Abstract
De fleste menn diagnostisert med prostatakreft vil ha en lat og helbredelig sykdom, mens ca 15% av disse pasientene vil raskt utvikle seg til en kastrere bestandige og metastatisk scenen med høy sykelighet og dødelighet. Derfor identifisering av molekylær signatur (er) som gjenkjenner menn i fare for progredierende sykdom er fortsatt et presserende og fortsatt udekket behov for disse pasientene. Her brukte vi en integrert oppdagelse plattform kombinerer prostatakreftcellelinjer, en transgen Adenokarsinom i Mouse Prostata (TRAMP) modell og klinisk-merkede prøver menneskelig vev for å identifisere tap av uttrykk av mikroRNA-34b som konsekvent assosiert med prostatakreft tilbakefall. Mekanistisk dette var forbundet med epigenetikk stanse av den MIR34B /C-locus og økt DNA-kopi antall tap, selektivt i androgen-avhengig prostata kreft. I sin tur, tap av MIR-34b resulterte i nedstrøms deregulering og overekspresjon av «stemness» markør, Sox2. Disse funnene identifisere tap av Mir-34b som en robust biomarkør for prostatakreft progresjon i androgen-sensitive svulster, og forventer en potensiell rolle stamfar /stamcellesignalering i denne fasen av sykdommen
Citation. Forno I, Ferrero S, Russo MV, Gazzano G, Giangiobbe S, Montanari E, et al. (2015) Deregulering av MiR-34b /Sox2 Spår Prostate Cancer Progresjon. PLoS ONE 10 (6): e0130060. doi: 10,1371 /journal.pone.0130060
Academic Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTERRIKE
mottatt: 16 februar 2015; Godkjent: 15 mai 2015; Publisert: 24 juni 2015
Copyright: © 2015 Forno et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data inneholdes i papiret, og i tilleggsinformasjon filer. Dessuten har TLDA matrise rådata vært inkludert i saksdokumenter
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Fondazione Cariplo med pris n. 2010-0846 (SB) (https://www.fondazionecariplo.it/it/index.html) og National Institutes of Health gir CA140043 (til LRL og DCA) og CA190027 (til DCA) (http: //tilskudd .nih.gov /tilskudd /oer.htm). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den vanligste diagnosen visceral malignitet blant menn over hele verden. I USA, PCA står for 26% av totalt antall nye krefttilfeller og 9% av de totale kreftrelaterte dødsfall, ranking andre til lungekreft. Sannsynligheten for å utvikle prostatakreft fra fødsel til død er en i 7, med høyest forekomst hos menn over 70 år [1]. Selv om de fleste menn diagnostisert med prostatakreft vil ha en lat og kureres klinisk forløp, vil ca 15% av disse pasientene viser et raskt fremover, behandlingsresistent og metastatisk sykdom til bein og viscerale organer med høy sykelighet og dødelighet [2]. Som noen pålitelig metode for å identifisere pasienter med risiko for metastatisk spredning er for tiden tilgjengelig [3], til jakten på molekylær signatur (er) for sykdomsutvikling, spesielt overgangen kastrere-motstand [4] er et presserende og fortsatt i stor grad udekket medisinsk behov administrerer en prostata kreft diagnose.
microRNAs (mirnas) er små, ikke-koding, endogene RNA med pleiotrope funksjoner i genuttrykk [5,6]. Denne veien er dramatisk utnyttes på kreft, og en rekke mirnas har vært knyttet til deregulerte onkogene eller tumor-suppressor-trasé [7,8]. Gjensidig, driverne av malignitet, inkludert DNA-avvik, transkripsjonen deregulering og epigenetikk lyddemping bidra til avvikende miRNA uttrykket [9,10]. For deres stabilitet i biologiske væsker [11], og relativ enkel deteksjon i kliniske prøver [12], mirnas har blitt forfulgt som tumor biomarkører [8], for deres potensial prediktiv eller prognostisk verdi hos pasienter med brystkreft [13], lever [ ,,,0],14,15], eller lunge [16] kreft. Deregulert miRNA ekspresjon er også blitt observert i prostata cancer, sammenlignet med normal epitel [17-19], og i noen tilfeller forbundet med metastatisk spredning [20-22], men definitiv signatur (r) for sykdomsprogresjon, spesielt kastrering-motstand, har ikke blitt identifisert.
i denne studien brukte vi en integrert oppdagelse plattform kombinere etablerte cellelinjer, en genetisk musemodell for sykdomsutvikling, og primære pasientprøver for å profilere differensial miRNA uttrykket i prostatakreft.
