Abstract
Rnd3 /RhoE er en liten Rho GTPase involvert i reguleringen av ulike celle atferd. Feilregulering av Rnd3 har vært knyttet til tumorigenesis og metastasering. Lungekreft er den ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall i Vesten og resten av verden. Uttrykket av Rnd3 og dens ektopisk rolle i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er fortsatt å bli utforsket. Her rapporterte vi at Rnd3 ble nedregulert i tre NSCLC cellelinjer: H358, H520 og A549. Nedregulering av Rnd3 førte til hyper-aktivering av Rho-kinase og Notch signalering. Gjeninnføring av Rnd3 eller selektiv hemming av Notch signalering, men ikke Rho Kinase signalering, blokkert spredning av H358 og H520 celler. Mekanistisk, ble Notch intracellulære domenet (NiCd) protein overflod i H358-celler reguleres av Rnd3-mediert NICD proteasome degradering. Rnd3 regulert H358 og H520 celleproliferasjon gjennom en Notch1 /NiCd /Hes1 signaliserer akse uavhengig av Rho kinase
Citation. Tang Y, Hu C, Yang H, Cao L, Li Y, Deng P, et al. (2014) Rnd3 Regulerer Lung Cancer Cell Proliferation gjennom Notch signalering. PLoS ONE 9 (11): e111897. doi: 10,1371 /journal.pone.0111897
Redaktør: Jeremy J.W. Chen, Institute of Biomedical Sciences, Taiwan
mottatt: 13 juni 2014; Godkjent: 29 september 2014; Publisert: 05.11.2014
Copyright: © 2014 Tang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av hoved sitere fra National Clincial Research Center for luftveissykdom, National Key Scientific Teknologi Support Program: Collaborative innovasjon of Clinical Research for kronisk obstruktiv lungesykdom og lungekreft, nr 2013BAI09B09. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall i utviklede land. De viktigste typer lungekreft er småcellet lungekreft (SCLC) og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Til tross for fremskritt i dagens medisin, generell 5-års overlevelse for pasienter diagnostisert med NSCLC er ca 15%, noe som indikerer at (1) vi mangler en effektiv måte å hindre NSCLC; og at (2) vi ikke helt forstår NSCLC. Tilbakefall av kreft kjemoterapi og motstand er to viktige begrensninger i behandlingen av lunge cancer. Av interesse, flere kreftformer som er resistente mot terapi vært nært knyttet til oppregulert Notch signale [1]. Rollen Notch signalering i NSCLC er kontroversielt. Noen studier har rapportert at aktiv Notch1 hemmet veksten av enkelte NSCLC-celler [2], [3], mens en nyere studie viste at en Notch1 aktiverende mutasjon i ca. 10% av NSCLC førte til en dårlig prognose i pasienter [4]. Derfor er videre undersøkelser av Notch signalisering i NSCLC nødvendig for å forstå denne sykdommen, og kan være fordelaktig for behandling av NSCLC.
Rnd3, også kjent som RhoE, er en liten GTPase som er involvert i regulering av en rekke forskjellige av celleatferd, inkludert cytoskjelettet, proliferasjon, migrering og apoptose [5] – [9]. Den biologiske funksjon av Rnd3 ble først identifisert som et ROCK1 repressor som regulerer actin dynamikk [5]. Nylig har studier rapportert den brede funksjon Rnd3 i kreft og neuron systemutvikling. Interessant, Rnd3 er nedregulert i forskjellige kreftceller, slik som brystcancerceller [8], hepatocellulært karsinom [10], karsinomer [11], mesenchymale tumorceller [12], etc. Imidlertid undersøkelser av ekspresjon og biologiske funksjonen til Rnd3 i NSCLC er svært begrenset.
rollen Rnd3 i regulering av cellesyklus ble rapportert for et tiår siden. Tvunget overekspresjon av Rnd3 hemmer celledeling og serum-induserte S-fase inngang, uavhengig av RhoA-ROCK signalering, noe som indikerer at kompliserte signalisering er involvert i cellesyklusregulering [13]. En fersk publikasjon utforsket en meget interessant forhold mellom Rnd3 og Notch signale [7]. Slettingen av Rnd3 resulterte i en oppregulering av Notch signalisering i mus ependymal celler, fremmer proliferasjon i disse cellene. RNAi-mediert Rnd3 ned-regulering i to cellelinjer, MDA-MB-231 og HepG2, fremmet celle proliferasjon, cellesyklusprogresjon og invasjon. Men rollen som Rnd3 i lunge kreft, spesielt i NSCLC, er fortsatt uklart. Denne studien, for første gang, avdekker patogene roller Rnd3 i NSCLC, inkludert følgende: 1) Rnd3 er nedregulert i A520, H358 og A549, tre lunge kreft cellelinjer; 2) tvunget uttrykk for Rnd3 i A520 og A358 celler hemmer celledeling; 3) den Rnd3-mediert celle-proliferasjon er regulert gjennom Notch signale regulering via post-translasjonell modifikasjon.
