Abstract
Aberrant aktivering av pinnsvin (Hh) signalveien har vært implisert i epitel-til-mesenchymale overgang (EMT) og kreft stilk-liknende celle (CSC) vedlikehold; begge fremgangsmåter kan resultere i tumorprogresjon og behandling motstand i flere typer kreft hos mennesker. Hh samvirker med den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR) signalveien i embryogenesen. Vi fant ut at Hh signalveien ble stille i EGFR-TKI-sensitive ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler, mens det ble feilaktig aktivert i EGFR-TKI-resistente NSCLC celler, ledsaget av EMT induksjon og ABCG2 overekspresjon. Oppregulering av Hh signaliserer gjennom ytre SHH eksponering downregulated E-cadherin uttrykk og forhøyet Snail og ABCG2 uttrykk, noe som resulterer i gefitinib toleranse (
P . 0
001
) i EGFR-TKI-sensitive celler. Blokade av Hh signalveien med SMO antagonist SANT-en restaurert E-cadherin uttrykk og downregulate Snail og ABCG2 i EGFR-TKI-resistente celler. En kombinasjon av SANT-en og gefitinib markert hemmet tumordannelse og spredning i EGFR-TKI-resistente celler (
P . 0
001
). Disse funnene tyder på at hyperaktivitet av Hh signale resulterte i EGFR-TKI motstand, ved EMT innføring og ABCG2 oppregulering, og blokaden av Hh signalesynergistisk økt følsomhet for EGFR-TKI i grunnskolen og videregående resistente NSCLC celler. E-cadherin uttrykk kan være en potensiell biomarkør av hensiktsmessigheten av den kombinerte bruk av en Hh inhibitor og EGFR-TKI i EGFR-TKI-resistente NSCLCs
Citation. Bai XY, Zhang XC, Yang SQ, An SJ, Chen ZH, Su J et al. (2016) Blokkering av Hedgehog Signasynergistisk øker følsomheten til epidermal vekstfaktor reseptor tyrosinkinasehemmere i ikke-småcellet lungekreft cellelinjer. PLoS ONE 11 (3): e0149370. doi: 10,1371 /journal.pone.0149370
Redaktør: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, USA
mottatt: 28 desember 2014; Godkjent: 31 januar 2016; Publisert: 04.03.2016
Copyright: © 2016 Bai et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser. de autors har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er en ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis, og utgjør en betydelig risiko for menneskers helse. Median overlevelse av pasienter med avansert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) som mottar standard kjemoterapi er bare 9-12 måneder [1]. Ankomsten av molekylært målrettet terapi har kastet mye lys på lungekreft behandling. Epidermal vekstfaktor-reseptor tyrosin kinase hemmere (EGFR-TKI) har blitt standard førstelinjebehandling ved avansert NSCLC med sensitive EGFR mutasjoner [2, 3]. Imidlertid nesten alle pasienter uunngåelig utvikle resistens i løpet av 6-12 måneder etter initiering av EGFR-TKI behandling [4]. Selv om flere mekanismer, inkludert T790M sekundære mutasjon [5, 6], MET forsterkning [7, 8], hepatocytter vekstfaktor (HGF) overekspresjon [9], og KRAS mutasjon [10, 11], har blitt rapportert, vinne EGFR -TKI motstand er fortsatt en utfordring i klinisk praksis.
