Abstract
B-celle-aktiverende faktor (BAFF) er et cytokin som tilhører tumor nekrose faktor (TNF) super. Det har blitt rapportert at BAFF er forhøyet hos pasienter med autoimmun pankreatitt og bidrar til ondartet potensialet i blod kreft og faste tumorer. I denne studien ble kliniske tegn på økt BAFF nivåer hos pasienter med bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) oppnådd, og hvilke roller og mekanismer for BAFF i PDAC ble avklart i menneskelige vev av PDAC og fra
in vitro
data av PDAC cellelinjer. Serumnivåer av BAFF hos pasienter med PDAC var betydelig høyere enn hos friske personer (p = 0,0121). Pasienter med UICC stadium IV PDAC (T1-4, N0-1, M1) hadde signifikant høyere nivåer av serum BAFF sammenlignet med pasienter med PDAC (p = 0,0182). BAFF er bemerkelsesverdig uttrykt i den infiltrerende B-lymfocytter som omgir kreft i bukspyttkjertelen i humane pankreatiske vev, tyder på at BAFF kan spille en rolle i progresjon av kreft i bukspyttkjertelen. PDAC cellelinjer ble dyrket med human rekombinant BAFF, og morfologi og gen-ekspresjon ble analysert; kreft i bukspyttkjertelen celler endret til en fibroblast-lignende morfologi, og viste endret genuttrykk av E-cadherin, vimentin og Snail. Disse BAFF-indusert forandringer reflektere forbedret cellemotilitet og invasjon. BAFF-R-overekspresjon celle kloner bekreftet sammenhengen mellom disse BAFF-induserte endringer og epitel-mesenchymale overgang (EMT) -relaterte gener. BAFF ble forhøyet hos pasienter med metastatisk avansert PDAC og induserte endringer i PDAC celler via regulering av EMT-relaterte gener. Opplysning av presise rolle og mekanismen for kontroll av BAFF kan føre til nye terapeutiske tilnærminger med sikte på å forbedre kreft i bukspyttkjertelen overlevelse
Citation. Koizumi M, Hiasa Y, Kumagi T, Yamanishi H, Azemoto N, Kobata T, et al. (2013) Økt B Cell-Activating Factor Fremmer Tumor invasjon og metastasering i Human kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE åtte (8): e71367. doi: 10,1371 /journal.pone.0071367
Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 14 januar 2013; Godkjent: 28 juni 2013; Publisert: 6. august 2013
Copyright: © 2013 Koizumi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av en Grant-in-Aid for Scientific Research (Japan Society for Promotion of Science, KAKENHI 24590980 til YH) og Program for Styrking systematisk opplæring i Graduate School (til MK) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi, Japan, og etter en Grant-in-Aid for Scientific Research and Development (til YH) fra japanske helse-, arbeids- og velferds, Japan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en av de kreft med dårligst prognose hos mennesker. Den 5 års overlevelse av kreft i bukspyttkjertelen er bare omtrent 6% på grunn av vanskeligheten med å diagnose i tidlige kliniske faser, så vel som til hyppige metastaser [1], [2]. Nylig har nye behandlingsalternativer blitt rapportert; imidlertid behandlingstilbud er begrenset, og responsen på cellegift forblir lav [3], [4]. Identifisering av nye mål for kreft i bukspyttkjertelen kan forbedre prognose.
Det er nylig blitt rapportert at B-celle-aktiverende faktor (BAFF), et proinflammatorisk cytokin, er forhøyet hos pasienter med autoimmun pankreatitt [5]. BAFF er et cytokin som tilhører en undergruppe av tumornekrosefaktor (TNF) superfamilien. I en tidligere eksperiment der serumnivåer av BAFF ble undersøkt hos pasienter med bukspyttkjertelkreft [5], pasienter med metastaser syntes å ha økte nivåer av BAFF.
