Abstract
epigenetisk inaktivering av kromatin spiller en viktig rolle i å bestemme cellefenotyp i både normale celler og kreftceller, men vår kunnskap er fortsatt ufullstendig med hensyn til eventuelle monoallelic fenomenets natur. Vi har genotypet DNA isolert fra kromatin av to med kolorektal kreft-avledet linjer, og en kultur av normale humane intestinale epitelceller (HIEC), som ble immunoutfelt med antistoff til acetylert histon vs. metylert H3K9, og presenterte data B-allel frekvensforskjeller enn multiple enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) flytter vinduet gjennomsnitt. [B allelet er et vilkårlig begrep definert som en av de to alleler som til enhver SNP, kalt A og B]. Tre ulike valideringstester bekreftet at toppene utviser forskjeller representert monoallelic domener. Disse utfyllende tester bekreftet følgende: 1) gener i regionene i høy B-allelet frekvens forskjell ble uttrykt monoallelically; 2) i normale celler alle fem imprinting kontrollregioner som fraktet heterozygote SNPs ble preget av B allel forskjell topper; og 3) de haplotyper i B-allel differanse topper ble trofast opprettholdt i kromatin immunpresipitert med de respektive antistoffer. I begge prøvene fleste monoallelic domener ble funnet på grensene mellom regionene i åpen og lukket kromatin. Med hensyn til kreft linje, støtter denne den etablerte begrepet konformasjon spredning, men resultatene fra de normale cellene var uventet. Siden disse cellene var polyklonale ble monoallelic strukturer sannsynligvis ikke bestemmes av tilfeldig valg som skjer i X-inaktivering, så vi foreslår at epigenetisk inaktivering i enkelte områder kan være arvelig og polymorfe i normale humane celler
Citation.: di Paola D, Raelson J, Rampakakis E, Basik M, Zannis-Hadjopoulos M, Bradley WEC (2013) Monoallelic Chromatin Rase flankerer Long-Range Silenced domener i Cancer-avledet og normale celler. PLoS ONE 8 (5): e63190. doi: 10,1371 /journal.pone.0063190
Redaktør: Brian P. Chadwick, Florida State University, USA
mottatt: 15 februar 2013; Godkjent: 27 mars 2013; Publisert: May 16, 2013
Copyright: © 2013 Di Paola et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet med tilskudd fra Cancer Research Society og interne midler av Goodman Cancer Centre, McGill University. DDP var en mottaker av et fellesskap fra Fonds de Recherche en Santé du Québec. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. John Raelson var tidligere ansatt i Genizon Biosciences Inc., som ikke hadde noen innflytelse over det redaksjonelle innholdet av manuskriptet. Ingen av de andre forfatterne erklære noen konflikt. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
epigenetisk kontroll av genuttrykk er en viktig kilde til fenotypisk variasjon i kreft. På det kromosomale nivå, er denne styring manifestert ved endringer i kromatin konformasjon assosiert med histonmodifikasjonene, såsom metylering og /eller acetylering av lysinrester i N-terminale hale av histoner, og med metylering av C-rester i CpG-rikt øyer i eller i nærheten genet arrangører. Disse endringene har vært mye brukt som markører for å bestemme epigenetisk status på et gitt gen, og nylige fremskritt i genomet teknologi har tillatt vurdering av epigenetisk inaktive løpet megabase områder; det er nå antatt at disse endringene kan spre seg over lange strekninger [1]. Vår kunnskap på dette området er likevel ufullstendig av flere grunner: For det første, CpG island metylering bare gir detaljer om de enkelte gener som er forbundet med CpG øyer, og dette bare i tilfeller der genet inaktive genuint tilsvarer med metylering status. For det andre, selv om disse nyere studier har faktisk vist at det kan oppstå store epigenetiske forandringer, noen uttømmende genomanalyser som sammenligner normale og kreftfrem avledet celler er foretatt.