Emerging bevis tyder på at induksjon av epitel-til-mesenchymale overgang (EMT) i malignitet resulterer i tumorprogresjon og medikamentresistens [12, 13]. Cancer stilk-lignende celler (cscs) er en annen grunn for resistens mot konvensjonelle tumorterapi [14]. Nylige rapporter antydet at EMT prosesser kan generere cscs [15]. Den pinnsvin (Hh) signalveien, en viktig regulator for mange grunnleggende prosesser, tett regulerer celleproliferering, differensiering, EMT, og stamcelle vedlikehold i virveldyr embryoutvikling, og avvikende Hh aktivering i voksent vev har vært implisert i tumorgenese, selvfornyelse og resistens i flere typer kreft hos mennesker, inkludert lungekreft [16-18]. Tre Hh homologer er identifisert hos mennesker: Sonic pinnsvin (SHH), indisk pinnsvin (IHH), og Desert pinnsvin (DHH) [19, 20]. Den Hh signalveien er initiert av Hh-ligandbinding til en 12-transmembranprotein «, lappet» (ptch). I fravær av den ligand Hh, undertrykker ptch aktiviteten av glattes (SMO), en G-lignende protein-koblet reseptor, ved å hindre dens lokalisering til den primære cilium. Når Hh binder seg til ptch, er hemming av SMO lettet, slik at SMO til translocate til den primære cilium og til transduce den Hh signal til GLI familie av sink-fingertranskripsjonsfaktorer (GLI1, GLI2, GLI3) [20, 21]. De Glis deretter translocate inn i kjernen til å regulere aktivering av Hh målgener involvert i ulike prosesser, for eksempel tilbakemeldinger regulering, spredning, EMT, og selvfornyelse [22, 23].
Under embryogenesen HH signalveien samvirker med EGFR-signalveien i ferd med å neokortikale stamcelleproliferasjon [23]. Samle bevis indikerer at samarbeids interaksjoner mellom Hh og EGFR-trasé medføre synergistisk regulering av Telenor mål genuttrykk og bidra til malign transformasjon av kreftceller,
in vitro Hotell og
in vivo product: [24 , 25]. Til sammen skulle vi at stimulering av Hh signalveien kan omgå eller svekke den terapeutiske effekten av EGFR-TKI i NSCLC. Derfor brukte vi EGFR-TKI-sensitive og -resistente NSCLC cellemodeller først vise at oppregulering av Hh signale bidratt til EGFR-TKI-motstand. Vi fant at kombinasjonen av en Hh signale inhibitor og EGRF-TKI hadde en markert synergistisk effekt hos NSCLC celler.
Materialer og metoder
Antistoffer og reagenser
Gefitinib ble gitt av Astrazeneca (Cheshire, UK). Den Hh inhibitor SANT-en ble kjøpt fra Tocris Bioscience. Rekombinant human Shh N-terminal ble kjøpt fra R frossen seksjoner (5 um) ble fiksert i kald metanol i 10 minutter og lufttørket. Disse objektglass ble neddykket i 3% H
2o
2 til 10 minutter for å blokkere endogene peroksidaser, deretter inkubert med 10% geiteserum albumin i 10 min ved værelsestemperatur for å blokkere ikke-spesifikk antistoffbinding. Deretter ble cellene farget med GLI1, E-cadherin, Snail og ABCG2 primære antistoffer (1: 100) over natten ved 4 ° C. Etter vasking med PBS, ble cellene inkubert med seg
+ /HRP mot kanin (DAKO GK400305, Glostrup, Danmark) i 30 minutter, etterfulgt av 3,3′-diaminobenzidin (DAB) deteksjon. Lysbilder ble kontra med hematoksylin og etter dehydrering ble montert permanent. Negative kontroller ble utført i alle tilfeller ved å utelate de primære antistoffer.
Alle lysbildene ble evaluert uavhengig av to patologer som var blindet for den saksopplysninger. Saker med flekker i 10% av cellene ble betraktet som positive. Immunhistokjemiske reaktivitet ble gradert på en skala fra 0 til 3 i henhold til fargeintensitet og prosentandelen av immunopositive celler, som følger: 0 = ingen farging, 10% positive celler, 1, svak flekker i 10% av tumorceller eller moderat farging i 10-40% av tumorcellene, 2, moderat farging i 40% av tumorceller eller sterk farging i 10-40% av tumorcellene, eller 3, sterk farging i 40% av tumorceller [26].
