Abstract
Deregulering av den ikke-reseptor tyrosin kinase ETK /BMX har blitt rapportert i flere solide tumorer. I denne rapporten viste vi at ETK uttrykket gradvis økt i løpet av blærekreft progresjon. Vi fant at nedregulering av ETK i blærecancerceller svekkede STAT3 og AKT-aktivitet, mens eksogen overekspresjon av ETK hadde motsatt effekt, noe som tyder på at deregulering av ETK kan tilskrive den forhøyede aktivitet av STAT3 og AKT ofte påvises i blærekreft. Overlevelse, migrasjon og invasjon av blærekreft celler ble betydelig svekket da ETK uttrykk ble slått ned av en bestemt shRNA. I tillegg viste vi at ETK lokaliserer til mitokondriene i blæren kreftceller gjennom samspill med BCL-XL og regulere ROS produksjon og narkotika følsomhet. Derfor kan ETK spille en viktig rolle i å regulere overlevelse, migrering og invasjon ved modulering av flere signalveier i blærecancerceller. Immunhistokjemi analyse på microarray som inneholder 619 mennesker blære vevsprøver viser at ETK er betydelig oppregulert i løpet av blærekreft utvikling og progresjon og ETK uttrykk nivå spår overlevelsen av pasienter med cystektomi. Til sammen våre resultater tyder på at ETK kan potensielt tjene som et nytt legemiddel mål for blærekreft behandling samt en biomarkør som kan brukes til å identifisere pasienter med høyere dødelighet risiko, som kan bli dratt nytte av terapi rettet mot ETK aktivitet.
Citation: Guo S, Sun F, Guo Z, Li W, Alfano A, Chen H, et al. (2011) Tyrosin kinase ETK /BMX Er oppregulert i blærekreft og Spår dårlig prognose hos pasienter med Cystektomi. PLoS ONE 6 (3): e17778. doi: 10,1371 /journal.pone.0017778
Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania, USA
mottatt: 20 januar 2011; Godkjent: 09.02.2011; Publisert: 07.03.2011
Copyright: © 2011 Guo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NIH (CA106504) og DOD (W81XWH-08-1-0174) tilskudd til YQ, China National Natural Science Foundation (30872584) og Guangdong Natural Science Foundation (8251008901000018) til SQ Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blærekreft er en av de vanligste kreftformene i USA. Det er anslått at det vil være 70,530 nye tilfeller og 14,680 dødsfall på grunn av blærekreft i 2010 [1], [2], [3]. Flere genetiske og epigenetiske faktorer antas å bidra til risikoen for å utvikle blærekreft. I tillegg til kjente risikofaktorer som aldring, kjønn, eksponering for sigarettrøyk og industrielle kjemikalier, flere genetiske skader som gir signaler for celletransformasjon, spredning, migrasjon og invasjon i blærekreft har blitt identifisert [4]. Disse inkluderer mutasjoner eller endringer i uttrykket av p53, pRb, E-cadherin, COX2, BLCA-4, CXCL1, MMP-2/9 og EGFR [5]. Akkumulert økning i disse genetiske defekter gir også prognostisk vurdering for sykdom utfallet. Imidlertid er ytterligere forståelse av blæretumorbiologi nødvendig å utvikle mer effektive terapi. Det er således et behov for identifisering og anvendelse av nye terapeutiske mål i blærekreft.