Et annet aspekt av dette fenomenet som har holdt seg relativt uutforsket er i hvilken grad epigenetisk inaktivering kan være begrenset til en allel. Innenfor normale celler, er allel-spesifikke genet inaktive kjent å forekomme på en rekke loci, inkludert gener innenfor trykt domener (der valget av hvilke allel inaktiveres er avhengig av den overordnede av opprinnelse), de fleste gener på en X-kromosom i kvinnelige celler, odorant-reseptorer, og ved et antall gener som er involvert i inflammasjon og immunresponsen (gjennomgått av [2]). Kontrollmekanismer for enkelte av disse inaktiveringshendelser ser ut til å endres i kreftceller, slik som, for eksempel, påtrykt loci er ofte biallelically uttrykt i kreft (oversikt i [3]). Imidlertid, i hvilken grad de novo monoallelic inaktivering forekommer i kreftceller er ukjent. Tidlig arbeid av oss [4], [5] og av andre personer [6] indikerte at i modellen pattedyrcellelinjen CHO, kan monoallelic inaktivering spredt over et megabase område slik at seleksjon mot ekspresjon av et enkelt allel på en locus resulterte i undertrykkelse av en allel ved en annen, koblet locus. En slik spredning ble vist å finne sted ved høy hyppighet, og ikke innebærer metylering av den promoter-assosierte CpG øy i minst en av de involverte gener [7]. Mer nylig, har vi vist at omtrent halvparten av tumorcellelinjer utvunnet hvori R R, et gen med tumorundertrykkende virkning, var fullstendig inaktivert, ble promotoren av bare én av de to alleler metylert [8], igjen tyder på en metylering-uavhengig inaktive mekanisme, som kan være monoallelic i naturen.
i denne studien brukte vi antisera mot histon H3 acetylert ved K9 /14 (H3Ac) og histon H3 tri-metylert ved K9 (H3M) i chip eksperimenter på to med kolorektal kreft-avledede linjer (HCT116 og Colo205) og en kultur av humane intestinale epitelceller (HIEC), som er ikke-immortalisert og polyklonale. Disse histone merkene er forbundet med åpen og lukket kromatin konformasjon, henholdsvis, og ble utvalgt blant flere er kjent for å være assosiert med konformasjon delvis fordi endringene er gjensidig eksklusive, og det kan være en større sjanse for at dataene vil være utvetydig. Dette forenklede også fastsettelse av alleliske skjevhet i konformasjon ved hver SNP vant til å genotype DNA hentet fra immunopresipitert kromatin, siden vi kunne beregne forskjellen i B allelfrekvenser fastsatt ved hver SNP av HAP550k mikromatriser. Ikke uventet ble lange «gen ørkener» funnet å være preget av strekninger av generelt lukket kromatin i både normale celler og kreftceller. Av interesse, fant vi at monoallelic konformasjon ble fortrinnsvis lokalisert på grensene for disse lange strekninger av lukkede kromatin konformasjon, noe som tyder på spredning av inaktive (eller aktive) konformasjon.
Diskusjon
Resultater og
Å generere langtrekkende bilder av kromatin konformasjon, fluorescensintensiteten verdier, uttrykt som LogR forhold, ble midlet over i bevegelse vinduer som omfatter 21 eller flere SNP’er, og plottet mot kromosomale posisjon. Som forventet, basert på data i UCSC epigenome leseren, ble genet fattig genomiske regioner preget av strekninger med lav LogR for anti-H3Ac-utfelt kromatin og tilsvarende høy LogR for anti-H3M. Dette er illustrert i fig. 1, som viser en 15 Mb domenet Chr5 huse færre enn 10 gener, hvorav fem er medlemmer av cadherin familien. I normale celler (og sjeldnere, i kreftcellelinjer) disse regionene ble vanligvis avbrutt av små øyene åpen konformasjon preget av toppene i anti-H3Ac tomten, speiles av trau av anti-H3M plot. Noen ganger, men ikke alltid, disse samsvarer med arrangører av de sjeldne gener i domenet (Fig. 1,
CDH18 Hotell og
CDH9
og uncharacterized genet fragment på 21,5 Mb, nedstrøms
CDH12
). Toppene i disse domenene ble ofte flatet i kreft-avledet linjer, og handlingen presentert i Fig. 1 antyder at det å flytte fra høyre grense kan ha skjedd slik at
CDH6
er i lukket kromatin i HCT116 cellene. Det er mulig at denne tilsynelatende forskyvning er i hvert fall noen ganger en del av prosessen for tumorprogresjon (se nedenfor).
opptegnede verdiene representerer de gjennomsnittlige avlesninger av en 21-SNP bevegelige vindu. HCT116, et tykktarmskreft-avledet cellelinje; HIEC, normale humane intestinale epitelceller. Gener (fra UCSC Genome Browser, hg18) er avbildet under LogR tomter.