BAFF er en 285-aminosyre peptid glykoprotein som uttrykkes som et transmembranprotein, og blir utskilt i en oppløselig form fra forskjellige celletyper (monocytter, dendrittiske celler, T-lymfocytter og B-lymfocytter) [6] – [8]. Det er kjent å være assosiert med overlevelse og modning av B-lymfocytter. BAFF er en ligand for tre reseptorer: BAFF-reseptor (BAFF-R) [9]; transmembrane aktivator, kalsium-modulator, og cyklofilin ligand Interactor (taci) [10]; og B-cellemodning antigen (BCMA) [11]. Videre, et protein som ligner på BAFF, kalt en spredning-induserende ligand (april) [12], kan være en ligand av Taci og BCMA. Binding av BAFF eller april til disse reseptorene kan aktivere ulike signalveier, inkludert nukleær faktor-kB (NF-kB) veien [13] – [15]. Det har blitt rapportert at BAFF og april bidrar til ondartet potensialet i blod kreft og faste tumorer [16] – [18]. Men rollene til BAFF, APRIL, og deres reseptorer i kreft i bukspyttkjertelen er ennå ikke klarlagt.
I denne studien, kliniske tegn på økt BAFF nivåer hos pasienter med bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) ble oppnådd, og rolle og mekanismen for BAFF i PDAC ble avklart fra klinisk dokumentasjon og fra
in vitro
data fra PDAC cellelinjer.
Materialer og metoder
Pasienter og bukspyttkjertel prøver
Serumprøver prøver~~POS=HEADCOMP ble undersøkt fra 44 pasienter med PDAC og sunn alders- og kjønns matchet fag. For diagnostisering av iscenesettelse, ble svulsten metastaser system of the Union for International Cancer Control (UICC) som brukes. Alle serumprøver ble lagret ved -80 ° C før bruk. Eksemplarer av PDAC ble oppnådd fra pasienter som gjennomgikk kirurgi. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle registrerte deltakere. Studieprotokollen dannet de etiske retningslinjene i 1975 Helsinkideklarasjonen, og ble godkjent av Institutional Review Board of Ehime universitetssykehus (godkjenningsnummer: 1107003). Denne studien omfatter mennesker prøver ble registrert i Universitetssykehuset Medical Information Network (Umin) Clinical Trials Registry (registreringsnummer 000 008 654).
Enzyme-linked immunosorbent assay for Baff og april
Serum nivåer av BAFF og april i alle fag ble analysert ved hjelp av en enzymbundet immunosorbent analysen kit (R E) og immunhistokjemisk farging teknikker. Parafininnstøpte prøver ble avvokset og rehydrert, og deretter antigener ble hentet ved autoklavering i 1 minutt ved 125 ° C i EDTA-buffer (pH 9,0). Endogen peroksidaseaktivitet ble inaktivert ved inkubering med metanol inneholdende 1% hydrogenperoksidase i 20 min. Seksjonene ble deretter inkubert i 1% blokkerende serum i 30 minutter for å redusere ikke-spesifikke reaksjoner. For immunhistokjemi, ble seksjonene inkubert med den aktuelle primære antistoff (tabell S1) ved 4 ° C over natten. Vevssnittene ble behandlet med peroksidase-merket sekundært antistoff (Histofine Simplestain Max PO, Nichirei, Tokyo, Japan) i 1 time ved romtemperatur, og inkubert med enkle Stain DAB-løsning (Nichirei). Photomicrographs ble tatt med et Nikon Microphot FXA med et Nikon digitalkamera DXM 1200 (Nikon, Tokyo, Japan).
For immunfluorescens farging, montert og formalinfiksert seksjoner ble brukt. Seksjoner ble inkubert med den aktuelle primære antistoff (tabell S1) ved 4 ° C over natten. Etter vasking med fosfatbufret saltløsning, ble seksjonene inkubert med DyLight488-konjugert esel anti-geit-antistoff for BAFF eller BAFF-R, og med DyLight549-konjugert esel-anti-muse-antistoff for CD20. Kjerner av seksjonene ble farget med 4,6-diamidino-to-phenylindole (Wako, Osaka, Japan). Lysbilder ble avbildes med en Zeiss Axioskop 2 Plus fluorescens mikroskop og fanget av en Zeiss AxioCam HRc digitalt kamera (Zeiss, Tokyo, Japan) og lagres på en datamaskin. Fotografiene farget for BAFF, BAFF-R og CD20 ble slått sammen for å evaluere deres plasseringer i cellene.