epithelial og endotel-tyrosin-kinase (ETK), også kjent som Bone Marrow X kinase (BMX), er et medlem av familien Tec ikke-reseptor-tyrosin-kinase. ETK inneholder en NH2-terminal Pleckstrin homologi domene, et Src-homologi 3-domene, et Src-homologi 2 domene, og et COOH-terminalt tyrosinkinasedomene [6]. ETK kan aktiveres av flere ekstracellulære stimuli, inkludert vekstfaktorer, cytokiner, ekstracellulære matriks og hormoner [7]. ETK protein er til stede i cytoplasma med sterk perinukleært farge i celler ved undersøkelse ved hjelp av immunfluorescens-mikroskopi [8], [9], [10]. Aktivering av ETK kinase-aktivitet kan oppnås ved samvirke av dens pleckstrin homologi domene enten med fosfatidylinositol 3-kinase-produktet fosfatidylinositol-3,4,5-trifosfat eller FERM domene av FAK, noe som fører til plasmamembrantranslokasjon av ETK [6], [8]. ETK har vist seg å spille en rolle i forskjellige cellulære prosesser, inkludert celleproliferasjon, transformasjon, differensiering, migrasjon og metastasering. ETK kan samhandle med FAK og p130
Cas å regulere aktin cytoskjelettet og cellemotilitet [8], [11]. Det har også blitt vist at ETK vekselvirker direkte med tumor undertrykker p53 og hemme dets atomtranslokasjon, og dermed fremme chemoresistance i kreftceller [9]. Vi har tidligere vist at ETK progressivt oppregulert i løpet av menneskelig utvikling prostatakreft og progresjon [12], [13]. Imidlertid gjen rolle ETK i blæren kreftceller ukjent.
I denne rapporten viste vi at ETK uttrykket gradvis økt i løpet av blærekreft progresjon. ETK spiller en viktig rolle i å regulere overlevelse, migrering og invasjon ved modulering av flere signalveier i blærecancerceller. Vi viste videre at ETK ligger også i mitokondriene gjennom direkte samspill med BCL-XL og regulere ROS produksjon i respons på behandling av cellegifter. Videre ETK uttrykk positivt korrelerer svulst klasse og spår pasientenes prognose. Våre data tyder på at ETK kan potensielt tjene som et rusmiddel mål og prognostisk markør for blærekreft.
Resultater
Funksjonell ETK er overuttrykt i blærekreft
Vi undersøkte ETK uttrykk i et panel av humane blærecancercellelinjer, og fant at ETK ekspresjonsnivået ble variert i disse cellene. Interessant nok var et signifikant høyere nivå av ETK protein påvist i UM-UC-3 og T24-celler som er avledet fra høyverdig og invasive blæretumorer (Fig. 1A). Vi undersøkte om ETK er funksjonell i disse invasive celler. Vi testet først om vekstfaktor kan aktivere ETK kinase aktivitet ved hjelp av fosforylering av tyrosin 40 (Y40), en autofosforylerings nettstedet ved ETK på sin aktivering [8], som avlesning. Som vist på fig. 1B, EGF induserte behandlingen Y40 fosforylering, noe som tyder på at ETK er aktiv i blærecancerceller. I samsvar med tidligere studier viste at ETK er oppstrøms STAT3 og AKT trasé [15], [16], vi fant fosforylering nivå av både STAT3 og AKT ble utsatt når ETK uttrykk ble slått ned av en bestemt shRNA (Fig. 1C, Venstre ). Motsatt, når vi overexpressed ETK i 5637 celler med et relativt lavere nivå av endogene ETK, vi har oppdaget en økt aktivitet av både STAT3 og AKT (Fig. 1C, Høyre). Disse dataene sammen indikerte at ETK er sterkt uttrykt i invasiv blærekreft cellelinjer og involvert i regulering STAT3 og AKT aktivitet.
A, Expression profil ETK i blæren kreft cellelinjer. ETK uttrykk nivå i totale cellelysater fra blærekreftcellelinjer ble undersøkt ved immunblotting med anti-ETK. Tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. B, Aktivering av ETK i blærecancerceller behandlet med EGF. UM-UC-3 og T24-celler ble serum-sultet i 24 timer, deretter behandlet med 20 ng /ml EGF i 15 eller 30 min. Nivået av aktivert EGFR og ETK ble overvåket ved immunoblotting med henholdsvis anti-pEGFR (Y1175) og anti-pETK (Y40). Nivået av total EGFR og ETK i cellelysatene ble også detektert med anti-EGFR og anti-ETK respektivt. C Regulering av STAT3 og AKT aktivitet ved ETK i blæren kreftceller. UM-UC-3 og T24 celler ble infisert med lentivirus koding av shRNA spesifikt for ETK eller en vektor kontroll. Ved 24 timer etter infeksjon, ble cellene i serum sultet over natten og deretter lysert. Nivået på aktive STAT3 og AKT ble undersøkt ved immunblotting med anti-pSTAT3 (Y705) og henholdsvis anti-Pakt (S473) (Venstre panel). Effekten av ETK overekspresjon på STAT3 og AKT aktivitet ble også undersøkt i blærekreft 5637 celler (Høyre panel).