Materialer og metoder
kliniske prøver
De kliniske og patologiske parametere av PCA pasienter eller benign prostatahyperplasi (BPH) undersøkt i disse studiene er beskrevet i Tabell 1. Globalt hentet vi arkiv vev og kliniske poster fra 192 pasienter som gjennomgikk kirurgi 2004-2006 på San Paolo sykehus eller Fondazione IRCCS Ca «Granda sykehus i Milano (Italia), under en protokoll godkjent av Institutional Review Boards (IRB) fra San Paolo Hospital (kode 10664 ) og Fondazione IRCCS Ca «Granda-Ospedale Maggiore Policlinico (kode 1381 til 1311). På grunn av den retrospektive natur denne studien og bruk av data anonymiserings praksis, ble behovet for skriftlig informert samtykke fravikes. Oppfølging bestod i aktiv overvåking av pasientene ved suksessiv måling av serum prostata-spesifikt antigen (PSA) nivåer. For PCA pasienter ble biokjemisk tilbakefall definert som to påfølgende PSA nivåer høyere enn 0,2 ng /ml
For molekylære analyser tilfeller må hatt tilfredsstillende RNA innholdet (260/280 ekstinksjonsforhold . 1.2 og 2,1 og 500 ng total-RNA) i det minste i en avstemt normalt og tumor prostata prøve pr pasient. Seksti-seks pasienter av de 192 vurderte fornøyd disse kriteriene og for femti av disse også prostata intraepitelial neoplasi (PIN) lesjon var tilgjengelig. Derfor sorteres vi pasienter i en første delmengde med fullstendig tilgjengelighet av normale, PIN og PCA vev (n = 50, serie A, tabell 1), og i en annen undergruppe bestående av de gjenværende pasienter med bare passet normale og tumorprøver (n = 16, serie B, tabell 1). Epitelvev for normal prostata, PIN og PCa ble separat hentet av punching arkiv blokker med en nål diameter 1 mm som beskrevet [23]. Hver prøve konsekvent over 80% renhet i epiteliale celleinnhold. Normalt vev prøvetaking ble utført ved en avstand på minst 2 cm fra neoplastisk vev. Komplett sett med pasienter inkludert i studien (n = 192, serie C, tabell 1). Ble brukt til å bygge seksten vev mikro arrays (TMA) blokker [24] for immunhistokjemiske evalueringer
BPH prøver (n = 10) var pasienter som gjennomgikk transurethral reseksjon av prostata (TURP) på Fondazione IRCSS Ca «Granda Hospital (Milan) for hvem prostatahyperplasi kartlegging var negativ for PCa og fulgt opp i minst 3 år (serie BPH, Tabell 1). Denne serien ble ikke inkludert i TMA-plattformen og full vevssnitt ble brukt til enten molekylære eller immunhistokjemiske analyser.
Cellelinjer
Menneskelige prostata cellelinjer RWPE-en, BPH-en, LNCaP, DU145 og PC3-celler ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Den normale cellelinje RWPE-1 ble dyrket i keratinocytt serumfritt medium supplert med 5 ng /ml EGF, 0,05 mg /ml bovint hypofyseekstrakt, og 1% Pen-Strep antibiotika cocktail. Alle andre cellelinjer ble dyrket i RPMI supplert med 10% FBS og 1% Pen-Strep. Cellekulturer ble holdt ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator. For miRNA transfeksjon, ble cellene sådd ut ved en 5×10
5 per brønn i seks-brønners plater, og transfektert med 150 pmol av MIR-34b-inhibitor (a-MIR-34b, HSTUD0511), eller MIR-34b forløper (p- miR34b; HMI0511), eller tilsvarende ikke-targeting sekvenser (en-Ctrl eller p-Ctrl, henholdsvis HMC0002 og NCSTUD001) i nærvær av Lipofectamine 2000 (Livet Technologies Inc., Carlsbad, CA, USA), som beskrevet [25]. Alle miRNA molekyler var fra Sigma Aldrich, Milano, Italia.
