Abstract
Innledning
sirkulerende tumorceller (CTCs) kunne representere en ikke-invasiv kilde av kreftceller som brukes for langsgående overvåking av tumoral mutasjons status gjennom hele sykdomsforløpet. Målet med denne studien var å undersøke påvisning av
KRAS
mutasjoner i CTCs fra pasienter med metastatisk kolorektalcancer (mCRC) og å sammenligne sine mutasjonsstatus under behandling eller sykdomsprogresjon med at av de tilsvarende primære svulster.
Materialer og metoder
Identifikasjon av sju vanligste
KRAS
mutasjoner på kodon 12 og 13 ble utført av Peptide Nucleic Acid (PNA) -baserte qPCR-metoden. Følsomheten av analysen ble bestemt etter isolering av
KRAS
mutante kreftceller tilsatt i friske givere «blod, ved hjelp av CellSearch epitelcelle kit. Konsistent påvisning av
KRAS
mutasjoner ble oppnådd i prøver inneholdende minst 10 tumorceller /7,5 ml blod.
Resultatene
Den kliniske nytten av analysen ble undersøkt i 48 blodprøver hentet fra 31 pasienter med mCRC. Alle pasientene hadde
PIK3C
A og
BRAF
villtype primære svulster og 14
KRAS
muterte tumorer. CTCs ble påvist i 65% av prøvene erholdt fra 74% av pasientene.
KRAS
mutasjonsanalyse CTC-anrikede prøver viste at 45% og 16,7% av pasientene med muterte og villtype primære svulster, respektivt, hadde påvisbare mutasjoner i sine CTCs. Vurdere
KRAS
mutasjoner i serieblodprøver viste at enkelte pasients CTCs utstilt forskjellige mutasjonsstatus av
KRAS
under behandlingen.
Konklusjoner
Den nåværende funn støtte begrunnelsen for bruk av CTCs som en dynamisk kilde av tumorceller som ved re-evaluere sin
KRAS
mutasjonsstatus, kunne forutse, kanskje mer presist, responsen fra mCRC pasienter til målrettet terapi.
Citation: Kalikaki A, Politaki H, Souglakos J, Apostolaki S, Papadimitraki E, Georgoulia N et al. (2014)
KRAS
Genotypisk Endringer av sirkulerende tumorceller under behandling av pasienter med metastatisk kolorektalcancer. PLoS ONE 9 (8): e104902. doi: 10,1371 /journal.pone.0104902
Redaktør: Georgia Sotiropoulou, Universitetet i Patras, Hellas
mottatt: 29 april 2014; Godkjent: 16 juli 2014; Publisert: 19 august 2014
Copyright: © 2014 Kalikaki et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler fra den kretiske Association for Biomedical Research (CABR), den greske Society of Medical Oncology (Hesmo) og Handlingsprogrammet «Competitiveness entreprenørskap», Nasjonal strategiplan Reference Framework 2007-2013, National Handling: «Samarbeid», OncoSeed Diagnostikk: Biology of Sirkulasjonstumorceller celler~~POS=HEADCOMP, fjernmetastaser Utvikling av flytende biopsi metoder; Sekretariatet i forskning og teknologi i Hellas. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Assistant Professor John Souglakos fungerer for tiden som en akademisk redaktør. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Sammenhengen mellom
KRAS
mutasjoner og respons på EGFR-hemmere har vært etablert i flere studier; følgelig
KRAS
genotyping anbefales hos alle pasienter med metastatisk kolorektalcancer (mCRC) før eventuell behandling som utnytter EGFR-målrettede monoklonale antistoffer, cetuximab eller panitumumab [1]. Likevel, ikke alle pasienter med
KRAS
villtype svulster svare på EGFR-målrettet terapi og flertallet av de opprinnelig responsive pasienter opplevde sykdomsprogresjon innen 5 til 6 måneder [2].