RNA isolering og kvantitativ real-time PCR-analyse
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp TRIZOL reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) fra cellelinjer i henhold til produsentens instruksjoner. Total RNA ble kvantifisert ved hjelp av ultrafiolett spektrofotometer (Nanodrop ND-1000). RNA integritet ble vurdert ved anvendelse av 1% denaturerende agarosegel-elektroforese. CDNA-syntese ble utført ved anvendelse av høy kapasitet cDNA revers transkripsjon settet (ABI, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Q-PCR-reaksjoner ble utført ved anvendelse av TaqMan genekspresjon masterblanding (ABI, USA), ble β-ACTIN anvendt som en endogen kontroll for å normalisere dataene. Alle qPCR reaksjoner ble utført i tre eksemplarer. Primer sekvenser brukt i denne studien var følgende: 5′-AGCGTGAGCCTGAATCTGTG-3 «(fremover) og 5′-CAGCATGTACTGGGCTTTGAA-3′ (bakover) for GLI1, 5»-AAAGACCTGTACGCCAACAC-3 «(fremover) og 5»-GTCATACTCCTGCTTGCTGAT- 3 «(bakover) forβ-aktin. Den relative RNA uttrykk nivå GLI1 ble beregnet med 2
-Δct metoder.
Western blot analyse
Cell ble dyrket i 25cm
2 kulturflasker og høstes i log vekstfase for protein utvinning. Celle Totalt protein ble ekstrahert fra behandlede celler ved hjelp radioimmunopresipitasjonsanalyse assay ( «RIPA») buffer, supplementert med proteasehemmere PMSF. Proteinkonsentrasjonen av hvert lysat ble bestemt ved å bruke bicinchoninic syre analysen. Proteiner (30 ug /brønn) ble separert ved SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner. Proteinene ble blokkert med 5% Proteiner ikke-fettholdig melk i 1 time ved romtemperatur. Proteiner ble påvist ved inkubering av membraner i nærvær av følgende primære antistoffer: GAPDH (1: 1000), ABCG2 (1: 500), snegle (1: 500), E-cadherin (1: 500) og Gli1 (1 : 500) og deretter inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff ved romtemperatur i 1 time. Antistoff binding ble oppdaget av en forbedret chemiluminescence kit (Thermo, Rockford, IL, USA).
Films ble skannet og analysert med bilde J programvare for protein kvantifisering. De relative proteinnivåer ble telt ved bruk av en sammenligning med ubehandlet kontroll.
celleproliferasjonsanalyse
Celler ble sådd i 96-brønns plater ved en densitet på 2000 /brønn for PC9, 3000 /brønn for H1975, og 1500 /brønn for A549. Etter over natten festing, ble cellene behandlet med fem replikater, med SHH-N 1 ug /mL (R . SPSS Inc., Chicago, IL). Resultater er presentert som gjennomsnitt ± SE av minst tre forsøk. Først data ble testet for en normal fordeling og homoscedasticity. Forskjeller i Q-PCR, western blot grå-skalaverdiene, og celle-klon formasjon, mellom grupper ble evaluert ved en-veis ANOVA, ble forskjeller i celleformering testet ved en faktoriell analyse, og konsern forskjeller ble evaluert ved anvendelse av LSD test hvis data ble normalfordelte og viste homoscedasticity. Ellers ble en Welch test som brukes, og konsern forskjeller ble evaluert ved bruk av Dunnetts test T3. Forskjeller i rangert data mellom gruppene ble vurdert ved hjelp av en Kruskal-Wallis H-test. Korrelasjoner av rangert data ble analysert ved hjelp av Spearmans rank korrelasjon test.
P
verdier 0,05 ble ansett for å indikere statistisk signifikans i alle tilfeller.