Laser-assistert mikrodisseksjon av prostata lesjoner fra transgene Adenokarsinom i Mouse Prostata (tramp) mus
Arkiv vevsblokker av urogenitaltractus, inkludert blære, sædblærene og prostata fra fem Tramp mus ble brukt [26,27]. Alle musene hadde utviklet prostatatumorer og ble avlivet ved 24 ukers alder. Alle dyreforsøk har blitt gjennomgått og godkjent av en Institutional Animal Care og bruk komité ved Thomas Jefferson University. Ubehag og skader på dyr har vært begrenset til det som er uunngåelig i gjennomføringen av vitenskapelig verdifull forskning. Alle eksperimentelle prosedyrer utført som en del av denne studien i samsvar med godkjente protokoller for å sikre de høyeste standarder i human omsorg til dyrene. Analgetika, anestetika og tranquilizing narkotika har blitt brukt som bestemt av veterinær ansatte. Eutanasi er utført ved CO
2 anestesi. Denne metoden er i tråd med anbefalingene fra 1316 Panel of Avliving av American Veterinary Medical Association
Prostata prøver fra Tramp mus ble beriket i PIN eller prostatasvulster (S1 Fig) av laser-assistert mikrodisseksjon (LMD.; Leica Microsystems, Milano, Italia) av epiteliale lesjoner, som beskrevet [28]. For miRNA profilering, PCA eller PIN vev fra ulike dyr (n = 5 per gruppe) ble slått sammen.
RNA rensing, retrotranscription og mikroRNA profilering
Total RNA ble isolert ved hjelp av MasterPure RNA Purification Kit (Epicentre Bioteknologi, Madison, WI, USA), som beskrevet [28], og retrotranscribed hjelp av Megaplex RT-primere menneske eller Gnagere bassenger A og B v3.0 og Taqman mikroRNA Reverse Transcription kit. Murine prøvene var pre-forsterket ved hjelp av Megaplex PreaAmp primer Gnagere bassenger A og B. menneske eller gnager TaqMan low-density arrays (TLDA) ble deretter utført for miRNA profilering i prostatakreftcellelinjer eller tramp prostata vev, henholdsvis. Menneskelig TLDA omfatter 754 mirnas og 4 endogene nukleolære RNA (RNU44, RNU48 og U6snRNA), mens gnagere TLDA omfatter 750 mirnas og 6 kontroll RNA, hvorav 675 miRNAs og tre endogene kontroller (snoRNA135, snoRNA202 og U6snRNA) er spesifikke for mus. Både mennesker og gnagere plattformen inkluderer en negativ kontroll sonde (ATH-MIR-159a) per kort. For validering, atten valgt mirnas pluss referanse transkripsjoner (U6snRNA, RNU48, RNU44, og RNU24) og to negative kontroller (ATH-MIR-159a og et godt uten påvisning probe) ble analysert i humane prøver (serie A, B og BPH; Table 1) å bruke en tilpasset RT og preamp grunning bassenger sammen med en tilpasset TLDA plattform med pre-flekket primere og TaqMan prober. Alle reagenser, kits og instrumentering brukes til miRNA profilering var fra Life Technologies Inc. (nå en del av Thermo Scientific, Carlsbad, CA, USA).
Metylering analyse av MIR34B /C CpG island
genomisk DNA ble renset fra 4 prostatacellelinjer (RWPE-1, BPH-1, LnCap, DU145), 16 PCa, og 12 normale prostata vev (fra serie B), og fra 10 BPH (serie BPH) samples ved hjelp av QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Waltham, MA, USA). Natriumbisulfitt omdannelse av DNA (400 ng) ble utført ved anvendelse av EZ DNA Metylering-Gold Kit (Zymo Research Corporation, Irvine, CA). Metylering-spesifikke polymerase kjedereaksjon (MSP) av et CpG øy oppstrøms MIR34B /C locus ble utført som beskrevet [29] under anvendelse av de følgende primere for påvisning av unmethylated (UM) eller metylert (M) region: UM-forward 5 « – TGTTTTTTGGTGAAATGGGGTTTGAGGT-3 «UM-revers 5’CCTACAAACCAAACACCAAACACCCACA3»; M-forward 5’CGGTGAAATGGGGTTCGAGGC-3 «M-revers 5′-CCGAACACCGAACACCCGCG-3». Den termiske Profilen var 95 ° C i 10 minutter etterfulgt av 95 ° C i 1 minutt, 65 ° C i 1 min, og 72 ° C i 1 min for 45 sykluser og deretter 72 ° C i 7 min.
kopinummer variasjon (CNV) analyse
Genomiske variasjoner av 11q23.1b klynge og tilstøtende loci ble analysert ved hjelp av TaqMan kopitallet assay i forhold til referanse-genet RNase P, slik som beskrevet [30]. Analyseidentifikasjonsnumre var som følger: Hs00608392_cn (CNV # 1; presis plassering 111383042), Hs03049129_cn (CNV # 2, men eksakt plassering 111368721) og Hs06336326_cn (CNV # 3, men eksakt plassering 81902545). Variasjoner i DNA kopiantall ble kvantifisert ved hjelp av Kopier Caller programvare. Alle analyser, reagenser og programvare var fra Life Technologies Inc.