Materialer og metoder
Cellekultur og generering av stabile cellelinjer
H358 (ATCC, CRL-5807), H520 (ATCC, HTB-182) og A549 (ATCC, CCL-185) celler ble dyrket i RPMI-1640 (Life Technologies, Cat # 11875-085) pluss 10% føtalt bovint serum (liv Technologies, Cat # 16000-044) og 1% penicillin-streptomycin (Life Technologies, Cat # 15140-148). HBEC celler ble dyrket i Keratinocytter serumfritt medium (Life Technologies, Cat # 17005-042) pluss bovin hypofysen ekstrakt (Life Technologies, Cat # 13028-014) og rekombinant humant EGF (Life Technologies, Cat # PHG0311).
Rnd3 cDNA ble subklonet inn i lentiviral vektor pWPI-polio-EGFP. 293 T (Invitrogen, Carlsbad, CA) celler ble transfektert med lentiviral vektor uttrykker Rnd3 og to hjelpe vektorer, pMD2 og psPAX2, for å produsere lentivirus. H358 og H520-celler ble deretter infisert med virus ved en MOI på 10. infeksjon effektivitet ble bekreftet ved GFP uttrykk ved å benytte fluorescens mikroskopi. De infiserte celler ble valgt av puromycin (2 ug /ml). En enkelt klon ble valgt til å produsere stabile cellelinjer, H358-Rnd3 og H520-Rnd3.
For de celle nummer måleforsøk, celler ble synkronisert for 12 timer og 10
5 celler fra hver gruppe ble dyrket i vekstmedium. Celletallet ble regnet hver 24. time for totalt 5 dager.
Immunoblotting
Proteinprøver for western blot analyse ble hentet av RIPA buffer (Thermo Scientific, Cat # 89900) pluss en protease inhibitor cocktail (Roche, Cat # 11836153001) og fosfatase-hemmere (50 mM NaF, 2 mM Na
3VO
4, 4 mM natriumpyrofosfat). Kommersielt tilgjengelige antistoffer var fra følgende kilder: MYPT1 (2634 S), fosfor-T853 MYPT1 (4563 S) og PDK1 (3062) fra Cell Signaling Technology (MA, USA); MLC2 (PA5-17624) og fosfor-Ser20 MLC (PA5-17727) fra Thermo Scientific Pierce (IL, USA); ROCK1 (sc-5560) og Rnd3 (sc-53874) fra Santa Cruz Bioteknologi (CA, USA). Hes1 (ab71559) og Notch1 (ab27526) var fra Abcam (MA, USA). Tilsvarende protein lasting ble bekreftet av intensiteten i en GAPDH (sc20357, Santa Cruz, California) blot.
mRNA utvinning og QRT-PCR
Total RNA ble utvunnet av Trizol reagens (Life Technologies, 15596-026). QRT-PCR ble utført ved hjelp av en SYBR grønn metode med et MasterMix buffersystem. Primerne sekvensene var som følger: Rnd3: CTATGACCAGGGGGCAAATA /TCTTCGCTTTGTCCTTTCGT; Jag-en: CTATGATGAGGGGGATGCT /CGTCCATTCAGGCACTGG; Jag-2: TGGGATGCCTGGCACA /CCGGCAGATGCAGGA; Dll-en: GAGGGAGGCCTCGTGGA /AGACCCGAAGTGCCTTTGTA; Dll-4: GCATTGTTTACATTGCATCCTG /GCAAACCCCAGCAAGAGAC; Notch1: CACTGTGGGCGGGTCC /GTTGTATTGGTTCGGCACCAT; Hes1: AGGCGGACATTCTGGAAATG /CGGTACTTCCCCAGCACACTT; GAPDH. GAGTCAACGGATTTGGTCGT /TTGATTTTGGAGGGATCTCG
BrdU inkorporering analysen
Celler ble synkronisert og deretter dyrket i vekstmedier for 12 timer fulgt av BrdU (bromdeoksyuridin) behandling i 30 min før høsting. Den anti-BrdU-antistoff (mus, BD, 552598, 1:1000) ble inkubert ved 4 ° C i 16 timer, og den sekundære geit anti-mus IgG-antistoff konjugert med Alexa Fluor 594 (1:200) ble innkjøpt fra Invitrogen ( A11032). Inkubasjonstiden var 1 time ved romtemperatur, beskyttet mot lys. Kjerner ble visualisert ved DAPI (4 «, 6’diamidino-to-phenylindole) (Vectashield, Vector Laboratories, Inc. H1000), og bildene ble kjøpt opp av fluorescens mikroskopi (DMI 4000B, Leica, Mannheim, Tyskland).