Resultater
Forskjeller i Hh signalveien aktivitet mellom EGFR-TKI-sensitive og -resistente NSCLC celler
For å vurdere Hh signalveien forskjeller mellom EGFR-TKI-sensitive og -resistente NSCLC celler, tre NSCLC cellelinjer, PC9, H1975, og A549, som bærer forskjellige mutasjoner og ulik følsomhet for TKI, ble brukt. For det første uttrykk for GLI1, en markør for aktivering av Hh signalveien, ble bestemt ved immunocytokjemi. Som vist i figur 1A, ble GLI1 uttrykt i kjernen av EGFR-TKI-resistente cellelinjer A549 og H1975, men GLI1 ekspresjon var negativ i EGFR-TKI-sensitive cellelinje PC9. Vi har bekreftet dette resultatet av Q-PCR og Western blot analyse. Som vist i figur 1B og 1C, ble GLI1 uttrykt på et svært lavt nivå i PC9 sammenlignet med H1975 og A549 celler
(P . 0
001 Hotell og
P = 0
.
005
henholdsvis). Tidligere studier indikerte at Hh signale regulerer EMT via oppregulering av transkripsjonsfaktoren sneglen og nedregulering av E-cadherin [27, 28]. Stamcelle markør ABCG2 er også en direkte målet for Hh signalveien [29]. For ytterligere å klargjøre Hh pathway forskjeller mellom EGFR-TKI-sensitive og -resistente celler, ble disse tre viktige nedstrøms målgener undersøkt ved Western blotting. Vi fant ut at sneglen uttrykk var betydelig svakere i EGFR-TKI-sensitive PC9 cellelinje sammenlignet med EGFR-TKI-resistente cellelinjer H1975 og A549 (
P
= 0,001). E-cadherin uttrykk i PC9 cellene var ganske høy, mens dens uttrykk var veldig svak i EGFR-TKI-resistente cellelinjer H1975 og A549 (
P
0,001; figur 1D). Dette resultatet var i samsvar med tidligere rapporter som snegl uttrykk ble omvendt korrelert med at av E-cadherin [30, 31]. ABCG2 uttrykk var også ganske høyt i EGFR-TKI-resistente cellelinjer H1975 og A549 sammenligne med sitt uttrykk i EGFR-TKI-sensitive PC9 cellelinje (
P
0,001; figur 1D). Sammen utgjør disse resultatene indikerte en signifikant forskjell i aktivitet av Hh signalveien mellom EGFR-TKI-sensitive og -resistente celler. Den Hh signalveien ble abnormt aktivert i EGFR-TKI-resistente celler, mens det ble stille i EGFR-TKI-sensitive celler.
(A). Forskjeller i GLI1 uttrykk i EGFR-TKI-sensitive og -resistente NSCLC celler bestemmes med immunocytochemistry. GLI1 ble uttrykt i kjernen av EGFR-TKI-resistente cellelinjer A549 og H1975, men GLI1 uttrykk var negativ i EGFR-TKI-sensitive cellelinje PC9. (B). Relativ GLI1 mRNA uttrykk i EGFR-TKI-sensitive og -resistente NSCLC celler bestemmes av Q-PCR; Ekspresjonen av PC9 var signifikant lavere enn den til H1975 og A549; ** (
P
0,01). (C). Forskjeller i GLI1 uttrykk i EGFR-TKI-sensitive og -resistente NSCLC celler bestemt ved western blot. (D) Forskjeller i E-cadherin, Snail og ABCG2 uttrykk i EGFR-TKI-sensitive og -resistente NSCLC celler bestemt ved western blot.
oppregulering av Hh signalveien aktivitet ved eksponering for SHH bly å gefitinib toleranse ledsaget av EMT induksjon og ABCG2 oppregulering i EGFR-TKI-sensitive NSCLC celler
Basert på resultatene ovenfor, hypotese vi at avvikende aktivering av Hh signalveien kan bidra til EGFR-TKI motstand i NSCLC ved å påvirke EMT og CSC vedlikehold. For å undersøke denne muligheten, testet vi den rollen Shh signalisering i NSCLC celler. Først EGFR-TKI-sensitive PC9-celler ble behandlet med N-Shh (0,5 pg /ml). Immunocytokjemi Resultatet viste at GLI1 ekspresjon i PC9 celler var negativ uten eksponering for N-Shh, men det ble uttrykt i kjernen etter at N-Shh behandling i 24 og 48 timer (figur 2A). Western blotting og Q-PCR resultater viste at GLI1 uttrykk ble åpenbart forhøyet etter eksponering for N-Shh for 24 timer og 48 timer (
P
= 0,008 og
P
0,001 henholdsvis Fig 2B og 2C). Disse resultatene viste at Hh signale ble aktivert ved extrinsic N-Shh i PC9 celler.