Mir-34b mål uttrykk analyse
Hyperplastisk (BPH-1) eller tumor (LNCaP og DU145) prostata cellelinjer ble transfektert med Mir -34b etterligner /inhibitor eller kontroller i 72 timer, og det totale RNA ble renset som beskrevet ovenfor. Deretter DNA-free total RNA ble revers transkribert med tilfeldige heksamer og SOX2, CDKN1A, MET, c-MYC, HES1 gener uttrykk (TaqMan genekspresjon Analyser) ble relativt kvantifisert på en referanse transkripsjon (beta-2-mikroglobulin) av Real- Time PCR (qPCR). Alle reagenser og instrumenter var fra Life Technologies Inc. Target uttrykk ble deretter beregnet ved hjelp av 2 ^
-ΔCt formel, median normalisert og log2 forvandlet for varmekartet generasjon bruker dChip softare (DNA-Chip Analyzer, www.dchip.org) som beskrevet [9].
Immunoblotting
Cellene ble høstet 72 timer etter transfeksjon av miRNA etterligner /hemmer og løst i 100 mL lysis buffer supplert med proteasehemmer cocktail (Roche, Basel, Sveits) som beskrevet [25]. Porsjoner (50 mikrogram) i hver celle lysat ble analysert med en mikrogram /ml følgende primære antistoffer mot c-myc (klone D84C12; cellesignalisering Technologies, Danvers, MA, USA), Sox2 (klone D6D9, cellesignalisering Technologies), eller Notch1 (klone A-8, Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, CA, USA). β-tubulin (Sigma Aldrich) ble anvendt som en kontroll lasting. Reaktive bånd ble visualisert med ECL Plus (GE Healthcare, Milano, Italia).
Prostata Vev Mikromatriser (TMA) konstruksjon og Immunohistochemistry (IHC)
Fra hver av de 192 PCA pasienter (serie C ; Tabell 1), fire kjerner av prostata svulst, en kjerne av PIN-kode og en kjerne av normalt parenkym hvis tilgjengelig ble brukt til å bygge 22 TMA-blokker, slik som beskrevet [24], med modifikasjoner [23]. FFPE- vev fra pasienter med BPH (serie BPH, Tabell 1) ble brukt som fulle seksjoner og ble ikke inkludert i TMA. Fire mikrometer tykke seksjoner fra hver blokk ble farget med et antistoff til Sox2 (1: 100; Cell Signaling), med diaminobenzidine (DAB) som et kromogen. Immunhistokjemi ble utført ved hjelp av Benchmark Ultra Roche Ventana immunostainer (Roche Group, Tucson, AZ, USA). Alle lysbildene ble kontra med hematoksylin. To patologer (GG og SF) blindet for kliniske data evaluert og scoret alle lysbilder. Når avvik skjedde, ble saken videre anmeldt for å komme til enighet poengsum. Bare reaktivitet for atom Sox2 i epitelceller og ikke i basal korgrommet ble registrert og prosentandelen av immunreaktive celler i PCA prøvene ble i gjennomsnitt blant de fire kjerner fra samme pasient. I tråd med forrige rapport [31], ble Sox2 immunoreaktivitets deretter kategorisert i fire grupper og score ble deretter tildelt som følger: 0 poeng (negativ atom farging), 1 (1-10% av kjernefysisk Sox2), 2 (11-50% av kjernefysisk Sox2), 3 (mer enn 50% av kjernefysisk Sox2).