Statistisk analyse
dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD I flere gruppesammenligninger, enveis ANOVA etterfulgt av Student-Newman-Keuls metoden ble brukt. I to-gruppesammenligninger, en uparet, to-tailed students
t
test ble brukt. Alle analysene ble utført av Sigmaplot 11.0 (Systat, San Jose, CA, USA). En verdi på P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Rnd3 er nedregulert sammen med økt Notch og Rho kinase aktivitet i H358 og H520 celler
To menneske. NSCLC-cellelinjer, H358 og H520, ble anvendt i denne studien. Humane bronkiale epitelceller (HBEC) ble anvendt som en normal kontroll. Vi har oppdaget at den Rnd3 uttrykk både på mRNA og proteinnivå. Sammenlignet med HBEC celler, Rnd3 ekspresjon ble betydelig nedregulert i H358 og H520-celler (Fig. 1 A-C). Rnd3 ble først identifisert som en ROCK1 endogene inhibitor som regulerer cytoskjelettet. Her undersøkte vi Rho Kinase signaliserer ved sondering to godt karakteriserte Rho Kinase underlag i de tre cellelinjer. Som vist på fig. 1D-G, fosforylering av myosin fosfatase, målrette subenhet 1 (MYPT1) og myosin lett kjede 2 (MCL2) ble betydelig økt i H358 og H520 celler, noe som indikerer en hyper-aktivert Rho kinase aktivitet. Imidlertid ROCK1 ekspresjonsnivået var ikke forskjellig blant de cellelinjer (fig. 1 H). Et potent Rho-kinase en aktivator [14], PDK1 som kunne konkurrere med Rnd3 til å bindes til ROCK1, ble ekspresjonsnivået også ikke forandret seg i H358 og H520-celler sammenlignet med de HEBC-celler (fig. S1). Av interesse, i tillegg til oppregulert Rho Kinase signalering, vi også observert hyper-aktivert Notch signalering i H520 og H358, sammenlignet med HBEC celler (Fig. 1i, 1 J), noe som gjenspeiles av opphopning av Notch en aktiv form , Notch intracellulære domenet (NiCd). Både Rho kinase og Notch har blitt grundig studert i ulike celler og genetiske modeller. Den biologiske rollen til aktiveringen av disse to signalveier i NSCLC, og forholdet mellom Rnd3 nedregulering og NICD opp-regulering i lunge cancer har ennå ikke blitt karakterisert.
(A) Rnd3 mRNA detektert ved qRT- PCR er nedregulert i H358 og H520 forhold til HBEC. (B) Rnd3 protein uttrykk nivåer i celler ved western blot. (C) Densitometry kvantifisering av vestlige bandet intensiteten i B. (D), (F), (H) (I) A western blot for å påvise fosforylerte MYPT1, fosforylert MLC2, ROCK1 og NICD i celler. (E), (G) og amp; (J) Densitometry kvantifisering av vestlige bandet intensitet viste oppregulering av Rho kinase aktivitet og NICD uttrykk i H358 og H520 celler i forhold til HBEC. Western blot ble kvantifisert fra tre uavhengige eksperimentelle gjentas. BrdU-positive celler ble kvantifisert fra 8 bilder tatt fra fire lysbilder. Data representerer gjennomsnitt ± SD
Hemming av spredning av stabil overekspresjon av Rnd3 i H520 og H358