Med tanke på at de fleste av studiene er gjennomført ved hjelp av vev hentet fra den primære svulsten mens EGFR monoklonale antistoffer har vært brukt til å behandle metastatisk sykdom, er det mulig at manglende effekt og /eller fremveksten av påfølgende motstand kan skyldes genetisk spredning av metastatiske celler i forhold til sine primære tumor kolleger eller til dynamiske variasjoner i tumor genotype eller fenotype som dukker opp under behandlingen.
Flere studier har vist uharmoniske mutasjonsstatus mellom primære svulster og tilsvarende metastaser i en andel (5% -30% ) av CRC pasienter [3], [4], [5], [6]. Videre nyere studier tyder på at ervervet resistens er delvis oppnås ved valg av pre-eksisterende mindre underkloner mutasjoner som gir resistens mot anti-EGFR terapi [7], [8]. Fordi invasive biopsi av metastaser er ikke alltid mulig, og kan ikke være lett utføres gjentatte ganger, sirkulerende tumorceller (CTCs) i perifert blod av kreftpasienter, som antas å megle hematogenous spredning av sykdommen til fjerne områder, kan representere en alternativ kilde av metastaserende tumorceller.
det er godt dokumentert at CTCs, som definert av FDA-godkjente CellSearch System, kan tjene som en markør for mikrometatumorbelastning i forbindelse med pasientens prognose og nøyaktig kan forutsi effektiviteten av behandlingen i metastatisk bryst, kolorektal, prostata og lungekreft [9], [10], [11], [12]. Tidligere studier i metastatisk kolorektal kreft foreslått at det absolutte tall og de numeriske variasjoner av CTCs under sykdomsprogresjon eller terapi kan gi verdifull informasjon for klinisk resultat og effekten av administrerte behandlinger [13], [14], [15], [16 ], [17], [18]. Men CTCs kan ikke alltid bli identifisert med metastatisk pasienter, understreker behovet for å utvikle mer følsomme og krefttypespesifikke CTC deteksjon analyser [19]. I denne sammenheng kan identifisering av onkogene mutasjoner i CTCs bidra til forbedring av de eksisterende metoder for gjenkjenning. Videre genotyping av CTCs kunne forbedre overvåkingen av respons på målrettet terapi ved å identifisere genomiske profiler prediktive for tilbakefall av sykdommen før progresjon klinisk sykdom [20], [21], [22], [23], [24].
Formålet med denne studien var å undersøke muligheten for å oppdage
KRAS
mutasjoner i CTC-beriket fraksjoner hos pasienter med mCRC. Andre mål var å vurdere om
KRAS
mutasjonsstatus av CTCs korrelerer med den tilsvarende primærsvulster og undersøke den genetiske mangfoldet i CTCs i forhold til
KRAS
mutasjonsstatus under behandlingen.
Materialer og metoder
pasienter
Tretti-en pasienter med metastatisk kolorektalcancer ble inkludert i studien. Hos alle pasienter, ble diagnose bekreftet ved histologisk undersøkelse av primærtumor før initiering av enhver systemisk terapi. Alle unntatt én pasient ble behandlet med 5-FU-førstelinje kjemoterapi, med eller uten en biologisk middel (bevacizumab eller panitumumab). Nitten (55%) av pasientene fikk en irinotekanbasert kombinasjon og 11 (37%) en oksaliplatinbasert regime i førstelinjen innstilling (en pasient ikke fikk noen behandling). I tillegg 25 (83%) pasienter fikk bevacizumab og to (7%) panitumumab. På tidspunktet for analyse, 19 pasienter presenteres sykdomsprogresjon til førstelinjebehandling og 12 av dem ble behandlet med en andrelinje kjemoterapi; fem av disse 12 pasientene ble behandlet med panitumumab i kombinasjon med kjemoterapi.
Tilleggs blodet ble analysert for forekomst av CTCs før oppstart av førstelinjebehandling hos 12 pasienter, samtidig med progresjon på første linje behandling i 9 og når som helst i løpet av behandlingen i 18 pasienter.
