon til et mikrosentrifugerør. Etter det tilsatt 10 ul media bindende reagens og 1,25 pl Annexin V-FITC, ble celler inkubert ved romtemperatur i 15 minutter i mørke, deretter sentrifugert og fjernes media. Når resuspendert i 0,5 ml kald 1 x bindingsbuffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 20% BSA pH 7,4), cellene ble det tilsatt 10 ul propidiumjodid (30 ug /ml), plassere prøvene på is og borte fra lys. Apoptose ble analysert ved flow-cytometri ((Beckman Coulter, Fullerton, CA) ved bølgelengden 488 nm med en gang.
Cell syklus deteksjon
Celler ble oppsamlet, resuspendert med 1 ml forhåndsavkjølt 70% etanol og fiksert i 4 ° C over natten. etter fjernes etanol og tilsatt 0,5 ml fargeløsning (50 ug /ml PI, 100 ug /ml RNaseA, 0,2% Triton-100), cellene ble inkubert i 37 ° C i 30 minutter i mørk. Celle syklus fordeling ble analysert ved flow-cytometri ((Beckman Coulter, Fullerton, CA) ved bølgelengden 488 nm med en gang.
PI fargingsanalyse
Cellene ble trypsinisert med 0,5 ml 0,25% trypsin i 3 minutter, oppsamlet og resuspendert med 1 ml forhåndsavkjølt PBS. etter å ha tilsatt 0,5 ml fargeløsning (50 ug /ml PI, 100 ug /ml RNaseA, 0,2% Triton-100), cellene ble inkubert i 37 ° C i 30 min i mørket. Celledød ble oppdaget av flowcytometri ((Beckman Coulter, Fullerton, CA).
Konfokalmikroskopi og indirekte immunfluorescens
Celler ble dyrket på dekkglass og transfektert med pYFP-LC3 for Hep3B og A549 celler. 36 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med Rhabdastrellic syre-A og analysert etter ytterligere 36 timer. Celler ble fiksert med 4% paraformaldehyd i PBS i 30 minutter ved romtemperatur, ble platene montert i anti-fading løsning og lagret ved 4 ° C. Glassene ble sett med en laser-scanning confocal mikroskop (Olympus, FV-1000).
Elektronmikros
Celler ble løst ved nedsenkning i en blanding av 2,5% glutaraldehyd, 2,5% paraformaldehyde og 0,05% pikrinsyre i 0.067M kakodylatbuffer (pH 7,4). Postfixation ble utført i 1% osmiumtetroksyd, etterfulgt av en neddykking over natten med 0,3% uranylacetate oppløst i 50 mM maleat buffer (pH 5,0). Standard prosedyrer for dehydrering og forankring i Epon var ansatt. Tynne snitt ble videre farget med bly citrate, og ble undersøkt i et elektronmikroskop (Philip, CN10).
Western blot analyse
Lysates ble fremstilt fra 4 × 10
5 celler ved oppløsning av cellepelletene i 100 ul lyseringsbuffer (20 mM Na
2PO
4 (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% aprotinin, 1 mM phenymethysulfonyl fluorid, 10 mg /mL leupeptin, 100 mM NaF, og 2 mM Na
3VO
4). Lysatene ble sentrifugert ved 12000 rpm i 10 min. Supernatanten ble oppsamlet. Proteininnholdet ble bestemt ved anvendelse av Bio-Rad proteinanalyse. SDS-PAGE-prøvebuffer (10 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glyserol, 0,2 M DTT) ble tilsatt til lysatene. Lysatene ble oppvarmet til 100 ° C i 5 minutter, og 40 ug protein ble applisert i hver brønn av en 4-20% SDS-PAGE-gel. Løst proteiner ble elektroforetisk overført til nitrocellulose og inkubert sekvensielt med primært antistoff og pepperrot peroksidase-konjugert geit-anti-mus IgG (Santa Cruz, sc-2005) eller geite-anti-kanin-IgG (Santa Cruz, sc-2004). Etter vasking, ble det bundne antistoff-komplekset påvises ved å bruke LumiGLO reagens (Cell Signaling Technology, # 7003) og XAR film (Kodak, XBT-1) som beskrevet av de produserer. De følgende primære antistoffer ble brukt: caspase-3-antistoff (Santa Cruz, sc-7272), PARP-antistoff (Santa Cruz, sc-7150), glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase-antistoff (Santa Cruz, sc-47724), LC3 antistoff (Novus Biologicals, NB100-2220), Atg5 antistoff (Cell Signaling Technology, # 2630), Phospho-akt1 /2/3 (ser473) antistoff (Santa Cruz, sc-7985-R), akt1 antistoff (Santa Cruz, sc-1618) , Phospho-mTOR (ser2448) antistoff (Cell Signaling Technology, # 2971), mTOR antistoff (Cell Signaling Technology, # 2972), Phospho-FKHR (ser256) antistoff (Cell Signaling Technology, # 9461), FKHR antistoff (Cell Signaling Technology # 9462), Phospho-STAT3 (ser727) antistoff (Santa Cruz, sc-8001-R), STAT3 antistoff (Cell Signaling Technology, # 9132).
plasmider og transfeksjon
myr -Akt1 (aktivert # 21-151) eller tomt plasmid (pUSEamp (+) # 21-147) ble kjøpt fra upstate Co. Hep3B celler ble sådd i 6-brønns plate dagen før transfeksjon. Transfeksjoner av myr-akt1 (aktivert) eller tomt plasmid (vektor) ble utført med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) ifølge protokollen foreslått av produsenten. Etter 48 timer av transfeksjon ble de positive kloner valgt under G418 (1000 mikrogram /ml).
konstruerer, Retroviral Infeksjon, og RNA interferens
For stabil ATG5 siRNA uttrykk, retroviral vektor ( pSUPER. puro, en gave av professor Musheng Zeng, Cancer Center, Sun Yat-sen-universitetet, Guangzhou, Kina) kode hårnål RNA-sekvenser ble konstruert. En distinkt kort hårnål RN (shRNA) sekvenser mot ATG5 (shATG5) ble samlet og klonet inn i ekspresjonsvektoren.