De mønstre av LogR forholdstall for hele chr9 er vist i fig. 2, med UCSC Genome Browser «tett» fremvisning av gener i bunnen av hver graf segment. Igjen, gen-fattig domener (for eksempel de som er sentrert rundt 10 Mb, 82 Mb, 105 Mb) kjennetegnes ved lave LogR verdier av anti-H3Ac avbrutt av lokaliserte topper som er tidvis flate i kreftlinjene (H3M data er ikke inkludert i hoveddelen av figuren for enkelhets skyld). I innfelt av fig. 2 vises en topp i Chr9 for alle de tre anti-acetylerte chip prøver med en medfølgende trau for alle de tre anti-denaturert chips, i tråd med vår forventning om speilbilder i de LogR plott av de to immunoutfelt prøvene. Det er bare ett gen i regionen, C9orf123, hvis 5’end er meget nær til den respektive topp og trau.
Data ble behandlet som beskrevet i forklaringen til fig. 1. Innsatt, området mellom 7,7 Mb og 7,9 Mb, som viser de toppene av brikken ved hjelp av anti-acetylert antiserum sammenlignet med trauene i brikken ved hjelp av anti-metylert serum, samtidig med promoter-regionen i C9orf123. LogR plott av anti-metylert ChIP er utelatt fra hoved tall for klarhet.
Vi deretter bestemmes mønstrene av allel skjevhet i kromatin konformasjon for de to nesten-diploide celleprøver (HCT116 og HIEC), uttrykt som B-allelet frekvens (BAF) forskjell mellom de to chip prøver i gjennomsnitt over 11-markør flytte vinduer (se Methods). Vi fant mer enn 60 topper over vårt konservative cut-off på 0,35 (se tekst i File S1) som strakte seg for så mye som 10 Mb på en strekning i kreft-avledet linjen HCT116. Om lag 35 slike topper ble observert i HIEC cellene, det bredeste dekker et område på ca 400 kb (bredden på topp på en halv høyde, se figur 3 for oversikt over flere kromosomer.)
Som beskrevet. i teksten, for hver heterozygote SNP absolutte verdier for BAF forskjeller mellom de to chip prøver ble beregnet og 11-markør bevegelige vindus gjennomsnitt på tvers av hvert kromosom ble plottet. Blå, HCT116; koraller, HIEC. Gener (UCSC Genome Browser) er avbildet under LogR tomter.
For å validere disse dataene vi har utført både strukturelle og funksjonelle tester (detaljer i Methods). Først over lengden av en BAF forskjell topp en relativt lukket konformasjon bør strekke seg sammenhengende på en homolog og en åpen konformasjon på den andre. Dette ble vist å være tilfelle i løpet av kjøringer av SNP’er i høy koblingsulikevekt (LD), som vi har funnet perfekt samsvar mellom haplotype fase og sekvensen av alleler anriket i de respektive chip prøver (binomial p = 1,4 x 10
-45 for HCT116, 5,8 × 10
-11 for HIEC; dataene i figur S1 og S2 i File S1).. For det andre har vi funnet at sju av sju gener bosatt i toppene av BAF forskjellen ble monoallelically uttrykt (fig. S3 i File S1). For det tredje viste vi at fem toppene av BAF forskjell i HIEC, herunder hovedtopp ved 22,9 Mb av kromosom 15 (fig. 3), samsvarer nøyaktig med pregekontrollregioner (ICRS), den korte monoallelically metylert sekvenser DNA som direkte imprinting (annet data ikke vist). (Andre ICRS vi spørres var homozygot i HIEC). Totalt sett de tre testene vi har utført gjør en overbevisende sak som BAF forskjellene gjenspeiler de autentiske alleliske forskjellene i konformasjonsendring strukturen i kromatin.