ETK er til stede i mitokondriene og forbundet med BCL-XL
Når vi undersøkte cellulær lokalisering av ETK i blæren kreftceller, observerte vi en puncate fordeling av ETK i cytoplasma. Interessant nok ETK farging ble delvis overlappet med Mitotracker merking i disse cellene (fig. 2A). Vi har også oppdaget at en betydelig mengde protein ETK i mitokondrie fraksjonen, sammen med andre kjente proteiner mitokondrielle Bcl-XL og VDAC (Fig. 2B). Som ETK mangler mitokondrier rettet mot signal, vi lurte på om det kunne lokalisere til mitokondriene gjennom et protein-protein interaksjon. Som vist på fig. 2C, endogen BCL-XL ble utfelles med ETK i begge blærekreft cellelinjer undersøkt. Lignende resultater ble også oppnådd i 293T celler som overuttrykker både T7-merket ETK og GFP-merket BCL-XL. Disse data antydet at ETK kan danne et kompleks med BCL-XL og lokalisere til mitokondriene. På grunn av BCL-XL anti-apoptotiske funksjon, undersøkte vi rolle ETK i å regulere apoptose i disse celler. Som vist på fig. 3A, knock-down av ETK uttrykk av en bestemt shRNA økt antall apoptotiske celler i UM-UC-3 og T24 celler betydelig. I tillegg inhibering av ETK aktivitet forbedret ROS produksjon og cytotoksisitet i blærecancerceller som respons på behandling av Doxorubucin, mens overekspresjon av ETK hadde en beskyttende effekt (Fig 3B T24 celler, 2,5 ug /ml) i 20 timer og deretter inkubert med 10 nM 5 (6) -CDCFDA i 30 minutter. ROS-positive celler ble tellet under fluorescens mikroskopi. Resultatene ble uttrykt som prosentdel av kontrollen. C, regulerer ETK cytotoksisitet i blærecancerceller i respons til DOX behandling. Celler ble infisert som beskrevet i B og behandlet med DOX (T24, 5 ug /ml; UM-UC-3, 0,5 ug /ml) i 48 timer. Celleviabilitet ble vurdert av WST-1-analyser (Top panel). Nivået av ETK ekspresjon ble målt ved immunblotting med anti-ETK (Bunnplate). *, P 0,05 sammenlignet med kontroll; **, P 0,01 sammenlignet med kontrollgruppen. D, knockdown av ETK hemmet migrasjon og invasjon in vitro. Celle migrering og invasjon assay ble beskrevet som metoder. Resultatene ble uttrykt som prosentdel av kontrollen. *, P 0,05 sammenlignet med kontroll; **, P. 0,01 sammenlignet med kontrollgruppen
ETK er oppregulert i human blærekreft vev og spådd pasient overlevelse
For å undersøke ETK uttrykk i menneskelige blære tumorvev, vi utførte immunhistokjemi analyser på menneskelig blære microarray som inneholder 619 vevsprøver fra 233 pasienter. ETK flekker viste seg å være både cytoplasmisk og kjerne positive (fig. 4A), og ETK ekspresjon ble betydelig økt i urinblæren tumorvev sammenlignet med sine motparter godartede (Tabell 1). I tillegg ETK uttrykk nivået var signifikant høyere i invasive T1-T4 svulster enn i ikke-invasive Tis /Ta kolleger (p 0,001); imidlertid, ble ETK uttrykk ikke signifikant forskjellig innenfor T1 til T4-tumorer (data ikke vist). I tillegg økte ETK uttrykk med svulst klasse (p 0,001). ETK uttrykk i CIS var et unntak, med en gjennomsnittlig 12% i cytoplasma, som er lavere enn G1-G3 score (tabell 1), som tyder på en sammenslutning av ETK overepression med blære papillærtumorer. For å vurdere om ETK kan brukes som en potensiell prognostisk markør, ble klinisk utfall analyse utført på 118 pasienter gjennomgikk cystektomi som ble fulgt opp i en median på 92,3 måneder. Vi identifiserte en cutoff poeng på 15% for optimal substratification av disse pasientene ifølge ETK cytoplasma uttrykk. Det var 75 tumorer (64%) med lav ekspresjon (≤15%) og 43 tumorer (36%) med høy ekspresjon ( 15%). Kaplan-Meier analyse indikerte at pasienter som hadde høyere cytoplasma farging av ETK (flekker poengsum 15%) hadde dårligere total overlevelse sannsynlighet (figur 4B, log-rank test p = 0,0028.). Videre multivariabel Cox regresjonsanalyse viste at ETK er en signifikant prediktor for overlevelse etter justering for andre viktige clinicopathological variabler som alder, tumor klasse, scene og positiv lymfeknute status (tabell 2). Som antydet i modellen, ETK var den eneste uavhengige prognostisk indikator for total overlevelse med hazard ratio på 1,7 (95% KI: 01.01 til 02.07, p = 0,0159). Samlet utgjør disse dataene viste at ETK uttrykk økes i blærekreft og assosiert med tumorprogresjon og dårlig prognose.