Cells og kultur vilkår
Fire bukspyttkjertelkreft cellelinjer (Panc-1, BxPC-3 , ASPC-1 og MIA PACA-2-celler), som opprinnelig ble samlet inn fra pasienter med PDAC, og Ramos-celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Den PANC-1 og MIA PACA-2-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (Life Technologies) og 1% penicillin. BxPC-3, ASPC-1 og Ramos-celler ble dyrket i RPMI-1640 supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin. Microphotographs ble oppnådd etter ulike behandlinger på en invertert mikroskop (Olympus IX70, Olympus, Tokyo, Japan) er utstyrt med et Olympus DP12 digitalkamera. Etter å være serum sultet i 24 timer, ble celler inkubert med rekombinant BAFF (Reliatech, Braunschweig, Tyskland) og rekombinant TGF-β (R 0,05 basert på en to-halet test. Sammenhenger mellom to variabler ble evaluert ved hjelp av Pearsons korrelasjonskoeffisienten, og p-verdier på. 0,05 ble ansett å representere statistisk signifikans
Resultater
Serum nivåer av BAFF hos pasienter med avansert PDAC
Serum nivåer av BAFF og april ble undersøkt hos pasienter med PDAC og sunn alders- og kjønns matchet fag (tabell 1). Serumnivåer av BAFF var 1704 ± 1409 pg /ml (gjennomsnitt ± SD) hos pasienter med PDAC, betydelig høyere enn hos friske forsøkspersoner (1147 ± 315 pg /ml, p = 0,0121) (Fig. 1a). På den annen side er serumnivået av april i pasienter med PDAC ikke var betydelig høyere enn hos friske forsøkspersoner (henholdsvis 7,7 ± 2,4 vs. 7,3 ± 2,2 pg /ml,; p = 0,895) (fig 1B.). Økningen i serumnivåer av BAFF ble evaluert ved UICC stadium. Pasienter med UICC stadium IV PDAC (T1-4, N0-1, M1) hadde betydelig høyere nivåer av serum BAFF enn pasienter med UICC stadium Ib-III (2063 ± 1736 vs. 1186 ± henholdsvis 328 pg /ml; p = 0,0182) (fig. 1C). Den kliniske bakgrunn av pasientene i hvert trinn er angitt i tabell 2. Når det gjelder forholdet mellom serumnivåene av BAFF og PDAC tumorstørrelse, var det en signifikant positiv korrelasjon, som vist på fig. 1D (r = 0,348, p 0,001). Dette antydet at økningen i serumnivåer av BAFF var assosiert med tumorvekst og metastasering av PDAC.
(A) Serumnivåene av BAFF ble bestemt hos pasienter med PDAC (n = 44) og hos friske personer (n = 44). (B) Serumnivåene av april ble bestemt hos pasienter med PDAC (n = 44) og hos friske personer (n = 44). (C) Serumnivåer av BAFF og UICC stadium av PDAC er indikert. (D) Serumnivåene av BAFF og kreft størrelser av primær PDAC var signifikant korrelert i 44 pasienter (p 0,001). Data er vist som gjennomsnitt ± SD (* p 0,05). n.s .; ikke signifikant.