Alle pasienter, så vel som for 16 friske bloddonorer, som ikke hadde noen kjent sykdom og ingen historie med ondartet sykdom, ble testet for tilstedeværelse av CTCs bruker CellSearch epithelial Cell Kit (Veridex LLC). Perifert blod ble oppnådd fra pasienter mCRC (7,5 ml) og friske blodgivere (23 ml, for bruk i å tilsette eksperimenter) ved venepunksjon i de spesifikke CellSave rørene; For å unngå forurensning av prøvene med epitelceller de første 5 ml av blodet ble kassert. Alle testene ble utført innen 72 timer fra blodprøvetaking i henhold til produsentens instruksjoner. Celler som var CK (+) /CD45 (-)., Og hadde en DAPI-positive intracellulær kjernen ble karakterisert som CTCs av erfarne biologer (EP og SA)
Siden denne studien var en pilot mulighetsstudie, var det ikke en statistisk utvalgsstørrelse estimering og prøvetaking var basert på tilgjengeligheten av CellSearch patroner.
Etikk uttalelse
Alle pasienter ga sin skriftlig informert samtykke til å delta i studien som har blitt godkjent av etikk og vitenskapskomiteer ved Universitetet General Hospital i Heraklion, Kreta, Hellas; manuskriptet ble fremstilt i henhold til bemerkningen kriterier [25]
Cellelinjer
kreft cellelinjer husing
KRAS
mutasjoner [LS174T, Human kolon adenokarsinom, c.35G A (p.G12D); HCT116, Human kolon adenokarsinom, c.38G A (p.G13D); HUP-T3, Human bukspyttkjertelen adenokarsinom, c.34G C (p.G12R); KYSE410, Human øsofageal plateepitelkarsinom, c.34G T (p.G12C); A549, Human alveolar adenokarsinom, c.34G A (p.G12S); SW403, Human kolon adenokarsinom, c.35G T (p.G12V) og RPMI8226, Human myelom, c.35G C (p.G12A)] eller villtype for
KRAS plakater (HT-29, Human colon adenokarsinom)] stammer fra American Type Culture Collection (ATCC, USA) og ble vennlig levert fra professor A. Jung (Institute of Pathology, Ludwig-Maximilian-universitetet, München, Tyskland). Alle cellelinjer ble dyrket i kolber i henhold til leverandørens anbefalinger, før neste innhøsting bruker 0,25% trypsin og 5 mmol /L EDTA (GIBCO-BRL). Autentisering ble gjort ved å bestemme
KRAS
mutasjonsstatus for hver cellelinje ved Sanger-sekvensering. Alle cellelinjer unntatt SW403 var heterozygote for
KRAS
mutasjoner og avslørte den forventede genotype.
DNA isolert fra CTC-beriket fraksjoner og vev
Etter CTC telling, de fangede celler ble overført fra kammeret til en 2 ml rør og underkastes en Proteinase K fordøyelse ved 65 ° C i 2-5 timer; DNA ble utført ved hjelp av Epicentre MasterPure Komplett DNA RNA Purification Kit (Epicentre Bioteknologi, Madison, WI, USA) i henhold til produsentens instruksjoner og hentet DNA ble kvantifisert ved hjelp av en Nanodrop ND1000 (Nanodrop Technologies, USA) og lagret ved -20 ° C inntil bruk. Den gjennomsnittlige avkastningen av DNA var ~1.5 gg; derimot, er DNA kvantifisering av UV-spektroskopi ikke nøyaktig grunnet påvisning av enkelttrådet DNA, gratis nukleotider eller RNA i prøven.
Formalin fiksert parafin-embedded (FFPE) primær tumorvevet ble evaluert histologisk av en patolog (MT) og mikro-disseksjon ble utført for å øke prosentandelen av tumorceller. Tre 5 um vevssnitt ble deparaffinised av xylen og etanol vasker og underkastet en proteinase K-fordøyelse over natten ved 56 ° C, DNA ble deretter renset ved anvendelse av en DNA-mikro QIAamp Kit (Qiagen, Tyskland).
Mutasjonsanalyse i primær svulster
i samtykkende pasienter, primære svulster ble evaluert for mutasjoner i
KRAS
,
PIK3CA Hotell og
BRAF
av både Sanger-sekvensering og metoder med høy følsomhet som tidligere beskrevet [26].
