Abstract
Pre-kliniske benkreft smertemodeller som etterligner den menneskelige tilstand er pålagt å svare på kliniske realiteter. Bryst eller prostatakreftpasienter takle benmetastaser oppleve problematiske smerter, noe som påvirker deres livskvalitet. Avansert overvåking er derfor nødvendig for å avklare bein kreft smertemekanismer og avgrense behandlinger. I vår modell av rotte femoral brystkreft MRMT-1 celle implantasjon, ble smerte utbruddet og tumorvekst overvåket i 21 dager. Den kirurgiske prosedyren utføres uten artrotomi tillatt opptak av tilfeldige smerter i fritt bevegelige rotter. Sammen med den gradvise utvikling av mekanisk allodyni og hyperalgesi, ble atferdsmessige tegn på ambulerende smerte detektert på dag 14 ved anvendelse av en dynamisk vektbærende apparat. Osteopeni ble åpenbart fra dag 14 samtidig med uorden av trabekulært arkitektur (μCT). Skjelettmetastaser ble visualisert så tidlig som dag 8 ved MRI (T
1-Gd-DTPA) før smerte deteksjon. PET (Na
18F) samregistrering avslørte intra-osseous aktivitet, som bestemmes av anatomiske overlagring over MR i samsvar med osteoklastaktiviteten hyperaktivitet (TRAP flekker). Smerte og bein ødeleggelse ble forverret med tiden. Bone ombygging ble ledsaget av c-Fos (spinal) og ATF3 (DRG) neuronal aktivering, holdt oppe av astrocyte (GFAP) og microglia (Iba1) reaktivitet i ryggmargen. Vår dyremodell viser betydningen av samtidig opptak smerte og tumorprogresjon og vil tillate oss å bedre karakter terapeutiske strategier i fremtiden
Citation. Doré-Savard L, Otis V, Belle K, Lemire M, Archambault M , Tremblay L, et al. (2010) Behavioral, bildediagnostikk og histopatologiske funksjoner i en ny rottemodell av Bone Cancer Pain. PLoS ONE 5 (10): e13774. doi: 10,1371 /journal.pone.0013774
Redaktør: Pedro R. Lowenstein, Cedars-Sinai Medical Center og University of California Los Angeles, USA
mottatt: 05.02.2010 ; Godkjent: 11 oktober 2010; Publisert: 29 oktober 2010
Copyright: © 2010 Doré-Savard et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet er støttet med tilskudd fra Cancer Research Society (PS) og fra CIHR /Rx D forskningssamarbeid i samarbeid med den kanadiske Pain Society, Astrazeneca Inc., CIHR Institute of Aging, CIHR Institute of Muskel Health og leddgikt, CIHR Institute av Neurosciences, psykisk helse og avhengighet (PS) og The Quebec Bio-Imaging Network. L.D.-S. holder CIHR Frederick Banting og Charles Best, FRSQ, kanadiske Arthritis Nettverk og RSBO stipender. PS! er en CIHR ny etterforsker. L.G. er en FRSQ Junior 1- ny etterforsker. PS:, M. L., L.G. og R.L. er medlemmer av FRSQ-finansierte Centre de Recherche Clinique Etienne-Le Bel. PS! og L.G er medlemmer av Quebec Pain Research Network, M.L. og R.L. er medlemmer av Quebec Bio-Imaging Network. M.L. er Canada Research Chair i Magnetic Resonance Imaging. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Astra-Zeneca Inc. gitt midler gjennom en kanadisk Pain Society program. Forsøkene ikke innebære noen Astra-Zeneca produkt eller sammensatte heller ikke Astra-Zeneca spille en rolle i valg av awardees. Ingen av forfatterne er ansatte eller eiere av Astra-Zeneca. Derfor betyr dette kommersielle Funder ikke endre forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer som beskrevet på nettet av guiden for forfatterne.
Innledning
Blant kreftformer med en dårlig prognose de som stammer fra bryst, lunge og prostata vanligvis metastasere til skjelettet [1], [2]. Mens primære bein kreft er sjeldne, over 70% av folk coping med avansert brystkreft eller prostatakreft vil utvikle benmetastaser [3]. Den viktigste faktoren ansvarlig for nedgang i livskvalitet i benmetastaser bærende pasienter er smerter [4].