A, De representative områder av menneskelig blærekreft TMA farget med anti-ETK antistoff. B, Kaplan-Meier analyse på sammenslutning av ETK cytoplasma farging med overlevelse av pasienter med cystektomi.
Diskusjoner
Overuttrykte ETK har blitt rapportert i flere kreftformer, inkludert prostata, bryst og lunge-kreft [8], [13], [17], [18]. Dette er den første rapport om deregulering av ETK ekspresjon i blærekreft. Vanlige forhøyet ETK uttrykk i blæren kreftceller antydet at ETK kan spille en kausal rolle i sykdomsutvikling og progresjon. Dette ble støttet av vår observasjon at ETK aktivitet kan bli stimulert av EGF, som tidligere var vist å indusere vekst og forbedre invasjon av blærecancerceller ved regulering av AKT-aktivitet [19], [20]. EGF-reseptoren har blitt rapportert sterkt uttrykt i blærecancerceller og er forbundet med progresjon av kreft og dårlig prognose i pasienter [21], [22], [23]. Derfor kan ETK sannsynligvis virke som en nedstrøms effektor av EGF /EGFR for å fremme blæretumorvekst og metastase. Det har vist seg at ETK overekspresjon kan øke spredning i mus prostata epitel og resultere i utvikling av prostata intraepitelial neoplasi (PIN) delvis ved å øke AKT og STAT3 aktivitet [13]. Vi fant at nedregulering av ETK i blærecancerceller svekkede STAT3 og AKT-aktivitet, mens eksogen overekspresjon av ETK hadde motsatt effekt. Deregulering av STAT3 og PI3K /AKT veier er blitt vist å spille en viktig rolle i utviklingen av urothelial karsinom og korrelerer med tumorprogresjon [24], [25]. Det er mulig at ETK kan utøve sin rolle i blærekreft gjennom å regulere disse banene. Tumormetastaser er avhengig av evnen til tumorceller å invadere normale vev. Vi viste at blæren kreftceller kan effektivt invadere en matrise barriere in vitro, og denne evnen ble markert oppsagt da ETK uttrykk ble slått ned av en bestemt shRNA. Knockdown ETK fører til redusert aktivering av STAT3, som spiller en rolle i blærekreft invasjon, delvis forklart mulig mekanisme for invasjon inhibering. Effekten av ETK på celle migrasjon kan forklares basert på den etablerte rolle ETK i celle migrasjon i prostata og brystkreft celler gjennom FAK-mediert intesignale [8].