For å undersøke ektopisk rolle redusert Rnd3 uttrykk i H520 og H358-celler, vi genererte celle linjer som stabilt uttrykker Rnd3-GFP bruker et lentivirus system. Rnd3 uttrykk ble bekreftet av både anti-Rnd3 (oppdager endogen og eksogen Rnd3) og anti-GFP (registrerer eksogene Rnd3 only) antistoffer (Fig. 2A og 2C). H358-Rnd3 og H520-Rnd3 stabilt uttrykt Rnd3 på 2,7 ganger og 4,4 ganger høyere sammenlignet med H358 og H520 celler henholdsvis (Fig. 2B og 2D). Deretter undersøkte vi formeringshastigheten av de to stabile cellelinjer ved hjelp av en BrdU-inkorporering assay. Cellene ble synkronisert ved serum deprivasjon og deretter dyrket i vekstmedium i 12 timer, etterfulgt av behandling BrdU i 30 minutter før høsting. Cellene ble overført til lysbilder av Cytospin til farging og bildebehandling. Formeringshastigheten indikert med BrdU-positiv farging ble signifikant redusert i H358-Rnd3-celler sammenlignet med H358-celler (fig. 2E og 2F). Det samme resultatet ble observert i H520-Rnd3-celler sammenlignet med H520-celler (fig. 2G og 2H). Vi har også telles forholdet mellom BrdU + celle til GFP + celler som vist i fig. S2. Forholdet var signifikant høyere i H358 (50%) og H520 (41%) sammenlignet med celler H358-Rnd3 (15%) og H520-Rnd3 (11%) celler, henholdsvis (fig. S2A og S2B). Videre ble en × 10
5 celler fra hver gruppe synkronisert og deretter dyrket. Celletallet ble tellet ved ulike tidspunkt (Dag 0, 1, 2, 3, 4 og 5). Vi har observert en signifikant økning i celleantall i H358 og H520-celler. Men denne økningen var bemerkelsesverdig svekket i både H358-Rnd3 og H520-Rnd3 celler startet på dag 2 (Fig. 2I og 2j). Tatt sammen, tvinges overekspresjon av Rnd3 i H358 og H520 kunne redusere formeringshastigheten av disse cellene. Hemming av tumorcellevekst er en av de viktigste strategiene i behandling av kreft. Rollen til Rnd3 i å hemme proliferasjon av disse to NSCLCs gjør det mulig mål for kreftbehandling
(A) og amp.; (B) at det produseres en H358 cellelinje som stabilt uttrykker GFP-merket Rnd3. Den Rnd3 uttrykket ble bekreftet av begge Rnd3 og GFP antistoffer. (C) og amp; (D) at det produseres en H358 cellelinje som stabilt uttrykker GFP-merket Rnd3. Den Rnd3 uttrykket ble bekreftet av begge Rnd3 og GFP antistoffer. (E) (F) H358-Rnd3 har en lavere spredning hastighet i forhold til H358-celler som detektert ved BrdU-inkorporering. (G) og amp; (H) H520-Rnd3 har en lavere spredning hastighet i forhold til H520-celler som detektert ved BrdU-inkorporering. (I) (J) Cell nummer ble kvantifisert på ulike tidspunkt. Et gjennomsnitt på tre prøver ved hvert tidspunkt ble presentert i denne figuren. Western blot ble kvantifisert fra tre uavhengige eksperimentelle gjentas. Data representerer gjennomsnitt ± SD
gjeninnføre Rnd3 avstumpet Rho kinase og Notch signalering i H520 og H358-celler
Vi viste høyere Rho Kinase aktiviteter og NICD uttrykk sammen med en redusert Rnd3 uttrykk nivå i H520 og H358-celler sammenlignet med de normale lunge epitelceller, HBEC (fig. 1). Vi neste undersøkt om en sammenheng mellom lavere Rnd3 uttrykk og høyere Rho kinase og NICD uttrykk. NiCd uttrykket ble nedregulert mer enn 3,5 ganger i H520-Rnd3 celler i forhold til H520 celler (fig. 3A og 3B). Det fosforylerte myosinlettkjedefosfatase fosfatase, subenhet 1 (pMYPT1) og myosin lettkjede (pMLC2) ble nedregulert, 2.5 og 1,8 ganger, henholdsvis i H520-Rnd3-celler sammenlignet med H520-celler (Fig. 3C og 3D). I H358-celler, observerte vi den samme trenden som NiCd uttrykk og Rho kinase aktivitet når Rnd3 ble overexpressed. NiCd uttrykket ble redusert 2,9 ganger i H358-Rnd3 celler sammenlignet med H358-celler (fig. 3E og 3F), mens pMYPT1 (2,46 ganger) og