Bone kreft smerter stammer fra nerve komprimering, iskemi og frigjøring av proinflammatoriske stoffer av svulsten og celler fra ben miljø [5]. Dermed lytiske kreftceller påvirker bein homeostase gjennom utgivelsen av cytokiner som fremmer patologisk resorpsjon av osteoklaster [6], [7]. I tillegg til bendestruksjon [8], skaper osteoklast hyperaktivitet et surt miljø som er ansvarlig for plassering av smerte [9]. Kompenserte og anarkistiske beindannelse av osteoblaster komprimerer gratis nerveterminal avslutninger spredt i benmargen, matrix og periosteum [10], som fører til dannelsen og vedlikeholdet av smerte. Foreningen av disse fenomenene gir en unik mekanisk og nevrokjemiske utbruddet som går utover kombinasjonen av nevropatisk og inflammatorisk smerte [11].
Bone kreft smerte unike egenskaper gjør det terapeutisk problematiske [11]. Faktisk har typiske tilnærminger inkludert anti-inflammatoriske medisiner og sovetabletter begrenset lettelse effektivitet [12]. På grunn av sin progressive natur, er eskalerende doser som kreves for å lindre tilstrekkelig benkreft smerte [13], som fører til bivirkninger og til slutt til mislykket samsvar [4], [14]. Videre morfin ble nylig vist seg å akselerere kreft-indusert bentap i osteolytiske-kreft [15], [16]. Tilsvarende lovende antiresorptive bisfosfonat terapier [17], [18], [19], [20], [21], vist seg å bremse kreft progresjon og indirekte lindre smerte, ble i skyggen av komorbid osteonekrose [22]. Bone kreft smerte forblir derfor en bekymring, fremhever behovet for å fremheve vår forståelse av dens nevrobiologiske mekanismer for å utvikle mer effektive strategier.
Animal modeller ble utarbeidet for å etterligne den menneskelige tilstand i et forsøk på å forstå bensmerter kreft . Musemodeller av calcaneus og humerus kreft [23], eller rottemodeller av tibia kreft med bryst MRMT-1 [24], 4T.1 [25] og Walker 256 [26], eller prostata AT-3.1 [27] celler ble utviklet å karakterisere lokale endringer eller nevral plastisitet av spinal strukturer som stikker til beinet. Fra et klinisk synspunkt, femur, men representerer den mest vanlige påvirkes lange ben [28]. Muse femoral modeller med benmargs implantasjon av fibroblast kreftcellelinjer for å indusere smerte er rapportert (f.eks fibrosarkom [29], [30]). Imidlertid er disse modellene basert på å etterligne ben primære cancere. Flertallet av sekundære bein kreft stammer fra bryst eller prostatakreft, kjent for sine bein-metastasizing egenskaper [31]. Likevel, for modeller med disse typer celler, er induksjons enten intravenøs (som fører til flere språk metastaser [32], [33]) eller etter en kirurgisk prosedyre hvor en patella arthrotomia og delvis endring av kneleddet er utsatt for svekket bevegelse , som i sin tur presser evaluering av smerterelatert adferd. Faktisk invasivitet og kirurgiske prosedyrer må være minimal for å vurdere gjennombruddssmerter uten forstyrrelser. Denne sistnevnte smerte manifestasjon er den mest ildfast betingelse for å overvinne for personer coping med kroniske kreftsmerter og blant de tøffeste til å evaluere i dyremodeller.
I tillegg til smertevurdering, midler til å avdekke og overvåke bein patologi har utviklet seg å innlemme X-ray mikro beregnet tomodensitometry (μCT) og bein scintigrafi [34]. Likevel, forebyggende fastsettelse av svulst hekkende og progresjon har potensial til å forbedre analgetiske posologies og begrense benremodelleringen. Advanced ikke-invasiv og lav strålings medisinsk avbildning, som for eksempel positronemisjonstomografi (PET) og magnetisk resonansavbildning (MRI) eller en kombinasjon av begge, ville være ønskelig for å muliggjøre effektive og gjentatte eksamener for nøyaktige og strenge analgetisk terapi justeringer [35] .