KRAS
mutasjonsassay
En mutasjon analyse som kombinerte peptid nukleinsyre (PNA) -mediert PCR klemme med TaqMan-MGB alleliske diskriminering analyser har tidligere blitt utviklet for å oppdage de sju vanligste
KRAS
mutasjoner [6] .Termisk forhold for PNA mediert PCR klem for hvert av de syv
KRAS
mutant maler ble ytterligere optimalisert ved hjelp en PNA merket med et fluorescerende fargestoff som både sensor probe og PCR klemme ifølge Luo JD et al [27]. Den største selektivitet, dvs. høy Ct-verdien i vill-type sonde og lav Ct-verdien i det mutante probe ble oppnådd ved 62 ° C med 200 nM PNA for c.35G A (p.G12D), c.38G A (p.G13D) og c.35G T (p.G12V) og 150 nM PNA for c.34G C (p.G12R), c.34G T (p.G12C), c.34G A ( p.G12S) og c.35G C (p.G12A)
KRAS
mutant maler hhv. Reaksjonene ble utført på Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR System i 384-brønns plater i et totalt volum på 5 ul, inneholdende 2 pl (ca. 1/8 av det totale ekstraherte DNA fra CTC-anrikede prøver og 20 ng ekstrahert DNA fra FFPEs ) DNA, 2,5 mL 2X TaqMan genotyping mester mix (Applied Biosystems, USA), 0,25 mL av genotyping analyseblanding og 150 eller 200 nm PNA; Parallelt ble en ikke-PNA-klemme reaksjon utført. PCR-betingelsene var 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av to-trinns sykling: 50 sykluser med 92 ° C i 15 s, og 62 ° C i 90 s. Alle prøver ble kjørt i hvert fall i duplikater. Ct-verdier ble innhentet fra instrumentets real-time PCR datainnsamling programvare ved hjelp av 0,2 manuell terskel. En positiv kontroll for hver
KRAS
mutasjon (modellprøver som utgjorde blandinger av cellelinjer med muterte /villtype forholdstall 1/100 og 1/500) og en negativ kontroll (
KRAS
villtype cellelinje) i total inngang på 50 ng ble inkludert i hver kjøring
ΔCt = Ct
mut probe (+ PNA) -. Ct
wt probe (-PNA) verdi ble beregnet for hver prøve; Ct
mut probe (+ PNA) og Ct
wt probe (-PNA) betegnet Ct (syklus terskel Ct, er betegnet som syklusen nummeret som et signal oppdages over bakgrunnen fluorescens) verdier for mutant og vekt- sonder av reaksjonene med og uten PNA, hhv. Den Ct
mut probe (+ PNA) gjenspeiler mengden av
KRAS
mutant DNA i prøven, mens Ct
wt probe (-PNA) gjenspeiler mengden av forsterkende mal utledet fra de varierende antall av forurensende leukocytter i CTC fraksjon [28].
assay gyldighet
gyldig~~POS=TRUNC av assay-resultatet for hver prøve ble bestemt ved Ct
wt-probe (-PNA) verdi som bør være 24≤Ct
wt probe (-PNA) 32; Hvis Ct
vekt- probe (-PNA) i en prøve er større enn 32, er assay-resultatet ikke pålitelig på grunn av en liten mengde DNA eller harde mål forsterkning. Effektiv PCR PNA klem ble bekreftet av en Ct
wtprobe (+ PNA) verdi 45.
KRAS
mutasjonsstatus ble bestemt ved sammenligning av ΔCt verdier til tidligere definert ΔCt cutoff-verdier for hver av de sju vanligste
KRAS
mutasjoner. Cutoff-verdier for hver mutasjonsanalyse har blitt bestemt fra analyse av 16 friske givernes blodprøver etter CellSearch analyse. Som cut-off-verdien ble definert ΔCt som tilsvarer den maksimale spesifisitet; det vil si ingen mutasjon påvises i 100% (16/16) av friske givere (tabell 1, figur 1).