I tillegg til Stat3 og AKT trasé som er kjent for å bli aktivert av ETK viste vi også, for første gang, at ETK lokaliserer til mitokondriene i blærecancerceller og derved regulerer ROS produksjon og medikamentsensitivitet. Andre tyrosinkinaser inkludert Src og EGFR, har vist seg å være til stede i mitokondriene. Salvi
et al
rapportert at Src ligger i mitokondriene i rottehjerne [26]. EGFR og Src kan translocate til mitokondriene ved å binde subenheten av mitokondriell cytokrom coxidase (Coxα) i et EGF-avhengig måte og modulere mitokondriefunksjon gjennom å fosforylere Coxα [27]. Men den nøyaktige funksjonen til ETK i mitokondriene har ennå ikke etablert. Vi fant at ETK er forbundet med en Bcl-2-familiemedlem Bcl-XL i blærecancerceller. Knockdown av ETK uttrykk fører til en økning av ROS produksjon og sensibilisering av blære Caner celle til cellegifter. Det er blitt vist at DNA-skade, bestråling og hypoksi kan indusere ROS i kreftceller [28], [29]. Vi har tidligere vist at ETK kan gi resistens i prostatakreftceller ved å samhandle med p53 og hemme sitt atom transduksjon funksjon. Det er mulig at ETK kan også fremme medikamentresistens gjennom sin beskyttende effekt på mitokondriefunksjonen. Våre resultater er derfor vist at ETK gir en ondartet og invasiv fenotype til blæren kreftceller gjennom regulering av flere signalveier (Fig. 5).
Det er vist at STAT3 aktivitet og uttrykk er økt i blærekreft svulst og spår tumorresidiv og pasient overlevelse [30], [31]. Vår IHC analyse på blærekreft TMA viste at ETK uttrykk økes i blærekreft vev sammenlignet med sine godartede kolleger. Tatt i betraktning at målrettet ekspresjon av ETK i mus prostata fører til utvikling av PIN [13], er det mulig at ETK kan også spille en rolle i onkogen transformasjon i blæren urotelialceller. Enda viktigere er ETK uttrykk høyere i invasiv (T1-T4) enn ikke-invasive svulster i blæren (TIS /Ta), noe som tyder på at ETK kan også spille en rolle i tumorinvasjon og metastasering. Denne muligheten ble støttet av vår observasjon at knockdown av ETK uttrykk i blæren kreftceller hemme deres aktivitet i
in vitro
invasjon analyser. Videre fant vi at ETK uttrykket nivået kan også forutsi overlevelse av pasienter med cystektomi behandling uavhengig av andre viktige clinicopathological variabler som alder, tumor klasse, scene og positiv lymfeknute status. Derfor kan ETK potensielt tjene som et nytt medikament mål for blærekreft behandling, så vel som en biomarkør som kan brukes til å stratifisere pasienter med høyere dødelighet risiko. Disse pasientene kan være fordelaktig fra legemiddelselskap rettet mot ETK aktivitet.
Materialer og metoder
Cell Culture, transfeksjon og lentiviral infeksjon
Menneskelig blærekreft cellelinje T24, 5637, J82, RT-4 og UM-UC-3, så vel som 293T ble anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC). UM-UC-3, T24 og 293T-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium. 5637, J82 og RT-4-celler ble holdt i RPMI 1640 med 10% føtalt bovint serum og 1% (volum /volum) penicillin og streptomycin (100 ug /ml) og holdt ved 37 ° C i en 5% CO
2 atmosfære. Cellene ble transfektert med HD Fugene 6 (Roche Molecular Biochemicals) etter produsentens anvisninger. Lentivirusinfeksjon ble utført som beskrevet tidligere [9].
Immunutfelling og Western Blot
Cellene ble lysert i lyseringsbuffer (20 mM Tris /HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 1 mM Na
3VO
4, 1 mg /ml aprotinin, 1 mg /ml leupeptin, og 1 mM fenylmetyl-sulfonylfluorid). Uoppløselig materiale ble fjernet ved sentrifugering, og antistoffer ble tilsatt til lysatet for over natten ved 4 ° C. Antistoffer ble oppsamlet under anvendelse av protein A- eller protein G-Sepharose-kuler, og proteinkomplekser ble vasket tre ganger ved 4 ° C med lyseringsbuffer. Immunoblotting ble utført som beskrevet tidligere [9]. I korthet, ble like mengder prøve løst på en SDS polyakrylamidgel og overført til en membran polyvinylidendifluorid. Blottene ble inkubert med de indikerte primære antistoffer over natten ved 4 ° C og etterfulgt av deteksjon med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff. Det monoklonale anti-BMX-antistoff (BD Transduction Laboratories) ble brukt på 1:2000, mens anti-pSTAT3 (Y705), AKT, Pakt (S473), EGFR, pEGFR (Y1175) og pETK (Y40) (Cell Signaling Technology, Danvers , MA) ble brukt på 1:1,000. Anti-BCL-XL, anti-tubulin, ERK, VDAC og anti-signal sensorer og aktivatorer av transkripsjon 3 (STAT3) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ble brukt ved 1:2,000.