(A) immuncytokjemisk analyse av GLI1 i PC9 celler etter N-Shh (0,5 ug /ml) behandling for 0, 24, og 48h. GLI1 uttrykk i PC9 cellene var negativ uten eksponering for N-Shh. GLI1 ble uttrykt i kjernen etter at N-Shh behandling i 24 og 48 timer. (B) Western blot-analyse av GLI1 i PC9 celler etter N-Shh (0,5 ug /ml) behandling for 0, 24, og 48 timer. (C) Q-PCR-analyse av mRNA GLI1 relative ekspresjon i PC9 celler etter N-Shh (0,5 ug /ml) behandling for 0, 24, og 48 timer; GLI1 ekspresjon ble åpenbart forhøyet etter eksponering for N-Shh i 24 timer og 48 timer; ** (
P
0,01). (D) Spredning av PC9 celler ble bedømt ved MTT-analyse etter behandling med de angitte konsentrasjoner av gefitinib med eller uten pre-eksponering til extrinsic N-Shh (0,5 ug /ml) i 24 timer; sammenlignet med gefitinib mono gruppe, eksponering for ytre N-Shh betydelig økt gefitinib toleranse i PC9 celler ** (
P
0,01). (E) Western blot analyse av E-cadherin, Snail og ABCG2 i PC9 celler etter N-Shh (0,5 mikrogram /ml) behandling for 0, 24 og 48 timer.
Deretter EGFR-TKI -sensitive celler PC9 ble behandlet med økende konsentrasjoner av gefitinib med eller uten eksponering for ytre N-Shh (0,5 ug /ml), og deres levedyktighet ble bestemt. Våre resultater viste at sammenlignet med gefitinib mono gruppe, eksponering for ytre N-Shh betydelig økt gefitinib toleranse i PC9 celler (
P
= 0,001; figur 2D og S1 og S2 tabeller). Disse funnene viser at avvikende aktivering av Hysj signalveien fører til EGFR-TKI motstand hos NSCLC celler.
For å undersøke de molekylære mekanismene bak bidraget av Shh aliserte til EGFR-TKI motstand hos NSCLC celler, undersøkte vi Snail , E-cadherin, og ABCG2 uttrykk ved 0, 24, og 48 timer etter behandling av celler med PC9 N-Shh (0,5 ug /ml) ved Western blotting. Som vist i figur 2E, etter eksponering for N-Shh i 24 timer, ble ekspresjonen av sneglen forhøyet (
P
0,001), ekspresjon av E-cadherin er åpenbart svekket (
P
= 0,003), og ABCG2 uttrykk ble markert oppregulert i PC9 celler (
P
= 0,008). Disse effektene ble opprettholdt i 48 timer etter N-Shh stimulering. Disse resultatene bekreftet at hyperaktive av Hh signale bidratt til EGFR-TKI motstand hos NSCLC cellene gjennom aktivering av EMT overgang og ABCG2 oppregulering.