rotta er fortsatt de mest studerte artene i smerte paradigmer [36]. Vi valgte derfor en rotte brystkreft cellelinje for sine spontant metastasizing og trans egenskaper. Evnen til MRMT-en for å metastasere til eksterne organer er iboende i de syngene celler [37]. I den foreliggende undersøkelse, beskriver vi en intervensjon i Sprague-Dawley rotte femur for å implantere brysttumorceller ved hjelp av et lys kirurgisk prosedyre i et forsøk på å etterligne klinisk smerte. Vi benyttet en kombinasjon av nyskapende atferdsmessige og medisinsk bildediagnostikk tilnærminger, støttet av immunhistokjemiske og patologiske observasjoner, for å karakterisere modell. Studien tar sikte på å bedre klinisk relevans med hensyn til modellen og verktøyene som brukes til å screene nye blyforbindelser, for å karakterisere bensvulst progresjon, samt å belyse mekanismene bak dannelsen og vedlikeholdet av beinkreft smerte.
Metoder
Cell kultur
melke rotte metastase tumor (MRMT-1) celler (karsinom) var vennlig levert av Cell Resource Center for Biomedical Research Institute of Development, aldring og kreft (Tohoku universitet 4-1, Seiryo, Aoba-ku, Sendai, Japan) og høstet i RPMI 1640-medium (Gibco, Montreal, Quebec, Canada) supplert med 10% føtalt bovint serum (varme-inaktivert) og 2% penicillin /streptavidin (Gibco, Montreal, Qc, Canada). Cellene ble løsnet ved kort eksponering til 0,25% vekt /volum trypsin-EDTA (Gibco, Montreal, QC, Canada) og klargjort for injeksjon. I korthet ble cellene pelletert ved sentrifugering, skyllet med 1 ml av Hanks balanserte saltløsning fritatt av kalsium, magnesium eller fenol (HBSS; Gibco, Montreal, QC, Canada) (3 min ved 200 x g.) Og videre sentrifugert i samme forhold. Pelleten ble resuspendert i 1 ml HBSS, og cellene ble tellet med et hemocytometer. Celler ble fortynnet for å oppnå en sluttkonsentrasjon for injeksjon av 30000 celler i 20 ul og holdes på is før det kirurgiske inngrepet
Dyr
Voksne Sprague-Dawley hannrotter (200-225 g;. Charles River Laboratories, St.-Constant, Quebec, Canada) ble opprettholdt på en 12 timers lys /mørke syklus med tilgang til mat og vann
ad libitum
. Animal relaterte prosedyrer ble godkjent av etisk komité for Animal Care og eksperimentering av Université de Sherbrooke og utført i henhold til bestemmelsene i den kanadiske Council on Animal Care (CCAC). Rotter ble akklimatisert i 4 dager til dyret anlegget og for 2 dager til manipulasjoner og enheter før atferdsstudier. Merk at dyr testet for smerte og brukes til immunhistokjemiske analyser var forskjellige fra de som blir fotografert av MR eller MR-PET, siden langvarig bedøvelse kan påvirke atferdsmessige responser.
Kirurgi
Etter fullført anestesi med 5 % isofluran (Abbott Laboratories, Montreal, Qc, Canada), ble rottene lagt i liggende stilling og deres riktige poter ble barbert og desinfisert med 70% v /v etanol. Anestesi ble opprettholdt med 2,5% isofluran og rotte øyne var beskyttet med en oftalmisk flytende gel (Tear-gel, Novartis, Mississauga, ON). En minimal hud innsnitt (8-10 mm) som utsettes
quadriceps femoris
.