Statistical Analysis
mirnas relative mengder (RQ) ble hentet importere rå TLDA datafiler i DataAssist programvare (Life Technologies Inc .) med en verdi på 35 som grense for maksimalt tillatt Ct og global normalisering for målet kvantifisering. RQ verdier ble deretter log2 transformert og importert i BRB ArrayTools (https://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html) hvor Anova eller differensial uttrykk analyser ble utført som beskrevet [15]. Korrelasjonsparameter mellom miRNA uttrykk og clinicopathological variabler ble utledet ved hjelp av Mann-Whitney U test, Friedman test eller chi-kvadrat test for kontinuerlig eller diskret variabel, henholdsvis ved hjelp GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, California) eller MedCalc ( Mariakerke, Belgia) statistikkpakke. Mottaker operasjonelle egenskaper (ROC) kurver metoden ble brukt til å teste nøyaktigheten av miRNAs til riktig diskriminere mellom benign sykdom, PIN eller prostatakreft, og for å identifisere pasienter som hadde PSA svikt (PSA 0,2 ng /ml i minst to påfølgende ganger) under oppfølging, som beskrevet [15]. dChip programmet ble brukt for uovervåket hierarkisk clustering.
In vitro
eksperimenter ble utført minst tre ganger, og data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD, med mindre annet er angitt. En p-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
miRNA signaturer av prostatakreft modeller
Vi begynte denne studien ved å profilere uttrykk for miRNA i et panel. av prostata kreft celletyper med ulik karsinogent potensial (S1 File) og tramp mus (S2 fil). I disse eksperimentene, mirnas uttrykk lett differensieres androgen-insensitive (DU145 og PC3) fra-sensitive prostatacancer celletyper (figur 1A). Følgelig er ikke-tumorigene RWPE-1 og BPH-1-cellelinjer (figur 1A) gruppert adskilt fra mer aggressive, LNCaP-celler. Vi neste valgte mirnas basert på to kriterier: en 20-ganger forskjell mellom androgen-følsomme eller-ufølsomme celletyper og ikke-tumorigen RWPE-1 eller tumorigen LNCaP (figur 1 B) (i), og en betydelig variasjon (p 0,05 etter Anova) i uttrykk mellom normal, hyperplastic, androgen-sensitive og-ufølsomme celler (figur 1C) (ii). Disse analysene identifiserte 18 mirnas, og 16 av disse transkripsjonene hadde musen ortologer (fig 1D).
A) Heat-kart av globale miRNA profiler (≈750 mirnas) i ikke-tumorigen (RWPE-en, Normal) , hyperplastisk (BPH-1), androgen-avhengige (LNCaP, AR
sens-PCA) eller-uavhengige (DU145 og PC3, AR
ins-PCA) prostata kreft celler. Rød, over-uttrykk; blå, under-ekspresjon, respektivt. B) Scatterplots diagrammer ble utført mellom androgen-avhengige og-uavhengig PCA celler og mellom normale prostataceller og AR
sens PCA celler til å velge mirnas med differensial uttrykk i begge retninger (fold-endring) på minst 20 folder. En liste over 41 mirnas samtidig endret i begge sammenligninger ble generert. C) Skjematisk fremstilling av utvalgskriteriene vedtatt å identifisere mirnas potensielt relatert til PCa. D) De atten miRNA signaturer identifisert i C ble verifisert av qPCR i de angitte prostata celler. Alle mirnas unntatt to (MIR-577 og MIR-886-3p) hadde musen ortologer. Rødt, hvitt og blått farger i varme kartet representerer høyere, lik eller lavere miRNA uttrykket i prøver respekt til median miRNA verdi.
neste utført global miRNA profilering av LMD PIN eller tumorlesjoner fra TRAMP mus (figur 2A), ved anvendelse av en 20-ganger forskjell i cutoff miRNA uttrykk mellom de to prøvene (figur 2B). Ett hundre tjueen mirnas oppfylte disse kriteriene (Fig 2B og 2C), og 61 mirnas hadde menneskelige ortologer (S1 Table). I denne analysen ble bare fire mirnas forskjellig uttrykt i både menneskelige prostata kreft cellelinjer og tumorprøver fra Tramp mus, inkludert Mir-34b-3p, MIR-34C-5p, MIR-138, og MIR-224 (figur 2C og 2D ). Følgelig uttrykket profilen til disse fire microRNAs viste at androgen-uavhengig DU145 eller PC3 cellene ble nærmere knyttet til Tramp svulster, enn andre humane cellelinjer (figur 2D).
A) global miRNA profilering av prostatakreft (PCA) eller prostata intraepitelial neoplasi (PIN) lesjoner isolert fra Tramp mus. B) scatterplot diagram av miRNAs med differensial uttrykk for minst 20 folder mellom PIN og PCA vev av Tramp mus. Av de identifiserte 121 deregulerte mirnas (S1 Table) 61 hadde menneskelige ortologer. C, D) Sammenligning av vesentlige miRNA signaturer mellom prostata cellelinjer og tramp lesjoner. Bare fire mirnas var felles mellom de to eksperimentelle systemer. Expression analyse etterfulgt av unsupervised hierarkisk clustering D) av MIR-224, -34b-3p, -138 og MIR-34C-5p avslører at androgen-uavhengig prostatakreftceller er mer lik Tramp vev enn til androgen-avhengige eller ikke-tumorigent prostata menneskeceller.