Når LogR forholdstall og BAF forskjeller i HCT116 cellene ble plottet sammen to generelle mønstre ble observert (se fig. 4, som viser åtte av toppene på kromosom 18, nummerert fra i-VIII). Som forventet, noen BAF forskjellen topper korresponderte tett med isolerte topper og /eller trau av de respektive chip prøver. De 35 Mb og 57 Mb (topper III og VIII) faller i denne kategorien, sammen med om lag en fjerdedel av resten av disse toppene i hele genomet. Så mange som to tredjedeler av toppene, men skjedde på grensene mellom lave og høye LogR verdier, det vil si mellom domener av åpne og lukkede kromatin konformasjon. Peaks I, II, V – VII og kanskje IV er i denne kategorien (figur 4, den siste er mindre sikker på grunn av uninformative homozygosity skrev toppen.). I de fleste tilfeller LogR og BAF differanseplottene var nesten superimposable over nærmeste regionen av interesse, noe som indikerer at avvik mellom lene begynte på samme punkt som i begynnelsen av overgangen fra en konformasjon til den andre. Intriguingly, grenser sammenfallende med BAF forskjellen toppene var vanligvis de for hvilke en relativ forskyvning ble sett i LogR forhold, som er sett for toppene I, VI og VII (den siste er mindre, men ekte, med en forskyvning på 100 kb). Grensen på topp II kan også betraktes som forskyves, ved en lengre avstand på omtrent 2 Mb.
Øvre panel, BAF forskjeller over det hele av kromosom 18 for HCT116. Lavere paneler, tomt på HCT BAF forskjell (Red, høyre akse) oppå tomter HCT og HIEC, LogR forholdstall (venstre akse) over kromosom 18 domener angitt i øvre panel
. Vi tolker dette som at enten åpne eller lukkede domener har spredd seg på disse grensene, og at spredningen var enten monoallelic eller inntraff i ulik grad på de to homologer, og dermed generere et domene av monoallelic kromatin konformasjon. Alternative forklaringer er mulig, men vi favorisere spre scenario delvis fordi det virker enkelt å se for seg en slik mekanisme, som noen presedens eksisterer i pattedyrceller i form av X-inaktive sprer seg autosomal kromatin på fusion interessante X-autosome trans [9].
Vi utførte også de samme analysene med data fra HIEC celler. X-kromosomet ga ingen BAF forskjeller over bakgrunnsstøyen (data ikke vist), selv om H3K9 acetylering /metylering er involvert i X-inaktivering [10]. Dette er som forventet for tilfeldig inaktivering, med tanke på at HIEC celler er polyklonale, og det resultat bekreftet at tilfeldige inaktiveringshendelser som ikke skal forveksle våre resultater. Blant de autosomer, dømmes vi 13/32 BAF forskjell topper som tilsvarer isolerte LogR forhold topper /bunner av H3Ac /H3M chip prøver. Men resten, som består av et flertall av BAF differanse toppene sammenfalt med grenser mellom åpen og lukket kromatin konformasjon (eksemplene som er vist for kromosom 22 i fig. 5 med topp II være i den førstnevnte kategori og de andre som viser monoallelic grense forskyvningseffekter). Dette var et uventet resultat, som vi likevel anser for å være ekte, gitt rigor av vår valideringsprosessen. Vår tolkning av denne effekten er som beskrevet ovenfor, nemlig at ved grensene for åpen /lukket kromatin konformasjon, en viss grad av monoallelic spredning av konformasjon kan forekomme.