Uttrykk for BAFF og BAFF-R i menneskelig PDAC vev
immunhistokjemi eksperimenter ble utført for å bestemme hvorvidt BAFF er uttrykt i bukspyttkjertelen vev. Bukspyttkjertelen vev fra kirurgiske arter hentet fra pasienter med PDAC var farget for BAFF og BAFF-R (fig. 2 og 3). Tumor-infiltrerende immunceller som omgir PDAC cellene ble funnet å uttrykke bemerkelsesverdig BAFF og BAFF-R (fig. 2). Ytterligere farging av CD20 (en markør av B-lymfocytter), CD3 (T-celle-reseptor, en markør for T-lymfocytter) og CD68 (en markør av monocytter /makrofager) ble utført for å identifisere deres typer av infiltrerende celler som uttrykker BAFF eller BAFF-R. Fordelingen av BAFF- og BAFF-R-positive celler viste seg i overensstemmelse med fordelingen av B-lymfocytter, snarere enn for T-lymfocytter eller monocytter /makrofager (Fig. 2). Nylig er det blitt vist at B-lymfocyttene kan utskille BAFF [7], [8], [16]. Dobbel immunofluorescens farging med BAFF og CD20, CD3, CD68 (Fig. 3A) og farging med BAFF-R og CD20, CD3, CD68 (Fig. 3B) ble utført. Fordelingen av BAFF (grønn) og CD20 (rød) ble slått sammen og dukket gul (fig. 3A). Videre er fordelingen av BAFF-R (grønn) og CD20 (rød) ble også slått sammen og først gul (Fig. 3B). Men fordelingen av BAFF og BAFF-R ble ikke samlokalisert med CD3 eller CD68. Disse resultatene tyder på at B-lymfocytter som uttrykker høye nivåer av BAFF og BAFF-R, er i infiltrat og proliferere i vevet som omgir PDAC
(A) farging med hematoxylin og eosin. (H E) og immunhistokjemi av BAFF, BAFF-R, CD3, CD20 og CD68 i PDAC og omkringliggende vev er vist. Første Ab (-) indikerer farging kontroll uten først antistoff. B-lymfocytter i vevet som omgir PDAC hadde en bemerkelsesverdig høy grad av BAFF uttrykk. Forstørrelse som angitt over hver mikrofotografiet. Skala barer representerer 200 mikrometer under lavt forstørrelse (x40), og 50 mikrometer under høyt forstørrelse (x200 og × 400).
(A) immunfluorescens farging med BAFF (grønn), og CD20, CD3, CD68 (rød) er vist. Den sammenslåtte bildet er vist som «flette». Uttrykk for BAFF og CD20 ble samlokalisert (gul); Men BAFF og CD3 eller CD68 ble ikke samlokalisert. (B) Immunofluorescens farging med BAFF-R (grønn) og CD20, CD3, CD68 og (rød) er vist. Uttrykk for BAFF-R og CD20 ble samlokalisert (gul); Men BAFF-R og CD3 eller CD68 ble ikke samlokalisert. Først Ab (-) indikerer flekker kontroll uten den første antistoffet
Uttrykk av BAFF reseptorer i menneske PDAC vev og menneskelige PDAC cellelinjer
For å undersøke uttrykket av BAFF reseptorer. i PDAC, ble immunhistokjemi utført på PDAC vev oppnådd fra pasienter, samt på humane PDAC cellelinjer. BAFF-R ble uttrykt i PDAC celler, som hadde positive signaler av MIB-1 og CA19-9 (fig. 4A, venstre kolonne). Men andre BAFF reseptorer (Taci og bcm per år) ble ikke uttrykt i PDAC-celler (fig. 4A, høyre kolonne). De menneskelige PDAC cellelinjer, Panc-1, BxPC-3, ASPC-en, og MIA PACA-2, ble brukt til
in vitro
studier. Kvalitativ RT-PCR for genuttrykket av BAFF-R, Taci, og BCMA avslørte bare uttrykk for BAFF-R (fig. 4B). Ramos-celler, som er kjent som et vev som uttrykker BAFF-R, taci og BCMA, ble anvendt som en positiv kontroll [21]. Dessuten ble Western blotting utført for å evaluere protein ekspresjon av disse BAFF-reseptorer (fig. 4C). Uttrykk for BAFF-R ble bekreftet i alle de PDAC cellelinjer, men uttrykk for Taci og BCMA kunne ikke påvises. Samlet utgjør disse resultatene viste at økte nivåer av BAFF resultat av den infiltrerende og prolifererende B-lymfocytter omliggende PDAC vev; disse økte nivåer av BAFF kan stimulere PDAC gjennom BAFF-R signalisering. Å identifisere hvilken rolle BAFF i PDAC, en
in vitro
analysen ble utført ved hjelp av PANC-en PDAC cellelinje, sin klonet transfektant av BAFF-R, og rekombinant humant BAFF for videre analyse.