LNCaP PCa modell speil miRNA deregulering i menneskelig prostata sykdom
Vi neste undersøkte mirnas identifisert ovenfor (n = 18) i en serie av 50 pasienter (serie A ; Tabell 1) med et spektrum av lesjoner inkludert PCa, PIN-kode og normal epitel. MiR-31, MIR-34b-3p, MIR-205, MIR-224 og MIR-452 viste differensial uttrykk nivåer mellom normal, PIN og PCa matchet prøver (p 0,01 av Friedman test; Fig 3). Alle mirnas ble nedregulert ved PCA i forhold til normal epitel, som samsvarer med resultatene oppnådd med LNCaP, RWPE-en eller BPH-1 celletyper (Fig 1D).
matchede normale prostatakjertler, prostata intraepitelial neoplasi (PIN ) og prostatakreft (PCA) lesjoner som er tilgjengelige fra 50 pasienter ble testet for ekspresjonsnivåer av de atten valgte mirnas. MiR-31, 34b-3p, 205, 224 og MIR-452 vises vesentlig endret nivåer mellom de tre vev klasser (p 0,01 av Friedman test). Barer, gjennomsnitt ± SEM. RQ, relativ miRNA mengde
neste fokusert på disse fem mirnas, og undersøkt deres potensial sammen med kliniske parametre for PCa progresjon, inkludert biokjemiske gjentakelse (to påfølgende PSA-verdier . 0,2 ng /ml i løpet av oppfølging), Gleason score (GS ≤7
vs
GS 7), tumorstørrelse (T2
vs
T3-T4 PCA) og lymfeknuter metastaser. For ytterligere validering, brukte vi en ekstra, uavhengig sett av seksten pasienter (serie B i tabell 1) for en samlet antall på 66 analyserte PCa. I denne analysen reduserte miRNA nivåer korrelerte med en klinisk-patologisk progresjon av PCa (tabell 2), og differensial uttrykk for mir-31, MIR-34b-3p og MIR-452 kunne gi en betydelig diskriminere pasienter i henhold til biokjemisk tilbakefall (Fig 4A). Deretter spurte vi om det samme settet av fem miRNAs kan diskriminere mellom PIN og PCA lesjoner, og dermed lik forholdet mellom BPH-en og LNCaP celler. For disse eksperimentene, evaluert vi ti pasienter som gjennomgikk TURP for BPH (serie BPH i tabell 1), og ble fulgt opp i minst 3 år ved Fondazione IRCCS Ca «Granda sykehus. Både MIR-31 og Mir-34b-3p ble uttrykt forskjellig mellom PIN eller PCA prøver og BPH (p 0,001 av Mann Whitney test; fig 4B). Til forskjell fra profilen observert i cellelinjer, Mir-34b-3p nivåer økt mer enn ti-folder i BPH prøvene sammenlignet med PIN-kode eller PCa. Endelig uttrykk for MIR-34b-3p diskriminert nøyaktig PIN eller PCA prøver fra BPH, med ROC-analyse (p 0,0001, S2 fig). MiR-205 uttrykksnivået var lavere i BPH sammenlignet med PIN (p = 0,0027, figur 4B). Omvendt, MIR-452 og MIR-224 ble ikke uttrykt forskjellig mellom PCa og BPH eller mellom PIN og BPH, henholdsvis (figur 4B).
A) Receiver Operating karakteristiske (ROC) kurver ble brukt til å teste nøyaktigheten av miRNAs å identifisere pasienter som hadde PSA svikt under oppfølging. AUC; Arealet under kurven; KI, konfidensintervall. B) MiR-31, 34b-3p, 205, 224 og Mir-452 uttrykk ble evaluert av qPCR i uparede premalign kjertler (PIN, n = 50), neoplastiske prostata lesjoner (PCA, n = 66), eller godartet hyperplastisk vev (BPH, n = 10). **, P = 0,0027; ***, P 0,001, alt etter Mann-Whitney test. Barer, gjennomsnitt ± SEM. RQ, relativ miRNA kvantitet.