pMLC2 (1,83 ganger) ble også redusert i H358-Rnd3 celler sammenlignet med H358 -celler (fig. 3G og 3H). Videre er overekspresjon av Rnd3 i H358 og H520-celler ble ikke endret ekspresjon av Notch-ligand som vist i fig. S3. Ekspresjon av human taggete-1 (Jag-1), tagget-2, (Jag-2), Delta-like-1 (Dll-1) og Delta-like-4 (Dll-4) mRNA ble målt ved QRT-PCR . Det er ingen statistisk signifikant endring i uttrykket av disse mRNA i H358 og H520 har sammenlignet den H358-Rnd3 og H520-Rnd3 henholdsvis (Fig. S3A og S3b). Disse resultatene tyder på at Rnd3 kunne regulere både Rho kinase og NICD signalering i H358 og H520 celler. Rnd3 er en regulator hemme Rho kinase aktivering og NICD uttrykk i NSCLCs. Rnd3 mediert Notch signalemodule gjorde ikke gjennom å regulere Notch ligand uttrykk
(A) (B) Redusert NICD uttrykk i H520-Rnd3 celler i forhold til H520 celler. (C) og amp; (D) Redusert Rho kinase aktivitet i H520-Rnd3 celler i forhold til H520 celler oppdages av antistoffer som er spesifikke for pMYPT1 og pMLC2. (E) (F) Redusert NICD uttrykk i H358-Rnd3 celler sammenlignet med H358-celler. (G) og amp; (H) Redusert Rho kinase aktivitet i H358-Rnd3 celler sammenlignet med H358-celler oppdages av antistoffer som er spesifikke for pMYPT1 og pMLC2. Western blot ble kvantifisert fra tre uavhengige eksperimentelle gjentas. Data representerer gjennomsnitt ± SD
Hemming av Notch signale hindret spredning av H520 og H358-celler
Vi viste at tvangs overekspresjon av Rnd3 av lentivirus i både H520 og H358-celler 1) hemmet spredning (fig. 2) og 2) blokkerte aktiveringen av Rho-kinase og hakk /NICD signalering. For å bestemme hvilken signalveien kan bidra til formeringshastigheten, ble kjemiske inhibitorer påført til cellene. Enten Fasudil, en Rho kinase inhibitor [15], [16], kan påvirke celledeling rate i H358 og H520 celler? Våre data viser at inhibering av Rho-kinase-aktivitet ved Fasudil endret ikke proliferasjon av H520 og H358-celler (Fig. S4). Imidlertid forbindelse E [17], et bestemt hakk signale inhibitor kan svekke proliferasjon i begge cellelinjer (Fig. 4). Behandling med forbindelse E redusert spredning av H358 med 40% sammenlignet med DSMO behandlede kontrollgruppen som indikert ved en BrdU-inkorporering analyse (Fig. 4A og 4B). Formeringshastigheten redusert til bare 32% av kontrollen i H520-gruppen (fig. 4C og 4D). For å teste mulige cytotoksisitet av forbindelse E, vurderte vi celledød ved trypanblått farging. På konsentrasjon på 5 nM sammensatte E, gjorde vi ikke oppdage en betydelig celledød sammenlignet med ikke-behandlingsgruppen i både H358 og H520 celler (Fig. S6, bilde 2 og 6 mot 1 og 5, henholdsvis), noe som tyder på cytotoksisitet av forbindelse E i alle tre cellelinjer ved denne konsentrasjonen var minimal. Vi har økt ytterligere forbindelsen E-konsentrasjonen til 50 nM og 500 nM, og fant at kun mindre enn 5% celledød ble observert i 50 nM gruppe (Fig S6, bilde 3, 7 og 11.), Mens massiv celledød ( 50%) ble forårsaket av høy dose av forbindelse E (500 nm, fig. S6, bilde 4, 8 og 12). Eksperimentet bruker selektive signal hemmere antydet at Rnd3 nedregule mediert NICD oppregulering kan spille en viktigere rolle i spredning av H358 og H520 celler og at denne spredningen er ikke Rho Kinase avhengig.