vastus lateralis
ble radert (5-8 mm i lengde) å eksponere femoral epicondyle, mens patellar ligament forblitt urørt og minimal skade ble påført til de omliggende muskler og blodkar. Ved hjelp av en 0,8 A stereotaxic drill (Foredom, Bethel, CT, USA) koblet til en 1,75 mm karbid stål Burr (Stoelting Co., Wooddale, IL, USA), ble en liten og overfladisk hulrom burred mellom mediale epicondyle og adductor tuberkel (ca. 1 mm i dybde). I det hulrom, ble en 25-gauge nål satt inn i en 45 ° vinkel, slik at det å nå den intramedullære kanal av femur. Nålen ble erstattet med en butt-ende 25 gauge nål koblet til en 50 pl Hamilton-sprøyte inneholdende 20 ul av cellesuspensjonen (kreft gruppe) eller HBSS (sham gruppe). Sprøyten ble etterlatt på plass i 1 min for å tillate celle dispersjon i benmargen. Nålen ble deretter fjernet, og hulrommet ble forseglet med amalgam (Prodigy A3, Kerr, Orange, CA) og polymerisert med en herdelampe (QHL75, Dentsply, Milford, DE). Nettstedet ble grundig vasket med sterilt avionisert vann. Muskelen og bindevev ble lukket med en diskontinuerlig sutur laget med syntetisk absorberbare suturer (monocryl, Ethicon, Sommerville, NJ), og huden ble lukket med en kontinuerlig sutur fra ikke-absorberbare kirurgiske sutur (prolene, Ethicon, Sommerville, NJ ). Såret ble endelig vasket med 3% v /v peroxide og sprayet med en bitter løsning (Aventix Dyrehelse, Flamborough, ON).
Behavioral studier
Mekanisk allodyni
ble vurdert ved hjelp av en dynamisk plantar esthesiometer (Ugo Basile, Stoelting, IL, USA), en automatisert versjon av von Frey hår. Dyrene ble plassert i skap på en forhøyet netting og svar på punktat mekanisk stimulering ble vurdert ved hjelp av esthesiometer. En rett metallfilamentet (0,5 mm diameter) ble orientert under puten til det rørte plantar overflate av bakpoten og begynte å utøve en oppadrettet kraft. Den kraft som kreves for å fremkalle en tilbaketrekning respons ble målt i gram, og automatisk registreres når poten ble trukket tilbake eller den forhåndsinnstilte cut-off ble oppnådd (50 g). Fem verdier ble tatt vekselvis på begge ipsilaterale (operert side) og kontralaterale bakpotene med intervaller på 15 s.
Mekaniske nociceptive abstinens svar
ble målt ved hjelp av en analgesiameter (Ugo Basile, Stoelting, IL , USA) som gjelder en lineært økende trykk (16 g /s) via en akryl pennen. Pekepennen ble plassert over den mediale dorsum av hind labben, mellom 1. og 2. tarsometatarsal ledd og gjennomsnittet av fire påfølgende tiltak som begynner med venstre eller høyre bakpote, vekselvis, ble registrert som uttak terskel i gram. Cut-off ble satt til 200 g. Sammenligning for hver testdag ble utført ved å trekke den ipsilaterale vekt (g) fra kontralaterale vekt (g) for å bestemme pote uttak terskel (PWT) forskjell.
Statisk vektbærende
var målt ved hjelp av Incapacitance Meter (IITC Life Science, Woodland Hills, CA, USA). Dyret ble plassert med bakbena i ro på de to vekt gjennomsnitts plattform pads. Enheten registrert gjennomsnittsvekten lagt på hver pute over en 2 s periode. Målingen ble gjentatt 3 ganger. Resultatene oppnådd med den incapacitance måleren resultatene ble brukt som en kontroll for en andre vektbærende test, den dynamiske vektbærende test (Bioseb, Boulogne, Frankrike). Enheten besto av en bunnløs pleksiglass kabinett (25 × 25 × 24 cm
3) og en sensor (1936 enkeltfangevoktere). Sensoren ble plassert på gulvet av avlukket, som dekker hele overflaten. Rotta fikk lov til å bevege seg fritt innenfor apparatet i 5 min og vektbærende informasjonen ble overført direkte til en bærbar datamaskin via en USB-grensesnitt. Rådata ble analysert med DWB 1.1.0.6 programvare (Bioseb). En pote ble oppdaget da en fangevokter registrert en vekt på minst 4 g og minimum 2 tilstøtende fangevoktere registrert en vekt på minst 1 g. Labben måtte være stabile i minimum 0,5 s for å bli inkludert. Ved hjelp av en synkronisert video-opptak av testen og den skalerte kart over oppdagede sonene ble hver antatt pote validert av en observatør og identifisert som en venstre eller høyre og forgrunnen eller bakfot. Andre soner oppdaget, som representerer halen eller en annen kroppsdel, ble også inkludert i analysen.