MiR-34b undertrykkelse er en biomarkør for PCa
MiR-34b og MIR-34c er transkribert fra samme locus på kromosom 11 ( cytogenetisk bånd 11q23.1, fig 5A), og deres ekspresjon er regulert av epigenetikk, slik som CpG øy metylering [29], og p53-funksjon [32]. Derfor, undersøkte vi BPH pasienter, en undergruppe av PCA-prøver (tilfeldig valgt fra serien B; Tabell 1), normal prostata prøver, og ikke-tumorigen eller invasive prostatacellelinjer for potensiell allelisk kopitall variasjon, og metylering status av CpG øya av MIR34B /C locus (fig 5B-5G).
A) Skjematisk fremstilling av menneske MIR34B /C locus på kromosom 11q. B, C) Mir-34b-3p og MIR-34C-5p uttrykk i de angitte prøver av normal prostata (pool av 10 eksemplarer), godartet hyperplasia (BPH), prostatakreft (PCA) eller ikke-neoplastisk (RWPE-1) , hyperplastisk (BPH-1) eller tumor (LNCaP, DU145) prostata cellelinjer. D, E) kopiantallet av genomiske DNA-områder proksimal til MIR34B /C-locus (CNV # 1; Hs00608392), eller til BTG4 genet (CNV # 2, Hs03049129) ble evaluert ved qPCR i de samme prøver som beskrevet i panel B, C . Stenge verdier for betydelig tap eller vinning av mål-DNA i forhold til en referanse-analyse (RNase P) ble definert som kopier 0,5 eller 4, henholdsvis (ingen endring: CNV = 2). F, G) Analyse av MIR34B /C CpG island epigenetisk status ble utført ved metylering spesifikk PCR i matchet normal eller neoplastisk (PCA) prostata parenchyma, godartede hyperplastiske prøver og prostata cellelinjer. En prøve ble ansett som delvis metylert (M /UM) hvis amplifisert ved begge primerpar. M, denaturert; UM, Unmethylated. Blank, ingen mal kontroll; NA, sample ikke tilgjengelig.
I disse forsøkene ble Mir-34b-3p redusert i PCA sammenlignet med normale eller hyperplastiske prostataprøver, BPH-1 eller LNCaP celler (figur 5B). I kontrast, MIR-34C-5p hadde et annet mønster av uttrykk i menneskelig vev, noe som tyder på at de to karakterutskrifter kan bli uavhengig regulert (Fig 5C). Genomisk analyse viste at bare området proksimalt for MIR34B /C-locus (analyse CNV # 1, fig 5D) utviste tap av DNA kopitall, da de mer fjerntliggende sonder (CNV # 2 og CNV # 3) viste ingen endring i genomisk innhold (fig 5E og S2 tabell). Tap av DNA kopiantall var betydelig mer uttalt i PCA vev, sammenlignet med godartet hyperplastiske kjertler (p = 0,01 ved Fisher eksakt test), og var umulig å oppdage i bassenget av normale kontroller (Fig 5D). Både CNV # 1 og # 2 gikk tapt i BPH-en og LNCaP cellelinjer, som gjenspeiler samtidig nedregulering av MIR-34b /c. I kontrast, gjorde DU145 cellene ikke viser modulering av MIR-34b /c uttrykk, eller allel kopiantall tap (Fig 5D og 5E).
Når analysert for epigenetisk status ved metylering spesifikk PCR, det CpG island oppstrøms av MIR34B /C locus (fig 5F) var signifikant mer metylert i prostatakreft enn normale eller hyperplastiske prostata prøver (henholdsvis 50% mot 30% eller 0%, p = 0,026 av chi-kvadrat test; fig 5G). En delvis grad av metylering kunne påvises i alle cellelinjer, men BPH-1, hvori MIR34B /C-lokuset ble epigenetiske dempede (figur 5F og 5G). Sammen utgjør disse data tyder på at redusert uttrykk for Mir-34b ved PCA kan innebære en kombinasjon av epigenetisk taushet DNA kopi nummer tap (S2 tabell).