Hh hemming snudd EMT induksjon og redusert ABCG2 uttrykk i EGFR-TKI-resistente NSCLC cellene
tillegg, for ytterligere å vurdere de molekylære mekanismer for Hh signalisering i EGFR-TKI-resistente NSCLC-celler, undersøkte vi GLI1, sneglen, E-cadherin, og ABCG2 uttrykk ved 0, 24, og 48 timer etter behandlingen av EGFR-TKI-resistente cellelinjer H1975 og A549 med SANT-1 (40 pM). Resultatene viste at etter behandling med SANT-1 i 24 timer, ble GLI1 ekspresjon nedregulert (
P
0,001) og snegle-ekspresjon ble betydelig svekket i begge cellelinjene (
P
0,001 og
P
= 0,003 henholdsvis); etter behandling med SANT-1 i 48 timer, sneglen ekspresjon var nesten fraværende i H1975 celler (figur 3A og 3B). Motsatt ble E-cadherin uttrykk forhøyet betydelig etter behandling av EGFR-TKI-resistente cellelinjer med SANT-en for 48 h (
P
0,001). ABCG2 ekspresjon var ubetydelig etter SANT-en behandling i 24 timer (figur 3A og 3B). Disse funn viste at Hh inhibering reverseres EMT og reduserte ABCG2 ekspresjon i EGFR-TKI-resistente NSCLC-celler.
(A) og (B), Western blot-analyse av den Hh signalveien aktivitet og dens målgener E -Cadherin, sneglen og ABCG2 i EGFR-resistente celler A549 og H1975 etter SANT-1-behandling etter 0, 24 og 48 timer. (C) og (D), kolonidannelse kvantitativ analyse i A549 og H1975 celler; gefitinib alene eller SANT1 alene ikke hemme klonogene vekst effektivt. Imidlertid kolonier meget knapt dannet i gruppen underkastet kombinert SANT-1 og gefitinib behandling i A549 og H1975 celler; * (
P
0,05), ** (
P
0,01). (E) og (F), spredning av A549 og H1975-celler ble bestemt ved MTT-analyse etter behandling med de angitte konsentrasjoner av gefitinib alene, SANT-1 alene, eller en kombinasjon av gefitinib og SANT-1; * (
P 0
05.)
, ** (
P . 0
01
).
kombinasjonen av gefitinib og SANT-en synergi hemmet tumordannelse og spredning i EGFR-TKI-resistente NSCLC cellelinjer
for å demonstrere rolle Hh signalveien i NSCLC cellene videre, blokkert vi Hh signale bruker SMO inhibitor SANT-1. IC
50 av SANT-en i de fleste NSCLC cellelinjer er ~ 40 mikrometer [18], og IC
50 av gefitinib i EGFR-TKI-sensitive celler er ~ 20 nM [32]. Dermed blir EGFR-TKI-resistente cellelinjer A549 og H1975were behandlet med 40 uM SANT-1 alene, 20 nM gefitinib alene, eller en kombinasjon av SANT-1 og gefitinib. Som vist i figur 3C og 3D, SANT-1 og gefitinib alene ikke hemmer klonogene vekst (
P
= 0,252 og
P
= 0,187 henholdsvis). Men kolonier svært knapt dannet i gruppen utsettes for kombinert SANT-en og gefitinib behandling (
P
0,001). Disse resultatene indikerer at SANT-1 og gefitinib kan ha en synergistisk effekt i EGFR-TKI-resistente NSCLC-celler. For å bekrefte dette, behandlet vi EGFR-TKI-resistente NSCLC cellelinjer A549 og H1975 med økende konsentrasjoner av SANT-en alene, gefitinib alene, og kombinasjoner av SANT-en og gefitinib, og deretter vurderes deres spredning. Resultatene viste at A549-celler var resistente ikke bare å gefitinib, men også til SANT-1 (
P
= 0,503, fig 3E og S3 og S4 Tables). Dette resultatet er i samsvar med en tidligere rapport som A549-celler viste hyperaktive av Hh signalering, men var resistente mot Hh-signalisering inhibitorer [18]. Imidlertid er kombinasjonen av gefitinib og SANT-1 inhiberte proliferasjonen av A549-celler (
P
0,001, fig 3E og S3 og S4 Tables). Selv sammenlignet med gefitinib, SANT-en var mer effektive i H1975 celler (
P
= 0,002), H1975 celler viste den «beste» som svar på en kombinasjon av gefitinib + SANT1 (
P
0,001; figur 3F og S5 og S6 Tables). Samlet utgjør disse resultatene bekreftet at kombinasjonen av en Hh signale inhibitor og EGFR-TKI hadde merket synergieffekter på EGFR-TKI-resistente NSCLC celler.