(A) farging med hematoxylin og eosin (H E) og immunhistokjemi av MIB-1, er CA19-9, BAFF-R, Taci og BCMA i PDAC vist. Første Ab (-) indikerer farging kontroll uten det første antistoffet. Forstørrelse er som angitt ovenfor hver mikrofotografiet. Skala barer representerer 200 mikrometer under lavt forstørrelse (x40), og 50 mikrometer under høyt forstørrelse (x400). (B) Kvalitativ RT-PCR-analyse av BAFF-reseptorer i PDAC cellelinjer. GAPDH er indisert som en husholdningsgenet. RNA isolert fra Ramos celle ble anvendt som en positiv kontroll. N.C. er en negativ kontroll uten prøve. (C) Western blot-analyse av BAFF-reseptorer i PDAC cellelinjer. β-aktin er indisert som en rengjøring protein. Ramos celle ble anvendt som en positiv kontroll. NC er en negativ kontroll uten prøven.
BAFF induserer EMT i en PDAC cellelinje
I
in vitro
analysen, cellen morfologi PANC-en ble observert å forandre seg etter tilsetning av rekombinant humant BAFF til kulturmediet (fig. 5A). Cellene syntes å ha en mer fibroblast-lignende (spindel type) morfologi og viste redusert celle-celle-kontakt. Disse morfologiske forandringer var tilsvarende endringer sett med TGF-β behandling. Fra dette resultatet, ble det en hypotese om at økt BAFF kan indusere endringer i gener knyttet til epiteliale-mesenchymale overgang (EMT) i PDAC celler. PANC-1 isoleres fra udifferensierte PDAC vev [22] og er positivt for den epiteliale markør E-cadherin og mesenchymale protein vimentin. Således PANC-1 ble anvendt som en modell av en PDAC celle som fortsatt har en epitelial potensial. Analyse for endret ekspresjon av representative gener relatert til EMT ble utført ved tilsetning av human rekombinant BAFF til kulturmediet. En betydelig nedregulering av E-cadherin mRNA, samt betydelig oppregulering av vimentin og snegle mRNA, ble observert på en doseavhengig måte med BAFF (Fig. 5B). GAPDH mRNA ble anvendt som en husholdningsgenet for kvantitativ PCR, og det ble bekreftet at nivået av GAPDH mRNA ble ikke endret ved behandling med BAFF (fig. S1). Western blotting resultater for disse molekylene var lik resultatene av sanntids RT-PCR (fig. 5C). De BAFF-induserte endringer i PDAC cellene var lik endringer sett i løpet EMT. Økt BAFF i PDAC kunne fremme genet endringer forbundet med EMT gjennom en reduksjon av E-cadherin og en økning i vimentin via snegle signalveier.
(A) Det cellulære morfologi PANC-1-celler endres etter tilsetning av BAFF til supernatanten. TGF-β ble anvendt som en positiv kontroll. På samme måte som TGF-β, tilsetning av BAFF forårsaket morfologien av PANC-1 celler til å bli spindel lignende. (B) Analyse av real-time RT-PCR for EMT markører (E-cadherin, vimentin og Snail) er indikert. Disse gener ble modulert på en doseavhengig måte med BAFF. Data er vist som gjennomsnitt ± SE av fire separate forsøk (* p 0,05 vs. BAFF 0 ng /ml). (C) Western blotting-analyse av EMT markører indikerer at ekspresjon av hvert protein ble modulert ved tilsetning av BAFF. β-aktin er vist som en rengjøring protein.
Behandling med humant rekombinant BAFF og motilitet og invasjon av PDAC celler
I forbindelse med morfologiske endringer, ble det foreslått at BAFF induserer EMT i PDAC. Disse resultatene blir bedt studium av de andre virkninger av BAFF, som motilitet og invasjon. PANC-1-celler ble inkubert med human rekombinant BAFF, og forandringer i motilitet ble evaluert med sårheling /ripetest. Behandling med BAFF øker motiliteten av PANC-1-celler og resulterte i hurtigere lukking av sår (p 0,01) (figur 6A og 6B.). Videre behandling med rekombinant humant BAFF betydelig forbedret evne til cellene til å invadere den ekstracellulære matriks
in vitro plakater (fig. 6C).