Grafer viste ΔCt-verdier (
y
aksen) versus CTC- beriket prøver (
x
akse) av mCRC pasienter (n = 31), friske individer (n = 16) og modellprøver tilsatt 100 og 10 celler fra cellelinjer (LS174T, SW403, KYSE410 og HCT116) husing hotspot
KRAS
mutasjoner c.35G A; p.G12D (A), c.35G T; p.G12V (B), c.38G A; p.G13D (C) og c.34G T; p.G12C (D). Cutoff terskel er representert ved strek-linje; eksemplarer med ΔCt under terskelen anses mutant; ΔCt = Ct
mut probe (+ PNA) – Ct
wt probe (-PNA); NVD, ingen variant oppdaget.
Analytisk spesifisitet og sensitivitet
Den analytiske spesifisiteten av de syv analysene ble individuelt evaluert med genomisk DNA (gDNA) isolert fra
KRAS
vill-type cellelinje (HT29) eller positivt for spesifikke
KRAS
mutasjoner; den nedre deteksjonsgrense for alle analysene var 0,015 ng. For å vurdere analytisk sensitivitet, hver av de syv
KRAS
mutantcellelinje gDNA ble seriefortynnet over et område av tre forskjellige konsentrasjoner (100 ng, 50 ng og 20 ng) av villtype-gDNA gitt av HT- 29 cellelinje for å gi mutasjon /villtype forholdstall på 100%, 50%, 10%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1% og 0%. Alle analyser har en følsomhet på 0,1%, og holder den totale inngangs konstant på 20 ng, bortsett fra analyser for påvisning av p.G13D og p.G12V som har en følsomhet på 0,5% (tabell 1).
kryssreaktivitet
kryssreaktivitet testene ble utført for alle mutasjonsanalysene som potensielt identifiserer en annen analyse mal på grunn av mangelfull base paring og lese gjennom. Resultatene tyder på at G12D analysen viser signifikant kryssreaktivitet med G12V og G12A mutant maler, den G13D analysen med G12S mutant malen, den G12R analysen med G12C og G12S mutant maler og G12C analysen med G12S mutant malen (tabell 2).
intra- og inter-assay presisjon
Intra-assay presisjon har blitt vurdert ved å analysere modellprøver kjøres i tre eksemplarer i samme eksperiment ved hjelp serie fortynning (100% 50%, 10%, 2%, 1%, 0,5% og 0,1%) av
KRAS
mutant-DNA, som nevnt ovenfor, i 20 ng bakgrunn
KRAS
villtype-DNA. De ΔCt variasjonskoeffisient for
KRAS
mutert DNA varierte mellom 0,3% og 2,5%. Inter-analyse reproduserbarhet er blitt målt på lignende måte ved å beregne ΔCt variasjonskoeffisienter av triplikate prøver kjøres på forskjellige dager, ved bruk av de samme serielle fortynninger av mutert DNA. De ΔCt variasjonskoeffisient for
KRAS
mutert DNA varierte mellom 0,4% og 2,5%. Videre i modellen prøver med et mutert /villtype ratio 0,5%, den samlede mutasjonsanalyse strykprosent var 0%.
Resultater
mutasjonsassay optimalisering
Følsomheten vår eksperimentell tilnærming for å fastslå nøyaktig
KRAS
mutasjonsstatus i et begrenset antall CTCs stede blant normale blodceller i sirkulerende blod ble validert ved å tilsette
KRAS
muterte kreftceller i blodet av friske donorer . Omtrent 100 og 10-tumorceller ble tilsatt i 7,5 ml blod i CellSave rør og analysert ved CellSearch innen 2 dager, i det minste i 3 uavhengige eksperimenter. Den gjennomsnittlige prosent utvinning for de 100 og 10 piggete celler [LS174T, c.35G A (p.G12D), n = 5 forsøk; HCT116, c.38G A (p.G13D), n = 4 eksperimenter; SW403, c.35G T (p.G12V), n = 4 eksperimenter og KYSE410, c.34G T (p.G12C), n = 3 eksperimenter] var 95% (fra 70% -100%) og 92,5 % (fra 25% -130%), henholdsvis. Det brede spekter av utvinningen kan tilskrives feil i forbindelse med pigg-i lavt antall celler. Etter CTC oppregning av CellSearch epithelial Cell kit, ble DNA ekstrahert fra de fangede cellene og prøvene ble analysert for alle sju
KRAS
mutasjoner. Ved denne analysen,
KRAS
mutasjoner kan være konsekvent identifisert fra 10 piggete tumorceller.