Aktivitets av Hh signalveien i EGFR-TKI-sensitive og -resistente NSCLC vev
for ytterligere å forstå forskjellen i Hh signalveien aktivitet mellom EGFR-TKI-sensitive og -resistente NSCLCs, uttrykk for GLI1, ABCG2, sneglen, og E-cadherin ble vurdert ved IHC i fire NSCLC vev som inneholdt EGFR ekson 19 sletting eller L858R sensitive mutasjon, fire vev som inneholdt EGFR T790M videregående mutasjon, og fire vev som inneholdt KRAS-mutasjon (fig 4). Resultatene indikerte at GLI1 ble uttrykt i både EGFR-TKI-sensitive og -resistente vev. På grunn av den lille størrelsen av prøvene, GLI1 uttrykk viste ingen statistisk signifikant forskjell mellom de tre gruppene (
P
= 0,108). Imidlertid, var gjennomsnittlig rangering av EGFR-TKI-følsomme vev var 5,25, den sekundære resistente mutasjons vev var 4,88, og den gjennomsnittlige rangering av KRAS mutasjons vev var 9,38. Dermed ble en trend mot høyere GLI1 uttrykk funnet i vev som inneholdt KRAS-mutasjon (tabell 1 og 2). KRAS mutasjon-husing NSCLCs kan ha høyere Hh signalveien aktivitet sammenlignet med de med EGFR-TKI-følsomme mutasjoner og sekundære resistente mutasjoner.
(A) og (B), negativ kontroll og positiv GLI1 uttrykk i NSCLC vev . (C) og (D), og negativ kontroll positiv E-cadherin ekspresjon i NSCLC vev. (E) og (F), negativ kontroll og positiv Snail uttrykk hos NSCLC vev. (G) og (H), negative og positive ABCG2 uttrykk hos NSCLC vev.
ABCG2 uttrykk var ikke signifikant forskjellig mellom EGFR-TKI-sensitive, videregående motstandsdyktig, og primær resistente NSCLC vev (
P
= 0,340). E-cadherin var moderat eller sterkt uttrykt i de fleste NSCLC vev (9/12,
P
= 0,555). Motsatt Snail var negative eller svakt uttrykt i de fleste vev (11/12,
P
= 0,658) (tabell 1 og 2).
korrelasjonsanalyse viste at E-cadherin uttrykk var betydelig negativt korrelert med Snail uttrykk (
r
= 0,582,
P
= 0,047). Dette resultatet var i overensstemmelse med celleforsøk. I tillegg GLI1 uttrykk var negativt korrelert med E-cadherin uttrykk (
r
= 0,408,
P
= 0,188), og positivt korrelert med Snail (
r
= 0,372,
P
= 0,300) og ABCG2 (
r
= 0,386,
P
= 0,215) uttrykk. Selv korrelasjonene manglet statistisk signifikans på grunn av den lille prøvestørrelsen, tendensen var konsistente med celleforsøk.