Øvre panel, BAF forskjeller over hele kromosom 22 for HIEC . Lavere paneler, HIEC BAF forskjell tomten (Red, høyre akse) oppå HCT og HIEC, LogR ratios plott (venstre akse) over kromosom 22 domener angitt i øverste panel
I hvilken. kan vi tilskrive denne åpen spredning? Den polyklonale natur HIEC tillater oss å utelukke noen muligheter. For det første er det usannsynlig å være på grunn av den samme mekanisme som den utstrakte monoallelic ekspresjon er beskrevet av Gimelbrant et al. [11], siden sistnevnte ble vist å være tilfeldig. Vi kan på samme måte utelukke at toppene reflektere en forstadier tilstand, som er sett med metylering av tumorsuppressorgener i normalt vev av kreftpasienter, ettersom dette vil også være tilfeldig med hensyn til valg av allel. I alle tilfeller, de HIEC cellene er føtal opprinnelse og ikke immortalisert [12], og ville derfor ikke forventes å ha noen forstadier egenskaper. En annen tolkning, som imidlertid ikke er sterkt støttet av dataene, er at disse toppene BAF forskjell er tidligere ukjente trykt domener. Nyere bevis fra genom-wide søk tyder på at de fleste ekte trykt domener er nå kjent, så gitt deres antall (ca. 20) og deres tilstedeværelse på åpen-lukket kromatin grenser (i motsetning til imprinting-forbundet topper som vi gjenkjenner) dette virker usannsynlig, selv om dette problemet ikke kan være entydig adressert ved hjelp av vårt eksperimentell design. En tolkning vi anser for å være i samsvar med data er at alleliske forskjellene oppdaget reflektere konstitusjonelle epigenetiske forandringer, dvs. at monoallelic toppene vil være til stede i alle vev i vedkommende. Slike fenomener er blitt beskrevet for et begrenset antall av tumorsuppressorgener, inkludert
MGMT product: [13], ved at disse genene har blitt funnet å avstilles i normale somatiske celler, og antas å resultere i en kreft disponerende fenotype. Det er forslag i litteraturen at disse «konstitusjonelle epimutations» kan være genetisk opprinnelse [14], [15]. Andre grupper er utført på genomassosiasjons studier av allelisk uttrykk [16], og har funnet mange SNP’er å være forbundet med ekspresjonsnivåer. I alle disse tilfeller er monoallelic virkning er begrenset til en genetisk komponent, slik som en SNP eller promotoren av et enkelt gen. Det var ingen spesiell tilknytning i disse studiene av monoallelic uttrykk med kromatin konformasjon eller med nærhet til genet ørkener, så det er fortsatt uvisst om de monoallelic uttrykk mønstre disse forfatterne beskriver kan overlappe med de som vi beskriver.
Vår studie bryter ny mark i to henseender. Først, lokaliserer det en betydelig kilde til monoallelic kromatinstruktur til områder i umiddelbar nærhet av domenene til lukket kromatin konformasjon. Som sådan, indikerer det en mekanisme for denne epigenetisk polymorfisme, som kan ligne en kontrollert versjon av den spredning som vi og andre foreslår å være en betydelig kilde til fenotypisk variasjon i kreft. For det andre, hvis vår tolkning er korrekt, reiser det utsiktene til en genetisk komponent til denne kilden til epigenetisk variasjon. Det er kjent at imprinting på
IGF2R
nettstedet på chr6q er polymorfe, og kanskje noen elementer av arve epigenetisk kontroll av kromatin konformasjon kan eksistere, som manifesterer seg som domenene til monoallelic bekreftelse på at vi har dokumentert. En uforklarlig fenomen, som kan ha sammenheng er transgenerational arv [17], hvor genetiske faktorer påvirker fenotypen i påfølgende generasjoner uten gener direkte bestemmer at fenotype blir arvet. I alle fall kan de nye aspekter av våre resultater føre til en dypere forståelse av arv, og vi undersøker disse effektene ytterligere.
Metoder
Cells
HIEC- 6 er polyklonale ikke-immortaliserte intestinale epitelceller dyrket fra en kvinnelig 20-ukers embryo. De var velvillig møblert ved passering 17 av Jean-François Beaulieu, og ble dyrket ifølge publiserte metoder [12]. Forsøkene ble utført innen 6 passasjer av resepsjonen i vårt laboratorium. HCT116 og Colo205 er kolorektal kreft cellelinjer utvunnet opprinnelig hentet fra ATCC, og dyrket i RPMI som tidligere beskrevet.