(A) (B) Anvendelse av forbindelse E blokkerer proliferasjon av H358-celler som detektert ved en BrdU-inkorporering assay. Cellene ble behandlet med forbindelse E i en sluttkonsentrasjon på 5 nM og synkronisert ved serum uttømming etterfulgt av vekst i medier i 12 timer. Deretter ble cellene behandlet med BrdU i 30 minutter før de ble høstet for analyse. (C) og amp; (D) Anvendelsen av forbindelse E blokkerer proliferasjon av H520-celler som detektert ved en BrdU-inkorporering assay. Cellene ble behandlet med forbindelse E i en sluttkonsentrasjon på 5 nM og synkronisert ved serum uttømming etterfulgt av vekst i medier i 12 timer. Deretter ble cellene behandlet med BrdU i 30 minutter før de ble høstet for analyse. BrdU-positive celler ble kvantifisert fra 8 bilder tatt fra fire lysbilder. Data representerer betyr ± standardavvik
Rnd3 regulerer spredning ved å modulere NiCd /Hes1 signale aksen i H520 og H358-celler
Notch signalering er en viktig cellesyklusen regulator. Blokkering Notch signale hemmer veksten av forskjellige celler [18] – [20]. Merkbart, en fersk studie av Chang et al. gruppe viste at NICD regulerer epidermal celleformering ved oppregulering av Hes1 i Rnd3 knockout-mus [21]. Derfor undersøkte vi Hes1 uttrykk i våre celler. Hes1 ble oppregulert 5-fold i H520 og H358 sammenlignet med de HBEC celler (Fig. 5A og 5B). I samsvar med en svekket proliferasjonsrate observert i H520-Rnd3 og H358-Rnd3 celler (Fig. 3E-3H), Hes1 uttrykk ble også nedregulert med 2 ganger og 2,5 ganger i disse to cellelinjer i forhold til H520 og H358, . henholdsvis (fig. 5C-5F), noe som tyder på at NICD hemming-mediert nedgang i sprednings priser av H520-Rnd3 og H358-Rnd3 celler kan være gjennom nedregulert Hes1 uttrykk
(A) (B) Hes1 ble oppregulert i H520 og H358-celler i forhold til HBEC celler. (C-F) Hes1 uttrykk redusert når Rnd3 ble stabilt overexpressed i H358 og H520 celler. (G) og amp; (H) Transient overekspresjon av Rnd3 i H358-celler nedregulert NICD og Hes1 i et doseavhengig måte. (I) (J) Inhibering av proteasom-aktivitet ved MG132 (sluttkonsentrasjon på 15 uM) avskaffet Rnd3 doseavhengig NICD ned-regulering i H358-celler. Western blot ble kvantifisert fra tre uavhengige eksperimentelle gjentas. Data representerer middel ± S.D. *
p
0,05 sammenlignet med kontrollgruppen (gruppe 0); #
p
0,05 sammenlignet med gruppe 1; $
p
0,05 sammenlignet med gruppe 3. Data representerer gjennomsnitt ± SD
For å definere forholdet mellom Rnd3 og NICD, utførte vi en dose avhengig uttrykk for Rnd3 i H358-celler . myc-Rnd3 ble transient transfektert inn i H358-celler ved forskjellige doser (0, 1 pg, 3 ig, 5 ug). Deretter undersøkte vi uttrykket NiCd og Hes1 av western blot. Med økt Rnd3 uttrykk, NiCd og Hes1 uttrykk nivåer redusert (fig. 5G og 5H). Ikke overraskende, Hes1 mRNA, et NiCd målet genet, endret tilsvarende (Fig. S5 fylt svart strek). Vi har imidlertid ikke observere noen endring i Notch1 mRNA (Fig. S5 tom bar), til tross for betydelig reduksjon i proteinnivået skyldes Rnd3 overekspresjon, noe som tyder på at Rnd3 regulert NICD på post-translasjonell nivå, fordi NiCd nivå er regulert av proteasome degradering [22]. Vi hemmet proteasome aktivitet ved hjelp av MG132 og fant at Rnd3 doseringen avhengig NICD nedbrytning ble fullstendig blokkert (Fig. 5I og 5J), noe som tyder på en post-translasjonell regulerende rolle Rnd3 i NICD degradering.
Rnd3 regulerer spredning gjennom Notch1 signalering i lunge adenokarcinomceller
H358 cellelinjen ble avledet fra lunge bronchioalveolar karsinom og H520 cellelinjen ble avledet fra lunge squamouse cell carcinoma. Imidlertid, den store undertype av NSCLC var lunge adenokarsinom. Så vi bekreftet vår studie i en lunge adenokarsinom-celler, A549, som vist i fig. 6. Rnd3 ble nedregulert sammen med oppregulert Rho-kinase og Notch1 signalering i A549-celler i forhold til HBEC celler (fig. 6A og 6B). Vi kvantifisert oppregulering fold i endring i to signalering. Resultatene ble vist i fig. 6C. Rho Kinase signaliserer ble oppregulert med nesten fire ganger dokumentert av pMYPT1 nivå; den Notch1 signale ble oppregulert med 5 ganger dokumentert av NICD nivå. Inhibering av Notch1 signalering av forbindelse E blokkerte proliferasjonen av A549-celler (fig. 6D og 6E). Cytotoksisiteten av forbindelse E i A549 cellen ble også evaluert ved Trypan blå farging. Som vist i fig. S6 (bilde 9 til 12), idet 5 nM forbindelse E forårsaket ingen signifikant død sammenlignet med opprinnelige tilstand i A549-celler. Mekanistisk, Rnd3 regulert celleproliferasjon gjennom NiCd /Hes1 signalering. Overekspresjon Rnd3 trykt NiCd og Hes1 uttrykk i en dose avhengig måte i A549-celler (fig. 6F og 6G). Våre funn i A549 cellene var i samsvar med resultatene fra H358 og H520 celler, noe som tyder på Rnd3-NICD-Hes1 signale var et generelt molekylær mekanisme for å regulere NSCLC celler vekst. Sammen ble det observert høyere NICD og Hes1 uttrykk og lavere Rnd3 uttrykk i H520, H358 og A549 celler i forhold til HBEC celler. Gjeninnføring av Rnd3 hemmet NICD og Hes1 uttrykk, noe som resulterte i redusert spredningshastigheter på H520 og H358-celler. Blokkering av Notch1 signale hemmet celleproliferasjon i H358, H520 og A549 celler. Rnd3 regulert NiCd overflod gjennom å spørre sin proteasomal nedbrytning i NSCLCs.