(A) sårheling /ripetest indikerte at motilitet av PANC-1-celler ble forbedret ved 24 timers inkubering med BAFF. (B) Den prosentvise sårede område som er fylt i sårheling /skrapetesten er vist som en kurve (* p 0,01 vs. BAFF 0 ng /ml). (C) Et invasjon analysen viser forbedringen av invasjon med BAFF i PANC-1-celler (* p 0,05 vs. BAFF 0 ng /ml). (D) sårheling /ripetest med nøytraliserende anti-BAFF-R-antistoff viste at motiliteten av PANC-1-celler med BAFF ble inhibert med antistoffet. (E) Den prosentvise sårede område som er fylt i sårheling /skrapetesten er vist som en graf. Data er vist som gjennomsnitt ± SE av seks separate forsøk (* p 0,05, ** p 0,01).
Ytterligere analyser ble utført ved anvendelse av anti-humant BAFF-R-antistoff, som kan hemme binding av BAFF å BAFF-R [23]. Under tilsetning av rekombinant humant BAFF til supernatanten av de dyrkede celler, fylte prosent sårede område økt betraktelig (15,1 ± 2,3 vs. 27,2 ± 2,3; p 0,01). Under tilsetning av både human rekombinant BAFF og anti-humant BAFF-R-antistoff, ble sårlukking redusert i betydelig grad sammenlignet med tilsetning av kontroll geite antistoff (27,2 ± 2,3 vs. 20,9 ± 2,4; p 0,05) (Fig. 6D og 6E ). Disse dataene antyder at BAFF stimulering forårsaket økt motilitet og invasjon av PANC-1 celler.
BAFF-R-overekspresjon celle kloner og uttrykk av EMT-relaterte gener
Fire celle kloner som kan overuttrykker BAFF -R ved transfeksjon med et plasmid (pBCMGS-BAFF-R) [20] og valg av dyrkning med G418 ble etablert. Overekspresjon av BAFF-R ble bekreftet i disse cellekloner ved hjelp av Western blotting og FACS-analyse (fig. 7A og S2). Funksjonell signalering av transduserte BAFF-R i disse cellekloner ble bekreftet ved inkubering med BAFF (fig. S3). Øket ekspresjon av NF-kB P52-proteinet ble sett på Western blotting, noe som indikerer at NF-kB veien ble aktivert ved overekspresjon av BAFF-R; Dette aktivering av NF-kB sti ble også reflektert i redusert uttrykk av E-cadherin og økt uttrykk av vimentin og Snail i disse kloner. Disse forandringer var lik resultatene av analysen med rekombinant humant BAFF.
Fire PDAC cellekloner, som kan overuttrykker BAFF-R ved transfeksjon med et plasmid (pBCMGS-BAFF-R), ble etablert. (A) I de fire kloner ble det overekspresjon av BAFF-R bekreftet, og proteiner forbundet med EMT ble funnet å være modulert i et BAFF-R-nivå-avhengig måte. (B) mRNA-nivåene av hvert gen ble evaluert med sanntids-RT-PCR. Data er vist som gjennomsnitt ± SE av fire separate forsøk (* P 0,05, ** P 0,01 vs. PANC-1). (C) Et sårheling /ripetest indikerte at motiliteten av disse cellekloner ble forbedret sammenlignet med den opprinnelige PANC-1. (D) Den prosentvise sårede område som er fylt av hver klon i sårheling /skrapetesten er vist som en graf. Data er vist som gjennomsnitt ± SE av seks separate forsøk (* p 0,05, ** p 0,01 vs. PANC-1).
Videre uttrykk for mRNA ble evaluert ved hjelp av real-time RT -PCR (fig. 7B). En reduksjon i E-cadherin mRNA ble observert i alle de BAFF-R-overuttrykkende cellekloner, mens en økning i vimentin og sneglen mRNA ble observert i de fleste av cellekloner. Motilitet av cellekloner ble bekreftet å være signifikant høyere enn den til ikke-BAFF-R-transfiserte PANC-1-celler på sårheling /skrapetesten (Fig. 7C og D). Tatt sammen med resultatene fra cellekloner, ble det bekreftet at stimulering med BAFF induserer genet endringer i forbindelse med EMT i PDAC celler.