Pasient egenskaper og evaluering av CTCs
Pasientens demografi, kliniske og patologiske egenskaper er listet i Tabell 3.
KRAS
mutasjoner ble identifisert i den primære tumorer i 45% av pasientene; åtte (57%) pasienter «primærtumor næret den c.35G A (p.G12D) mutasjon, tre (21%) av c.35G T (p.G12V), en (7%) av c.38G A (p.G13D), ett (7%) av c.34G T (p.G12C) og en (7%) av c.35G C (p.G12A). Alle svulster var
PIK3CA Hotell og
BRAF
vill type. Median tid mellom kirurgisk reseksjon av primærtumor og analyse av CTCs var 6 måneder (spredning 1-134).
I alt 48 blodprøver ble tatt fra 31 pasienter for CTC oppregning bruker CellSearch ( tabell 4). Tolv (39%) av pasientene kjemoterapi naive på tidspunktet for første blodprøvetaking. Tolv (71%) og 11 (79%) pasienter med
KRAS
villtype og mutant primære svulster, henholdsvis, hadde påvisbare CTCs; en median på 9 (range 2-660) og 7 (område 1 til 865) CTCs ble påvist hos pasienter med
KRAS
villtype og mutant primære svulster, henholdsvis. I sum kan 1 eller flere CTCs bli påvist i 31 (65%) blodprøver oppnådd fra 23 (74%) pasienter (tabell 4).
KRAS
mutasjonsanalyse på kodon 12 og 13 ble utført i alle prøvene med påvisbare CTCs (figur 1).
KRAS
mutasjoner i pasientenes CTC-beriket prøvene
KRAS
mutasjoner kan bli identifisert i CTCs av fem (45%) av pasientene som primære svulster hadde mutert
KRAS
. Spesielt før oppstart av en
st kjemoterapi bare to av de seks kjemoterapi naive pasienter (# 1 og # 5) næret CTCs med påvisbare mutasjoner mens på tidspunktet for sykdomsutvikling, kan mutasjoner bli identifisert i en (# 8) av de to pasientene; mutasjoner var også påvises under oppfølging av en
st behandling i to pasienter (# 6 og # 10) (tabell 4).
KRAS
mutasjoner kan også bli identifisert i CTCs av to (17%) pasienter (# 15 og # 16) hvis primære svulster hadde ingen påvisbare mutasjoner; i både pasienter, ble CTCs samlet inn under overvåking av 1. linje kjemoterapi (tabell 4).
KRAS
mutasjonsstatus av CTCs i serieblodprøver
Fire serieblodprøver av pasient 1 hadde påvisbare CTCs;
KRAS
mutasjoner ble dokumentert selv etter administrasjon av den første kjemoterapisyklus tross for viktig reduksjon av antall CTCs; behandling fortsettelse (etter 3
rd syklus) resulterte i ytterligere reduksjon av CTC nummer og undetectable
KRAS
mutasjoner i CTC-beriket eksemplarer mens vurdering av behandlingsrespons avslørt en delvis respons; etter 8
th kjemoterapisyklus, antall CTCs ble økt og
KRAS
mutasjoner kunne påvises igjen mens pasienten fortsatt forble i partiell respons (tabell 4).
I pasient # 15 som hadde en
KRAS
vill type primærtumor, nei
KRAS
mutasjoner kunne påvises i CTC-beriket eksemplar når pasienten var i delvis respons og under behandling med vedlikehold panitumumab; Men etter 4 måneders behandling, på tidspunktet for sykdomsprogresjon, som dokumentert av den radiologiske forverring av leverkreft og klinisk bilde av ascites, antall CTCs ble økt og
KRAS
mutasjoner kan bli identifisert i CTCs anriket cellefraksjon.