WST -1, kolonidannelse og TUNEL-analyser
Cellene ble sådd ut i 96-brønners plater i en tetthet på 1 x 10
3 celle /brønn og infisert med lentivirus som koder for ETK shRNA eller en kontroll shRNA. På hvert angitte tidspunkt, ble cellenes levedyktighet målt ved hjelp av WST-1 (Roche) assay følge produsentens protokoll. For kolonidannelsesbestemmelsen,-celler (1 x 10
4) ble sådd ut i 6-brønns plater og infisert med lentivirus for kontroll shRNA eller ETK shRNA. Cellekultur ble holdt i komplett medium i 14 dager. Cellekolonier ble deretter visualisert ved Coomassie blå farging. UM-UC-3 og T24 celler ble infisert med lentivirus koding ETK shRNA eller en kontroll i 96 timer og apoptotiske celler ble oppdaget av TUNEL analysen følge produsentens instruksjoner (Roche). Apoptotiske celler ble kvantifisert ved å telle TUNEL-positive celler fra fem tilfeldige uavhengige felt.
Cell migrasjon og invasjon analyser
Cell migrasjon ble vurdert av transwell analyse som beskrevet tidligere [8]. Kort sagt ble infiserte cellene høstet, resuspendert i serumfritt medium, og deretter overført til de beste kamrene (5 x 10
4 celler per brønn), mens de nederste kamre inneholdende 0,5 ml kondisjonert medium fra NIH 3T3 fibroblaster. Etter 24 timers inkubering ble cellene på den øvre overflate skrapet og vasket bort, mens cellene som migrerte til den nedre overflate ble fiksert og farget med 4 «, 6-diamidino- 2-fenylindol (DAPI) i 5 minutter og deretter tellet under et fluorescens mikroskop, og det relative antall av vektorkontroll ble beregnet. Celle invasjon assay ble utført under betingelser tilsvarende måte som ovenfor, bortsett fra transwell Filtrene ble pre-belagt med Matrigel (BD Biosciences) og 1 x 10
5-celler ble anvendt pr brønn.
Immunfluorescens og konfokal mikroskopi analyse
Cellene ble merket i friskt kulturmedium med 200 nM Mitotracker (Invitrogen) ved 37 ° C i 30 minutter, og ble deretter fiksert med 3,75% formalin i 15 minutter etterfulgt av inkubasjon med blokkeringsløsning [10% esel serum 0,5% bovint serumalbumin, 0,3% triton X-100 i PBS] og behandlet med ETK antistoff over natten ved 4 ° C. De immunoreaksjoner ble avslørt ved inkubering av cellene med geit-anti-mus FITC 488-konjugert IgG (Jackson Immuno Research) og DAPI (1:5000) i 5 minutter. Til slutt ble dekkglass som inneholder immunolabeled celler montert med en anti-falming montering medium (Biomeda gel montere, elektronmikroskopi Sciences). Cellene ble evaluert ved hjelp av et vann nedsenking 40X objektiv av en Zeiss 510 konfokal mikroskop utstyrt med 347-, 488, og 543 nm laserstråler.
mitokondrie forberedelse og reaktive oksygen arter (ROS) deteksjon
Mitokondrier fraksjon ble renset med Mitokondrier Isolation Kit for dyrkede celler (Pierce) i henhold til produsentens instruksjoner. Intracellulær ROS ble målt ved hjelp av fargestoff 5 (6) -CDCFDA (molekylære prober). Etter å ha passert gjennom plasmamembranen, er dette lipofile og ikke-fluorescerende forbindelse deforestres til en hydrofil alkohol (H2DCF) som kan oksyderes til fluorescerende DCF ved en fremgangsmåte som vanligvis anses å dreie seg med ROS. Dyrkede celler ble lastet med 10 pM 5 (6) -CDCFDA i vanlig medium ved 37 ° C i 30 minutter. Etter inkubering ble cellene vasket tre ganger med medium og forlot den siste vaskemedium for bildediagnostikk. Imaging ble tatt av fluorescens mikroskop ved hjelp av et Nikon TE2000s invertert mikroskop med 10x objektiv.