Effekten av underhudsfett morfin
ble evaluert på dag 11, 14, 18 og 21 i vår modell . Morfinsulfatløsning (50 mg /ml) ble fortynnet i sterilt saltvann for å oppnå injeksjons konsentrasjon (3 mg /ml). Rotter ble enn injisert subkutant med 3 mg /kg (1 ul /g) og returnert til deres bur. Adferdstester ble utført 30 minutter etter injeksjonen som beskrevet tidligere.
Immunhistokjemi
Rotter ble dypt bedøvet med 5% isofluran og tran perfusert med 4% paraformaldehyd (PFA) i fosfatbuffer (0,1 M , pH 7,4). Ryggmargen og dorsale rotganglier (DRG) ble postfiksert i 30 minutter i 4% paraformaldehyd og deretter overført til 30% sukrose (48 h) for kryobeskyttelse. Serie frosne ryggmarg seksjoner, 35 mikrometer tykke, ble kuttet ved hjelp av en glidende mikrotom, samlet i PBS og behandlet som frittflytende seksjoner. Frosset DRG ble innleiret i oktober Tissue-Tek, kuttet på en kryostat med en tykkelse på 12 um, samles og behandles på objektglass.
Vevssnitt ble inkubert i 60 minutter ved romtemperatur i en blokkerende oppløsning av 5% normalt geiteserum i PBS med 0,5% Triton X-100 og 2% albumin og deretter inkubert i 30 minutter i 0,1 M glycin-oppløsning for å redusere autofluorescens. Snittene ble deretter inkubert med det primære antiserum over natten ved 4 ° C. Ryggmargs seksjonene ble immunostained med antistoffer mot markører for microglia, ionisert kalsium bindende adapter molekyl 1 (Iba1, polyklonale antistoff kanin anti-Iba1, 1:1000, Wako, Richmond, VA, USA), astrocytter, glial fibrillary surt protein (GFAP, monoklonalt klone GA5 mus anti-GFAP, 1:500, Sigma, Oakville, Ontario, Canada) og c-Fos protein (c-Fos, polyklonale kanin anti-Fos, 01:20 000, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA) og i DRG mot aktivere transkripsjonsfaktor 3 (ATF-3 (C-19), polyklonale kanin anti-ATF-3, 1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA). Etter inkubering ble vevssnitt vasket to ganger i 10 minutter i PBS og inkubert i det sekundære antistoffoppløsning i 2 timer ved romtemperatur. Sekundære antistoffer konjugert til fluorescerende markører Alexa Fluor® 488 og Alexa Fluor 647® ble brukt på 1:500 (Invitrogen Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Seksjonene ble deretter montert med Aquamount. Fraværet av kryssreaktivitet blant de sekundære antistoffer ble bekreftet ved å utelate primært antistoff i løpet av inkubasjon over natten.
Fos-proteinet og ATF-3-faktor ble også detektert ved immunohistokjemi, ved hjelp av avidin-biotin-peroksidase-metoden. DRG-lysbilder og ryggmarg Snittene ble behandlet med 0,5% hydrogenperoksyd i 30 minutter for å inhibere endogen peroksidaseaktivitet og inkubert i 30 minutter i en blokkerende oppløsning av 5% normalt geiteserum, 2% albumin og 0,5% Triton X-100 i PBS. Seksjonene ble deretter inkubert over natten ved 4 ° C i primære c-Fos (ryggmarg) og ATF-3 (DRG) antistoffer, som ble fortynnet i 1% NGS med 0,1% Triton X-100. Etter inkubering ble de delene skylt og blokkert med 3% NGS i 15 minutter og inkubert i 2 timer i det sekundære antistoff, biotinylert geit-anti-kanin-IgG (geite-anti-kanin-H + L, 1:500, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), etterfulgt av streptavidin-pepperrot peroksydase med avidin-biotin-metoden i 1 time (pepperrotperoksidase streptavidin, PK-6100, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) ved romtemperatur. Seksjonene ble deretter inkubert i 3 min med 0,02% diaminobenzidin med 0,01% hydrogen peroxide, så dehydrert og coverslipped med Permount® Monterings Media (SP15-500, Fisher Scientific, NY, USA).