KRAS
mutasjoner var lenger påvises etter 2
nd syklus av berging kjemoterapi tross for reduksjon av CTC antall (tabell 4).
Diskusjoner
Mutasjoner i
KRAS
resultat i den konstitutive aktivering av RAS /MAPK sti og forutsi manglende respons på anti-EGFR monoklonale antistoffer. Til dags dato, terapi avgjørelser baserer seg hovedsakelig på
KRAS
mutasjonsstatus av primærtumor; imidlertid, kan genetiske endringer som forekommer i løpet av sykdomsprogresjon og ervervet resistens mot behandling forandre tumor biologi. Derfor gjelder muligheten til å bruke CTCs som et ikke-invasivt alternativ til en ny biopsi som kan være mer representativ for den aktuelle biologisk status av tumorceller og kan brukes som en biomarkør for enten følsomhet eller ervervet resistens mot EGFR-målrettet et viktig spørsmål terapi.
resultatene fra denne studien viser tydelig muligheten til å bestemme
KRAS
mutasjonsstatus i CTC-beriket blodprøver i forbindelse med rutinemessig klinisk praksis, etter CTCs opplisting av CellSearch system. De presenterte data sterkt støtter hypotesen om at CTCs kan representere en sanntids væskekilde biopsi som kan tillate dynamisk genotyping av tumorceller under behandlingen. Dataene indikerer også at den etablerte analysen gir en følsomhet på ca. 10 muterte celler /7,5 ml blod, uten behov for hele genomet forsterkning, og tilbyr muligheten for en ikke-invasiv, hurtig og med lave kostnader serie overvåking av
KRAS
mutasjonsstatus i kodon 12 og 13 i løpet av behandlingen.
KRAS
mutasjoner ble identifisert selv i kliniske prøver som inneholder så lite som tre CTCs /7,5 ml blod; vi kan ikke utelukke at dette kan være på grunn av tilstedeværelsen av
KRAS
mutasjoner i CTC fragmenter som ikke anses som reelle CTCs løpet av dokumentasjon og telling av CTCs av CellSearch system og /eller cellefritt DNA (cfDNA) adsorbert til overflaten av forurensende leukocytter [29]. Det er å merke seg at tidligere studier har vist at både CTCs og CTC fragmenter korrelerer med pasientens utfall i prostata kreft [30].
Til tross for den lille størrelsen på utvalget og den heterogene pasientgruppen analysert, gir denne studien tyder på at
KRAS
mutasjonsstatus av CTCs kan vesentlig forskjellig fra det tilsvarende primærtumor. CTCs uten påvisbare
KRAS
mutasjoner ble innhentet fra seks 11 pasienter med muterte primære svulster; Dette kan forklares ved den intra-tumoral heterogenitet og /eller anrikning av mindre forhåndseksisterende kloner med høy metastatisk potensial i løpet av sykdomsprogresjon. Ikke desto mindre, i tre av de seks uharmoniske tilfeller, reseksjon og undersøkelse av den primære tumor til
KRAS
-mutasjoner ble utført bare en måned før analyse av CTCs (data ikke vist), noe som indikerer muligens en modell av parallelle evolusjon av den primære tumor og metastase. Tidligere studier har vist at mutasjonsstatus av CTCs ikke alltid gjenspeiler at av den tilsvarende metastaser [31]; derfor sammenligningen av
KRAS
mutasjonsstatus av primærtumor, tilsvarende metastaser og serie CTC-beriket blodprøver kan kaste lys til opprinnelsen av metastaser.