Chromatin Immunpresipitasjon (chip)
Prosedyren fulgte ble det beskrevet av [18] . -Celler dyrket i komplett medium ble vasket med forvarmet PBS og behandlet med 1% formaldehyd i 10 minutter for å kryssbinde proteiner og DNA
in vivo
; de ble deretter vasket og skrapet i iskald PBS og resuspendert i lyseringsbuffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 140 mM NaCl, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA) supplert med en komplett proteasehemmer tablett (Roche Molecular Biochemicals). Etter passasje gjennom en 21 G nål tre ganger, ble de kjerner høstet, resuspendert i en pakket atom volum av lyseringsbuffer, og sonikert inntil DNA-fragmenter med mindre enn 1 kb ble oppnådd. Kromatin størrelse ble overvåket ved elektroforese. Immunoutfelling (IP) ble utført som beskrevet tidligere, med følgende modifikasjoner: I korthet ble skåret kromatin lysater (500 ug) ble forhånds fjernet ved inkubering med 50 pl protein A /G-agarose (Roche Molecular Biochemicals) for å redusere bakgrunn forårsaket av ikke-spesifikk adsorpsjon til kulene, ble inkubert i 6 timer med enten 20 ug anti-acetylert H3K9 /14 (Upstate), anti-trimetylert H3K9 (Upstate) eller normalt kaninserum (NRS) ved 4 ° C med konstant rotasjon. Protein A /G-agarose (50 ul) ble tilsatt og inkubert over natten ved 4 ° C. Den pelleterte kuler ble vasket suksessivt to ganger med 1 ml lyseringsbuffer i 15 minutter hver ved 4 ° C, etterfulgt av 1 ml av WB1 (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 500 mM NaCl, 0,1% NP40, 0,05% natrium-deoksycholat, fullstendig protease inhibitor tablett), 1 ml WB2 (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1% NP40, 0,05% natrium-deoksycholat, fullstendig protease inhibitor tablett) og 1 ml steril TE. Kulene ble resuspendert i 200 ul TE /1% SDS, inkubert ved romtemperatur (rt) i 15 min og sentrifugert ved 3000 r.p.m. i 1 min ved romtemperatur. Halvparten av supernatanten ble deretter inkubert over natten ved 65 ° C for å reversere kryssbindinger, etterfulgt av 100 ug av proteinase K ved 55 ° C i 2 timer. DNA ble renset ved hjelp QIAquick PCR rensing kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) og eluert i 100 ul TE.
Genotyping
DNA fra HIEC og HCT116 ble genotypet på Illumina HAP550 mikromatriser ved genotyping tjeneste Genizon Biosciences Inc., i henhold til produsentens instruksjoner, og som har blitt beskrevet [19]. DNA fra Colo205 ble genotypet på en M duoen array, i henhold til produsentens instruksjoner. Å gjøre rede for forskjellen i microarray produksjon, multiplisert vi LogR prosenter fra en M matrise med 2,0 for presentasjon med disse tomter generert fra HAP550 array. Dette tillot presentasjon av tomter med tilsvarende amplitude. Microarray data er deponert i Dryad. (Doi: 10,5061 /dryad.43h8c)
Beregne B allelfrekvens Forskjeller
Vi plottet B-allelet frekvens (BAF) forskjeller mot kromosom posisjon, presentere data på to måter. Først beregnes vi avviket fra BAF av kontroll kromatin fremstilling utfelt med normalt kaninserum til hver av de to immunoutfelt prøvene. Forskjellen mellom disse verdiene ble beregnet ved hver SNP, ble den absolutte verdi utledet og 11-markør bevegelige vindusgjennomsnittsverdier ble plottet vs. kromosomale posisjon. For det andre, for hver SNP vi ganske enkelt trekkes BAF for H3Ac prøven fra at for H3M prøven (normalisert) og de absolutte verdier av disse forskjellene ble fordelt på 11-markør bevegelige vinduer som ovenfor og plottet vs. stilling. Det var i alt vesentlig ingen forskjell mellom de to metodene for beregning, og vi presenterer bare data som er avledet av den andre av de to metodene. Tre tester ble utført for å validere resultatene, som beskrevet i neste avsnitt.