Kvantifisering
ved hjelp av et Olympus confocal Imaging mikroskop og Olympus Fluoview FV1000 programvare, ble seksjoner fra ryggmargen tatt med identiske oppkjøp parametere (forsterkning, eksponeringstid) og analysert ved konfokalmikroskopi å karakter immunfluorescens (IF). Epifluorescence og lyse felt bildene ble tatt av en Leica DM4000 mikroskop utstyrt med en Leica DFC350FX og en InfinityX kamera for immunfluorescens.
Fos-immunreaktive kjerner ble talt opp når du har små, runde eller ovale, mørke flekker, i sammenligning å kontrollere. Lameller avgrensning ble utført med en rotte ryggmarg histo-arkitektur mal [38], i samsvar med korsrygg segment L1 /L2 /L3 av seksjonen. I den foreliggende studien ble c-Fos-immunreaktive celler telles som kombinerte laminatlag I-II, henholdsvis III-IV, V-VI og VII-VIII,. Åtte 35-um ryggmargs seksjoner over L1 /L2 /L3 segment i hvert dyr (n = 3) ble tilfeldig valgt per dyr per betingelse for å bestemme total c-Fos nummer.
Kvantifiseringen av ATF-3- positive nevroner i DRG-12-um tykke seksjoner ble utført ved å telle antall nerveceller med ATF-3 immunoreaktive kjerner ved 20X forstørrelse, ved hjelp av et Leica DFC350FX mikroskop. DRG tilsvarer ryggmargen nivåer L1 /L2 /L3 ble valgt som hoved projeksjon områder av primære afferente fibre innervating femur [39], [40]. Opptelling av ATF-3 positive celler ble utført en gang i tre serier, hver 36 mikrometer. Denne telling ble uttrykt som gjennomsnittlig antall av ATF-3 immunreaktive celler per seksjon (n = 24). Narre og kreft dyr fra 3 uavhengige eksperimenter ble anvendt for ATF-3-bestemmelse.
Glial farging for GFAP og Iba-1 i L1 /L2 /L3 ryggmarg ble kvantitativt analysert ved hjelp av optisk tetthet med bilde J programvareversjon 1,6. Bilde J ble først kalibrert med et bilde fra en kontroll dyr ved hjelp av kalibreringsfunksjonen. Innstillingene ble deretter bevart for alle påfølgende analyser. Tre tilfeldig valgte deler av ryggmargen L1-L3 i hvert dyr (n = 3) ble analysert. De optiske tettheter av ni seksjoner (tre seksjoner /dyr) ble midlet for å tilveiebringe et midlere tall for hver tilstand.
Radiological analyse
Røntgenbilder ble utført på dissekert ben ved hjelp av en Faxitron MX-20 ( Faxitron, Lincolnshire, IL). Bildene ble tatt på 26 kV, eksponeringstid: 10 s; forstørrelse: 2X. Micro-computertomografi analyser ble utført på dissekert lemmer av testede rotter med en 1072 MicroCT system (Skyscan, Kontich, Belgia). Parametrene var: kilde: 80 kV, 124 uA; zoom: 20X; pikselstørrelse: 14,06 pm; eksponeringstid: 3,0 s; rotasjon: 0,9 °. Ben Volum /Totalvolum (BV /TV) bestemmelse: kortikale + trabekulært benvolum (BV) dividert med enhver type vev (TV) i området fra 5626 mm svarende til 201 tverrsnitt (volum av interesse, VOI), med start fra vekstplaten av den distale femur. Trabekulært BV /TV er definert av trabekulært benvolum delt på TV fra VOI. Analyser ble utført med CT Analyser 1.10.0.1 (Skyscan, Kontich, Belgia).