Selv om forholdene og frekvensen av genotype konvertering er ikke godt forstått, antyder studien at det kan oppstå CTCs av forskjellige mutasjonsstatus under behandling hos samme pasient (pasienter # 1 og # 15). Faktisk kan det bli antatt at behandling, med eller uten målrettede midler, ved å eliminere noen kjemoterapi-sensitive kloner kan tillate fremveksten av andre lavfrekvente kloner som skiller seg fra den fremherskende tumorceller i forhold til den mutasjonstatus. Denne hypotesen er sterkt anbefalt av tilstedeværelsen av
KRAS
mutasjoner i CTCs av to ut de 12 pasienter med
KRAS
villtype primære svulster som ble behandlet med regimer som omfatter panitumumab eller bevacizumab (pasienter som nr 15 og # 16). Ikke desto mindre, svikt i å detektere mutasjoner i CTC-anrikede prøver kan også tilskrives den lave frekvens av CTCs mutasjoner, så vel som metodologiske begrensninger; FDA godkjente CellSearch epithelial Cell Kit, som er rapportert å være dårligere enn CellSearch epitelcelledifferensiering profil kit i form av CTCs «molekylær karakterisering [32]. Imidlertid har det vist seg at CTCs tatt med CellSearch epithelial Cell Kit kan med hell analysert av neste generasjons sekvensering metoder [33]. Videre, en undergruppe av CTCs kunne ikke påvises ved CellSearch grunn av utilstrekkelig uttrykk for EpCAM og /eller Cytokeratins; men en fersk undersøkelse i SCLC viste at CTCs, uttrykker EpCAM, fanget med CellSearch system kan danne svulster i immunsupprimerte mus [34].
Tidligere studier har brukt ulike metoder for å isolere og molekylært karakteriserer CTCs. I metastatisk brystkreft og prostatakreft, genomisk profilering av CTCs isolert ved immunomagnetisk berikelse og fluorescens aktivert celle sortering avdekket nye genomiske endringene som skjer i løpet av sykdomsprogresjon [35], [36]. Ved hjelp av en microfluidic CTC opptaksenhet,
TMPRSS2-ERG
fusjon, den TKI sensibiliserende
EGFR
aktiverende mutasjoner og
EGFR
T790M TKI-motstand mutasjon ble påvist i CTCs fra pasienter med henholdsvis prostatakreft og lungekreft metastatisk sykdom, mens mutasjoner av
AR
,
KRAS Hotell og
BRAF
gener har blitt identifisert i CTC-anrikede prøver isolert fra prostata og mCRC pasienter, henholdsvis, ved hjelp av CellSearch Profilsett [24], [37], [38], [39]. Genotyping av enkelt CTCs isolert av CellSearch eller IsoFlux systemet hos pasienter med mCRC bekreftet en intra- og inter- pasient heterogenitet, basert på
PIK3CA Hotell og
KRAS
mutasjonsstatus [22], [ ,,,0],31]; dessuten har forskjellige genetiske endringer på enkelt CTCs allerede blitt rapportert hos pasienter med brystkreft og spiserørskreft [23], [40].
Tidligere rapporter antydet en sammenheng mellom tilstedeværelsen av CTCs og cellen gratis DNA (cfDNA ) i serum eller plasma fra cancerpasienter [41].
KRAS
mutasjoner påvist i serum hos pasienter med mCRC har vært foreslått å overvåke respons på behandling før den kliniske utseendet av sykdomsprogresjon mens i NSCLC pasienter har det blitt rapportert en høyere følsomhet for EGFR mutasjonsdeteksjon i cfDNA enn i CTCs [7], [8], [42]. Likevel er opprinnelsen til cfDNA ikke godt forstått, siden det kan være avledet fra apoptotiske tumorceller, leukocytter apoptotiske produsert av cytotoksisk terapi så vel som ved exosomes eller CTCs frigitt fra tumorceller i blodet. Selv om isolering og analysering av cfDNA er enklere og mer reproduserbar enn å isolere og genotyping CTCs, den molekylære karakterisering av CTCs i tillegg til å være nyttig for å overvåke behandling svikt eller sykdom tilbakefall kan også tilveiebringe informasjon for å veilede optimal behandling utvalg og /eller utvikling av nye terapier.
i konklusjonen, presenterte data beskrive en enkel metode basert på den daglige bruken av CellSearch plattform for identifisering av
KRAS
mutasjonsstatus av CTCs fra pasienter med metastatisk kolorektalcancer og gi en begrunnelse for å vurdere ny vurdering av
KRAS
mutasjonsstatus i CTCs for å bedre forutsi respons på anti-EGFR terapi.