diskusjon
Hh signalveien er en effektiv terapeutisk mål ved behandling og forebygging av mange typer av kreft hos mennesker. Upassende aktivering av Hh signalveien er blitt rapportert i NSCLC [17, 18, 33, 34]. Tidligere studier har vist at EMT induksjon er forbundet med følsomhet for EGFR-TKI i lungekreft [35-37]. Pinnsvinet signalveien tett regulerer EMT induksjon gjennom nedstrøms målgener som sneglen, ZEB1, og TWIST2 [22]. Nedregulering eller tap av E-cadherin uttrykk er et kjennetegn på EMT i fosterutviklingen og kreft progresjon. Snegl uttrykk er inverst korrelert med E-cadherin i epitel-tumorcellelinjer [30, 31]. ABCG2 er en av de store multiresistens (MDR) pumper; Det er også en stamcelle markør og er nært forbundet med resistens mot flere legemidler [38, 39]. Den Hh signalveien regulerer direkte aktiviteten av ABCG2 [29]. Hh-antagonister kan hemme aktiviteten av ABCG2 og resensitize NSCLC-celler til å mitoksantron og topotekan
in vitro product: [40]. Hh og EGFR signale samvirkende regulere stamcelleproliferasjon i postnatal og voksen hjerne [23, 41]. Samtidig blokade av Hh og EGFR signalering hemmet spredning og apoptose, og forbedret den cytotoksiske effekten av docetaxel ved metastatisk prostata kreft celler [42]. Med dette som bakgrunn, hypotese vi at Hh signalveien kan bidra til EGFR-TKI motstand i NSCLC av feilregulert EMT og ABCG2 aktivitet.
For å klargjøre sammenhengen mellom Hh signalering og EGFR-TKI motstand, må vi først evalueres forskjeller i Hh signalanlegg mellom EGFR-TKI-sensitive og -resistente NSCLC celler. Resultatene viste at Hh signalveien ble avvikende aktivert, fulgt av induksjon av en EMT fenotype og ABCG2 overekspresjon, i EGFR-TKI-resistente celler, mens Hh reaksjonsveien ble stille i EGFR-TKI-følsomme celler. Forskjellen i Hh signale aktivitet mellom EGFR-TKI-sensitive og -resistente celler antydet at avvikende aktivering av Hh signalveien kan bidra til EGFR-TKI motstand ved å fremkalle en EMT fenotype og ABCG2 oppregulering. For å bekrefte disse funnene, ble Hh signale oppregulert ved hjelp av ytre SHH i EGFR-TKI-sensitive PC9 cellelinje. Oppregulering av Hh aktivitet resulterte i induksjon av EMT og heving av ABCG2 uttrykk. Hh signaliserer hyperaktivitet også resultert i EGFR-TKI toleranse i ellers EGFR-TKI-sensitive celler. Disse resultatene bekreftet at avvikende aktivering av Hh signale resultert i utviklingen av EGFR-TKI motstand i NSCLC-celler ved induksjon av EMT og ABCG2 overekspresjon. Hemming av Hh signalering av Hh inhibitor SANT-en forbedret E-cadherin uttrykk og downregulated Snail og ABCG2 uttrykk. Dette resultatet viser at blokade av Hh signale kan reversere EMT fenotype og kanskje redusere CSC overflod. En tidligere studie indikerte at gjenoppretting E-cadherin uttrykk økt følsomhet for EGFR-TKI
in vitro Hotell og
in vivo product: [38]. Basert på disse resultatene, hadde vi grunn til å tro at målretting Hh signalveien kan påvirke EGFR-TKI motstand hos NSCLC celler. Dermed vi neste behandlet EGFR-TKI-resistente celler med gefitinib eller SANT-en alene eller gefitinib pluss SANT-en. Resultatene viste at sammenlignet med enten gefitinib eller SANT-1 alene, er kombinasjonen av gefitinib pluss SANT-en i betydelig grad hemmet tumordannelse og celleviabilitet. Til sammen våre funn tyder assosiasjoner blant Hh signalering, EMT, ABCG2 overekspresjon, og EGFR-TKI motstand hos NSCLC celler for første gang.
Deregulering av Hh signalering bidrar til tumorigenesis eller akselererer tumorvekst i en Hh ligand -uavhengig eller -avhengig måte [43]. I de fleste basalcellekreft (BCC) og Medulloblastomas, tap-av-funksjon mutasjoner i ptch og få-av-funksjon mutasjoner i SMO både bly til ligand-uavhengig, mutasjon drevet aktivering av Hh pathway [44-46]. Denne type av tumor kan dra nytte av behandling med en enkelt Hh-inhibitor.