Magnetic Resonance Imaging og positronemisjonstomografi
MR undersøkelser ble gjennomført på
Centre d’IMAGERIE moléculaire de Sherbrooke
med en 210 mm liten dyr 7T scanner (Varian Inc., Palo Alto, CA, USA) og en 63 mm volum RF coil. Sprague-Dawley rotter ble plassert på ryggen i en MR-kompatibel vugge utstyrt med en homebuilt pote støtte laget for å plassere både lemmer stabilt og reproduserbart. Dyrene ble bedøvet med 3% (induksjon) og 1,5% (stabilisering) isofluran i oksygen. En tilbakemelding styrt dyr varme luftvarmer systemet ble brukt til å holde dyrets kroppstemperatur på fysiologiske nivåer og respirasjon ble kontinuerlig overvåket (SA Instruments Inc., Stony Brook, NY, USA). MR-protokollen inkludert oppkjøpet av aksial (sagittal) pre-kontrast og 10 min etter kontrast
T
1-vektede bilder, ved hjelp av en gradient ekko sekvens med TR: 210 ms, TE: 3,35 ms , flip vinkel: 30 °, matrise: 256 × 256, FOV: 60 × 60 mm
2, NA: 8 (30 sagittal skiver), 1,5 mm tykk. En 600-ul bolus av kontrastmiddel (Gd-DTPA, Magnevist, Berlex) ble injisert via halevenen. Dyr ble fotografert før og 6, 8, 10, 13, 15 og 18 dager etter implantasjon. For å evaluere tumor invasivitet, en region av interesse (ROI), inkludert hele benet cortex og medullar kanal av femur, ble definert. Dette ROI ga en voxel intensitet histogram for begge bakbeina poter. Kontralaterale maksimale voxel intensiteter ble brukt til å fikse den patologiske terskel. Hver ipsilaterale voxel resterende ble farget i henhold til sin intensitet med en gul-rød skala. Mathlab Versjon 7.1 (Mathworks Inc., Natick, Massachusetts, USA) ble brukt til å analysere dataene og utføre beregningene.
Positronemisjonstomografi ble utført ved hjelp av LabPET4 Sherbrooke med kjernetemperaturkontroll. Ring diameter: 162 mm; FOV: 37,5 mm; Cristals: 3072; Romlig oppløsning: 1,35 mm FWHM FOV; Støytilsvar teller: 37 kcps på 245 MBq (250-650 keV). Umiddelbart etter MRI-skanninger, dyr forble under bedøvelse i den samme stilling, og holderen ble overført til PET-skanneren. Kollimatoren ble justert til hind kneledd; 9,25 MBq av Na
18F ble injisert intravenøst (200 mL 500 mL /min). Fordelingen av radiomerkings ble overvåket i løpet av 30 min, og dobbelt volum prøvetaking ble utført i 30 min. Pust og kroppstemperatur på dyret ble overvåket til enhver tid gjennom hele prosedyren.
Histologisk analyse og måling av osteoclastaktivitet
Tjueen dager etter tumorinjeksjon, rotter ble avlivet og lårben ble fjernet . Lårben ble fiksert i 4% paraformaldehyd i 72 timer, avkalkes i 10% EDTA (pH 7,4) i 2-3 uker, og til slutt innstøpt i parafin. Parafinblokker ble kuttet i 3- eller 5 mikrometer tykke seksjoner med en mikrotom utstyrt med en karbid blad og skiver ble farget med Harris «hematoxylin og eosin å bestemme kreftcelleinfiltrasjon og bein ødeleggelse. Å identifisere aktiverte osteoklaster, ble tartrat-resistent syre fosfat (TRAP) farging utført. Bruke Leukocytt (TRAP) Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA), ble skivene utsatt for substrat for en time og farging ble visualisert med en Leica DM4000B (Leica, Toronto, ON, Canada). Totalt ble 3,5 felt telles på en forstørrelse på 250x for en total overflate på 1 mm
2. Merkede osteoklaster ble telt langs mineralisert bein svulst eller bein benmargs grensesnitt og 4-7 skiver ble analysert for hvert dyr, fra grupper på 4 dyr.
Statistiske analyser
Von Frey og DWB data ble analysert ved hjelp av en to-veis ANOVA etterfulgt av Bonferroni post-hoc test og Randall-Sellitto ble analysert med en Student
t
-test for sammenligning av motsetninger og ipsilaterale bakpotene for hver dag. C-Fos, ATF-3 og Iba1 /GFAP teller forskjeller ble bestemt med en gjentatt tiltak ANOVA etterfulgt av en Bonferroni flere sammenligningstest. Normalitet ble evaluert med Kolmogorov-Smirnov og Shapiro-Wilks tester. BV /TV grafer ble analysert med en enveis ANOVA og felle teller med en t-test. P≤0.05 ble ansett som nivået på statistisk signifikans.