Tissue microarray, Immunohistochemistry og Statistisk analyse
microarray (TMA) ble utarbeidet av avdeling for patologi ved Universitetet of California, Los Angeles (UCLA) Medical Center som tidligere beskrevet [14]. Etterforskerne ble bare levert med kliniske-patologiske data som tumorstadium og klasse. Alle pasientkoder ble fjernet slik at det ikke er mulig å spore noen vev til en bestemt pasient. Derfor er pasient konfidensialitet beskyttet. Under protokollen godkjent av IRB komiteen ved UCLA, er ingen pasient samtykke kreves for denne studien. TMA ble deparaffinized med xylen og farget som tidligere beskrevet [13]. I korthet, ble objektglassene rehydrert og gjenfinning antigen ble oppnådd ved å mikrobølgeovn i 15 min i citratbuffer. Objektglass ble deretter inkubert i 0,3% hydrogenperoksid for å slukke endogen pepperrot-peroksidase (HRP) i 30 min. Objektglassene ble preinkubert med normalt geiteserum i PBS (01:20) i 60 minutter ved romtemperatur. Slides ble deretter inkubert med primært antistoff ETK (1:2000) ved 4 grader over natten. Deretter ble objektglassene inkubert med biotin-merket anti-kanin-IgG og inkubert med fordannet avidin-biotin-peroksidase-komplekset. Til slutt ble platene motfarget med hematoksylin, dehydratisert og montert.
Objektglassene ble analysert ved anvendelse av ARIOL SL-50 automatisert bildeskanner (Applied Imaging, San Jose, California) for å kvantifisere mengden av positiv farging for hvert område av interesse. Terskler for hvert bilde ble påført ved hjelp av ARIOL analyseprogrammer basert på flere parametere: RGB algoritme, form og størrelse. Alle analyser ble utført med MultiStain script. Terskel classifiers ble tilpasset for hver flekk.
For å vurdere atom farging, ble positivt DAB farging beregnes ved å bruke to farger terskler med en erkjenner blå bakgrunn (haematoxylin farget) celler og en annen erkjenner brune positive celler og blå, ikke- positive celler (totale cellenummer). Individuelle celler ble diskriminert ved å innlemme form og størrelse terskler, gir, sammen med farge terskler, faktiske celletall. Prosent positivitet ble bestemt ved å dividere det cellenummer som detekteres av brun terskelen med det totale celletallet, detektert av summen av de brune og blå terskler. Totalt vev området analysert var også inkludert i den endelige analysen (mikrometer
2).
For å vurdere cytoplasma farging, ble området positive flekken beregnes ved å bruke farge terskler for å påvise positive brune piksler. Prosent av positivitet ble bestemt ved å dele den totale positive flekkområdet (mikrometer
2) av den totale vev området analyseres (mikrometer
2).
immunoreactive score for hvert tilfelle ble kvantifisert ved gjennomsnittlig av fire kjerner. Sammenhenger mellom ETK uttrykk og patologiske parametere ble vurdert med metriske Kruskal-Wallis tester. Ulike overlevelse /tilbakefall endepunkter ble vurdert for pasienter som gjennomgikk TUR og pasienter som gjennomgikk cystektomi. Kaplan-Meier-kurver ble anvendt for å beregne overlevelse /tilbakefall-frie tidskurver og log rank test ble anvendt for å teste om kurvene forskjellig mellom gruppene. COX flere proporsjonale farer modellen ble brukt til å vurdere hvilke kovariater påvirker overlevelse /tilbakefall-fritiden. For hver kovariat, ble den relative fare hastighet og den tilhørende
P
verdi rapportert. Alle analyser ble utført med programvaren SAS versjon 9.2.
Takk
Vi ønsker å takke Dr. Allan J. Pantuck for hans råd om dataanalyse.