En Mir-34b-3p-SOX2 aksen er selektivt deregulert i androgen-avhengige PCa
MiR-34b-3p regulerer uttrykket av stamcellerelaterte faktorer, blant annet c-myc, Sox2, Met og Notch1 [33,34], som har også vært innblandet i prostatakreft [ ,,,0],35-37]. I samsvar med disse observasjonene, tvunget uttrykk for Mir-34b forløper sekvenser i forskjellige prostata cellelinjer, men ikke antagonist (Panel A i S3 figur), potent trykt endogene Sox2 nivåer i BPH-1 celler (figur 6A), mens ikke modulere uttrykk nivåer av c-myc, Notch1 og Met (paneler B, C i S3 figur). Omvendt, fikk androgen-uavhengig DU145 cellene ikke vise miR34b-modulering av Sox2 uttrykk (Fig 6A), og LNCaP cellene hadde ingen påvisbare nivåer av Sox2 (S4 fig). Til slutt, celleproliferasjon ble ikke signifikant påvirket under de forskjellige betingelser som ble testet (panel D i figur S3).
A) Sox2 ekspresjon ble analysert ved immunblotting i BPH-1 eller DU145-celler etter transfeksjon med MIR-34b eller etterligner styresekvens i 72 timer. Untr., Ubehandlet prøven. p-MIR-34b eller a-MIR-34b, forløperen eller antagonist Mir-34b; p-Ctrl eller a-Ctrl, ikke-måls kontroller for forløper eller antagonist molekyler. B) Sox2 immunoreaktivitets ble analysert i en prostata TMA, som inkluderte normalt vev, pre-neoplastisk (PIN) og tumor (PCA) lesjoner fra 192 pasienter, og i benign prostatahyperplasi (BPH) prøver. Sox2 er sterkt uttrykt i basalcellelaget fra ikke-neoplastiske vev og i epitel-celler i kreftvev. C, karakteriserer D) Sox2 forhøyet uttrykk PCA vev fra PIN eller BPH lesjoner og skiller PCA pasienter med biokjemisk tilbakefall. Antallet PIN, PCA eller BPH tilfeller (C) eller av PCA pasienter som gjennomgikk eller ikke biokjemisk tilbakefall under klinisk oppfølging (serologisk PSA 0,2; D) i henhold til kjernefysiske Sox2 flekker score er illustrert. p = 0,02 eller p = 0,0006, henholdsvis av Chi-kvadrat test.
Når analysert i menneskelig vev (fig 6B), Sox2 vises svært heterogene nivåer av uttrykk spesielt i PCA vev som strekker seg fra 0% til 70% av positive kjerner (figur 1C). Omvendt, PIN eller BPH lesjoner viste høy Sox2 immunoreaktivitets i basalkorgcellene (ikke scoret), mens deres epithelial avdelinger vises lavt Sox2 nivå (≤10%, Sox2 poengsum = 1; Fig 1C). Som tidligere dokumentert [31,36,38], immunoreaktivitets for Sox2 ble anatomisk begrenset til korg /basal celler i ikke-neoplastiske kjertler. Motsatt dette mønsteret ble gradvis borte i PIN og PCA prøver. Faktisk Sox2 uttrykk i mer enn 10% av kjernene (Sox2 score 2 og 3) var et kjennetegn ved PCa sammenlignet med PIN eller BPH prøver (p = 0,02 av Chi-kvadrat test). I tråd med dette resultatet ble høyere Sox2 score oftere funnet i PCA vev av pasienter som opplevde biokjemisk tilbakefall (p = 0,0006 av Chi-kvadrat test; Fig 6D). Faktisk er mesteparten av Sox2-negative PCa (59 ut av 68, 87%) ikke opplever biokjemisk tilbakefall motsatt til PCa med Sox2 på mer enn 10% av cellene (1 ut fra 6, 0,17%; figur 6D)
Ingen annen klinisk variabel undersøkt signifikant korrelert med Sox2 uttrykk.
Diskusjoner
i denne studien har vi vist at tap av Mir-34b er forbundet med utviklingen av prostatakreft, og nøyaktig kan diskriminere mellom benign hyperplasi og PIN-lesjoner eller infiltrere prostatahyperplasi adenokarsinom i mennesker. Mekanistisk, gjenspeiler denne veien epigenetisk taushet DNA kopi nummer tap av MIR34B /C locus på kromosom 11, noe som resulterer i deregulert uttrykk for nedstrøms stemness målet, Sox2 ved PCA. Viktigere, synes deregulert Mir-34b signale å selektivt skille med androgen-avhengige prostataceller, noe som tyder på en mulig rolle av denne veien i sykdommen tilbakefall og potensielt i overgangen til kastrere bestandig scenen.
Mir-34 familien av mirnas er tidligere blitt rapportert å undertrykke tumorgenesen av forskjellige mekanismer, inkludert modulering av cellesyklus overganger, EMT, metastaser, eller kreft stemness [33].