Diskusjoner
Dette er den første studien som rapporterer at serumnivåer av BAFF er forhøyet hos pasienter med PDAC, og den første studien for å undersøke hvilken rolle BAFF i menneskelig PDAC. I denne studien ble det avslørt at: i) serumnivåer av BAFF hos pasienter med PDAC (særlig i de med metastase) ble forhøyet sammenlignet med friske personer ii) tumor-infiltrerende B-lymfocytter uttrykt BAFF og PDAC vev uttrykt BAFF-R; og iii) øket BAFF-induserte genet endringer var assosiert med EMT i en PDAC cellelinje, og med forbedret tumorcelle motilitet og invasjon.
BAFF er kjent for å bli uttrykt ved hjelp av monocytter, dendrittiske celler, T-lymfocytter, B lymfocytter, epitelceller og [6] – [8], [24], [25]; men dens nøyaktige uttrykk profilen hos pasienter med PDAC er ikke blitt definert tidligere. Nylig, Nakajima et al. viste gjennom immunhistokjemi at BAFF-uttrykker B-lymfocytter infiltrere synovial vev av revmatoid artritt [26]. Flertallet av infiltrere celler i vevet rundt PDAC i denne studien var BAFF-uttrykke B-lymfocytter. Videre har mange av disse B-lymfocytter også uttrykkes BAFF-R. Fra disse resultater kan det infiltrerende BAFF-uttrykkende B-lymfocytter anses for å ha en viktig rolle i oppregulering av BAFF i PDAC pasienter. Den økte BAFF har trolig en rolle i utviklingen av PDAC, fordi serumnivåer av BAFF ble bemerkelsesverdig oppregulert i pasienter med avansert PDAC. BAFF produsert fra disse B-lymfocytter kan også ha en viktig rolle i overlevelse, aktivering, og spredning av infiltrerende B-lymfocytter rundt PDAC.
BAFF tilhører TNF super, og er nært knyttet til april. Begge har en viktig rolle i aktivering og proliferasjon av B-lymfocytter. BAFF binder seg til alle tre BAFF reseptorer (BAFF-R, bcm per år og Taci), mens april binder seg til to av dem (BCMA og taci). I denne studien ble det bare serumnivåer av BAFF (ikke april) signifikant oppregulert hos pasienter med PDAC, og bare uttrykk for BAFF-R kunne påvises i PDAC vev. Således, rollen av BAFF og BAFF-R i PDAC ble videre utforsket. En av de viktigste BAFF-indusert mekanismer er aktivering av NF-kB. Det har blitt rapportert at BAFF-R aktiverer NF-kB-induserende kinase (NIK), og at aktivering av NIK induserer behandling av transkripsjonsfaktoren NF-κB2 P100 til NF-κB2 P52 [27], [28]. Korrelasjonen mellom aktiveringen av NF-kB og ekspresjon av sneglen er tidligere blitt rapportert [29]. NF-kB synes å ha en viktig rolle i induksjon av EMT
EMT er det fenomen som epitelceller konvertere til mesenchymale celler.; det er grunnleggende for embryoutvikling og innebærer dype fenotypiske endringer inkludert tap av celle-celle adhesjon og celle polaritet og oppkjøp av trekkende og invasive egenskaper [30]. I tidligere rapporter har EMT vært preget av oppkjøpet av en spindel-lignende /fibroblastisk morfologi, oppregulering av mesenchymale markører som vimentin, og nedregulering av epitel markør som E-cadherin [31], [32]. Snegl har vært ansett for å være en årsak til EMT gjennom nedregulering av ekspresjonen av epitel-markører og oppregulering av ekspresjonen av mesenchymale markører [33]. Disse molekylene ble oppregulert ved BAFF i PDAC celler; nedregulering av E-cadherin og oppregulering av vimentin ble også observert i disse cellene.
Fra dagens resultater, foreslås det at BAFF og BAFF-R signalise induserer EMT i PDAC celler (Fig. 8). PDAC celler modulert av økt BAFF viser en spindel-formet morfologi, mister celle-celle adhesjon og celle polaritet, og få muligheten til cellemotilitet og invasjon. Det er allment akseptert at E-cadherin spiller en avgjørende rolle i EMT, en tidlig hendelse i kreftcelle invasjon og metastasering [34]. EMT er ansett for å være en viktig hendelse i løpet av malign tumorprogresjon og metastase [35], [36].