(A) Rnd3 mRNA detektert ved QRT-PCR er nedregulert i A459 i forhold til HBEC. (B) (C) En western blot for å påvise fosforylerte MYPT1, NICD i celler. (D) (E) Anvendelse av forbindelse E blokker proliferasjonen av A459-celler som detektert ved en BrdU-inkorporering assay. Cellene ble behandlet med forbindelse E i en sluttkonsentrasjon på 5 nM og synkronisert ved serum uttømming etterfulgt av vekst i medier i 12 timer. Deretter ble cellene behandlet med BrdU i 30 minutter før de ble høstet for analyse. (F) og amp; (G) Transient overekspresjon av Rnd3 i A549-celler nedregulert NICD og Hes1 i et doseavhengig måte. Data representerer middel ± S.D. *
p
0,05 sammenlignet med kontrollgruppen (gruppe 0); #
p
0,05 sammenlignet med gruppe 1; $
p
0,05 sammenlignet med gruppe 3. Data representerer gjennomsnitt ± SD
Diskusjoner
Rnd3 tilhører Ras super og er en liten Rho GTPase som regulerer en rekke forskjellige cellefunksjoner og sykdommer. Det ble opprinnelig identifisert som en ROCK1 endogen inhibitor. Rnd3 binder seg til ROCK1 å inhibere nedstrøms signalisering [5]. Nylig har studier understreket den kritiske rollen Rnd3 i ulike typer kreft. Rnd3 er nedregulert i mange kreftformer, slik som leverkreft [10], [23], mesenchymale tumorceller [12], og prostatakreft [12]. Men i noen kreftformer, Rnd3 blir oppregulert, slik som i pankreastumorer [24], [25], tykktarmskreftcellelinjer [25] og noen melanomer [26]. Disse forskjellene tyder på at Rnd3 har spesifikke roller i ulike celle linjene. Interessant, som et gen svært knyttet til svulster, forskning på rollen Rnd3 i NSCLC er svært mangelfull. To studier viste at Rnd3 over-ekspresjon kan være forbundet med en ugunstig prognose i NSCLC [27], [28], mens den nøyaktige rolle av Rnd3 i NSCLC har ennå ikke blitt undersøkt. Rapporterte vi at Rnd3 er nedregulert i H358, H520 og A549-celler, og denne nedregulering fremmer veksten av disse to cellelinjer, og er avhengig av oppregulert Notch-signalering.
En av de fleste viktige strategier for herding kreft er hemming av tumor ukontrollert celleproliferasjon. Imidlertid er en mangel på spesifikk hemming er det store problem møter i klinikken. Å forstå den unike reguleringsmekanisme av cellesyklusen i kreftceller ville favorisere oppdagelsen av nye medikamenter og nye behandlinger for kreft. Rnd3 overekspresjon i fibroblaster hemmer S fase inngang ved å blokkere cyclin D1 uttrykk på post-transcriptional nivå [13]. I den samme studien, gjorde overekspresjon av cyclin D1 ikke redde Rnd3-mediert cellesyklus arrest, noe som tyder på at andre spillere er involvert i cellesyklus regulering. I prostatakreftceller, induserer ekspresjon Rnd3 cellene arrestert i G2 /M i stedet for i G1, som vist i fibroblaster, noe som tyder på at Rnd3 har evnen til å regulere cellesyklusutvikling i ulike faser [29]. Våre data viser at Notch /Hes1 signalering er kritisk i Rnd3 mangel-mediert vekst på H358, H520 og A549 celler. Dette funnet utvider forståelsen av Rnd3 funksjon i kreftcellesyklusregulering og gir også et potensielt mål for NSCLC behandling.