Validering av BAF Difference Peaks som representerer Allelic Bias
For å validere disse dataene vi har utført både strukturelle og funksjonelle tester. Først, hvis topper på BAF forskjell nødvendigvis den faktiske konformasjonell allelisk forspenningen, og deretter en åpen konformasjon bør strekke seg over hele lengden av BAF forskjell på en homolog og lukkede konformasjon på den andre. Således bør mønstre av BAF forskjeller i de respektive chip prøver vises som haplotyper i den ene eller den annen homolog. Vi fant mønstrene for å være helt konsekvent (binomisk p = 1,4 × 10
-45 for HCT116, 5,8 × 10
-11 for HIEC; data for flere LD blokker innenfor to topper er gitt i File S1, fig 2 , fig. 3). Den andre valideringstest var basert på den forventning om at innenfor en topp på BAF forskjell, bare ett av allelene utføres et gen i åpen konformasjon, slik at uttrykket mønster av dette gen bør ha en tendens til å være monoallelic. Prøver av cDNA av syv gener i disse regionene som bæres heterozygote cSNPs ble analysert og funnet å ha vesentlig eller fullstendig berikelse for en allel (Fil S1, fig. S3). Den tredje testen var basert på en forventning om at i det minste noen av BAF forskjellen toppene i HIEC cellene skal tilsvare kjente domener av monoallelic uttrykk i normale celler. Siden HIEC er polyklonale, bør vi ikke påvise noen allel skjevhet på X-kromosomet eller på annen loci lagt tilfeldig allel inaktivering (File S1); men i trykt domener, allel inaktive er ikke tilfeldig, men foreldre-spesifikke, slik at alle cellene i en polyklonale befolkning bør bære imprinting merket på samme allel. Følgelig har vi funnet fem av de HIEC BAF forskjellen topper, herunder hovedtopp ved 22,9 Mb i kromosom 15 (fig. 3), samsvarer nøyaktig med ICRS (Fil S1). Alle de andre ICRS vi spørres, herunder at kontrollere H19 klyngen, er homozygot i HIEC og derfor umulig å oppdage.
Hjelpemiddel Informasjon
Fil S1.
Støtte tekst og figurer S1, S2 og S3. Figur S1. Validering at BAF forskjell topper reflektere sammenhengende domener i HCT116. Vi antok at dersom BAF forskjeller representert autentiske forskjeller mellom de to homologer, idet materialet immunoprecitated ved hjelp av anti-Me bør i hovedsak være avledet fra en homolog, og som ved hjelp av anti-Ac hovedsakelig fra den andre gjennom hele lengden av høy LD. To regioner under lange toppen av BAF forskjell på chr1 (øvre panel) ble funnet som HapMap data viste svært høy LD (r
2 mer enn 0,9 i hele). Den største allel Frekvensen ble plottet for anti-Ac (blå) og anti-Me (korall) for hver SNP innenfor den identifiserte kjøring av høy LD. For hver SNP, anti-Ac ChIP ga en høyere BAF enn anti-Me chip, noe som indikerer perfekt samsvar mellom haplotype og immunopresipitert materiale. Figur S2. Validering at BAF forskjell topper reflektere sammenhengende domener i HIEC. Se legende til figur S1. Tre regioner med høy LD på chr7 vises. Igjen perfekt samsvar ble observert mellom haplotype og immunopresipitert materiale. Figur S3. Validering at BAF forskjell topper representerer domener av monoallelic uttrykk ved SPRY2 (på 80,1 Mb, chr13). Genomisk DNA og cDNA rundt rs504122 (C /T heterozygot i både HCT116 og HIEC) ble amplifisert fra begge linjer og sekvensert. Øvre panelene, er begge alleler uttrykt i HIEC, bare C i HCT116. Nedre panel, BAF forskjeller plottet for begge cellelinjer, viser HCT116, men ikke HIEC, med BAF forskjeller
doi:. 10,1371 /journal.pone.0063190.s001 plakater (DOC)
Takk
forfatterne takker Dr. Jean-François Beaulieu for å gi HIEC kulturer og Dr. Patrick Dion for redaksjonell bistand.