Rnd3 uttrykk er korrelert med celle migrasjon i utvikling og sykdommer. To nyere studier har funnet at Rnd3 regulert nevron migrasjon gjennom Rho Kinase avhengige signal [30], [31]. I mellomtiden i kreft, nedregulering av Rnd3 er nært forbundet med invasjon og metastasering [10], [23], [32]. Potensialet mekanismen kan også være gjennom RhoA /ROCK1 signalering. I denne studien viste vi at både NiCd- og Rho Kinase er aktivert i H358, H520 og A549 celler i forhold til HBEC. Gjeninnføring av Rnd3 hemmet både signalveier. Men hindrer bare Kjær signaliserer hemming hyper-vekst på H358 og H520 celler; Rho kinase hemming ikke. Videre studier for å undersøke regulering av tumorigenesis, migrasjon og tumorceller apoptose i respons til Rho kinase hemming ville være nødvendig og interessant.
Notch er en evolusjonært konservert transmembrane reseptor involvert i utvikling og sykdommer. Ved ligand stimulering, kan Notch spaltes ved γ-sekretase. Den intracellulære delen (NiCd) kan translocate inn i kjernen for å initiere transkripsjon. Tvunget ekspresjon av Notch en hemmet veksten av A549-celler i kultur [2]. Imidlertid har en uavhengig studie utfordret denne oppfatningen [33]. Mer nylig har en Notch en aktiverings mutant blitt funnet i omtrent 10% av NSCLC, og mutasjonene dratt en dårligere prognose hos pasienter [4]. Denne striden antyder, i det minste, at 1) funksjon av Notch 1 i NSCLC er diversifisert i ulike celler og ulike kreft stadier; 2) Notch1 uttrykk bør vurderes samtidig behandling av pasienter; 3) Vi må snarest forstå hvilken rolle Notch1 i NSCLC. I denne studien våre data indikerte at Notch signalisering er aktivert i H358 og H520-celler, og denne aktivering drev spredning av disse to cellene gjennom Hes1. Rnd3 kunne undertrykke H358, H520 og A549 celler spredning ved å motvirke Notch signalering i en post-translasjonell måte.
En nylig publisert studie fremhevet at Rnd3 var en nedstrøms formidler av Notch signalering i plateepitelkarsinom (SCC) i huden epithelia [34]. Disse forfatterne foreslo at Rnd3 er en transkripsjons mål av aktivert Notch1, og Rnd3 utarming undertrykker Notch signalering ved å formidle kjernefysisk translokasjon av NiCd gjennom et samspill med importins. I vår studie fant vi at Rnd3 overekspresjon trykt Notch signalering ved å blokkere NICD degradering. Disse avvik kan skyldes at 1) en annen cellelinje som ble benyttet ved undersøkelsen; 2) mer sannsynlig, disse to typer regulering sameksistere i celler, jobber som en feedback mekanisme til nøyaktig kontroll Notch signalering.
Uttrykk for Rnd3 uttrykkelig ble nettopp regulert i humane tumorvevet. Rnd3 ble oppregulert i tykktarmskreft sammenlignet med normal menneskelig kolorektal vev [35]. Mens nedregulering av Rnd3 var observasjon i human lever og tumorvev humane esophageal squamous cellekreft vev sammenlignet med de tilstøtende normale vev henholdsvis [11], [36]. Selv om forskjellige uttrykksmønster av Rnd3 ble funnet i forskjellige tumorer i mennesker, ble Rnd3 uttrykk nært forbundet med tumorcelle-proliferasjon, cellemigrering /metastase og diagnose /prognose. Gitt det faktum at Rnd3 ble nedregulert i NSCLC celler og nedregulering av Rnd3 fremmet NSCLC celler spredning, ville det være interessant og nødvendig å vurdere Rnd3 uttrykk i humane lungekreft vevsprøver.
Til sammen er vi den første gruppen til å rapportere at Rnd3 er nedregulert i H358, H520 og A549 celler, noe som resulterer i en hyper-aktivering av Notch og Rho Kinase signalering. Mekanistisk, regulerer Rnd3 spredning av H358, H520 og A549 celler gjennom NiCd /Hes1 signaliserer aksen.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Uttrykk for PDK1, en Rho Kinase aktivator, forblir uendret i H358 og H520 celler i forhold til HBEC celler.