Resultater
Implantasjon av brystkreft celler i femur induserer berørings fremkalt og ambulerende smerte
I forsøket på å ligner klinisk bein kreft smerte, utførte vi en lokal injeksjon av cellene direkte i femur mellom mediale epicondyle og adductor tuberkel. Virkningen av operasjonen ble minimert ved implantering på dette anatomiske området, noe som reduserer sjansene for patellar ligament eller leddskader. Følgelig, som vurdert av von Frey og dynamisk vektbærende (DWB), humbug dyr viste ingen tegn til mekanisk allodyni eller locomotion svekkelse hele atferdstestperioden (fig. 1A, C), selv i tidlige dager etter kirurgisk prosedyre (data ikke vist). Kreftbærende hannrotter inokulert med 30.000 MRMT-1 celler viste en redusert uttak terskel i den dynamiske von Frey test fra dag 14 (36,7 ± 2,0 g; p 0,05, Fig. 1A). Etter det, allodynia hurtig forløp inntil dag 21, da det var maksimal (23,3 ± 1,5 g, p 0,001). Kreftceller inokulert i høyre bakpote ikke lokke fram mekanisk allodyni på motsatt side (Fig. 1a). Samtidig å allodyni, mekanisk hyperalgesi utviklet seg gradvis i tumorbærende rotter. Som målt med Randall-Selitto test, ble det observert en signifikant forskjell mellom ipsilaterale og kontralaterale pote terskler fra dag 18 (30,9 ± 10,8 g, s 0,001) til dag 21 (25,7 ± 7,6 g, s 0.01, fig 1B. ). Disse resultater viser at målbare berørings-fremkalt smerte oppførsel utvikles etter injeksjonen av carcinomceller i femur, som tidligere vist med MRMT-1 celle implantasjon i tibia [24]. Etter smerte deteksjon på dag 14, hadde subkutan administrering av morfin (3 mg /kg) ikke omvendt mekanisk allodyni indusert av tumorprogresjon hos kreftbærende rotter (figur S1).
(A) allodyni ble bestemt ved å bruke von Frey testen følgende svulst implantasjon. Tilbaketrekk terskel avtar gradvis fra dag 11 som svar på nociception overnatting i kreftbærende dyr (n = 10). Kontralateral pote forblir upåvirket, som gjør humbug behandlede ipsilaterale lem (n = 10). (B) Evaluering av hyperalgesi ble utført ved hjelp av Randall-Sellitto-test. Resultatene er uttrykt som den potetilbaketrekning terskel (PWT) forskjell mellom de ipsi- og kontra-laterale bakpoter. Signifikant hyperalgesi ble observert på dag 18 og 21 (n = 10). (C) Kvantifisering av dynamisk vektbærende i de implanterte dyr, uttrykt som en prosentandel av dyrets vekt. En vesentlig forskjell i vektfordeling på hver pote kan observeres fra dag 15. (D) Dynamisk analyse av overflaten av kontakten mellom bakpote og føleren viser lignende resultater ved dag 15, 18 og 21 når de ipsi- og kontralaterale labber er sammenlignet i kreft grupper (n = 7 i hver gruppe). Data er gjennomsnittsverdier ± S.E.M., *: p≤0.05; **: P≤0.01 ***. P≤0.001
Limb ubehag ble først vurdert av statiske vektbærende. Fra dag 15, var halvparten av den ipsilaterale vekt omfordelt til den kontralaterale pote (data ikke vist). For å vurdere en representativ vekt omfordeling tvers over dyrets hele kroppen, uten tvang, utførte vi DWB vurderinger. Kinetikken for overføring til bakpotene var lik de som ble observert i statisk bærende startet rundt dag 12, og øker inntil dag 21 (fig. 1C). Det er imidlertid verdt å merke seg at vekten kompensasjon ble hovedsakelig gjort på andre enn det kontralaterale bakpote kroppsdeler, slik som halen, bunn underliv eller forpotene. Faktisk, på dag 21, ble ca. 50% av vekten båret andre steder enn bakpotene, i forhold til 33% før innsettende smerte (data ikke vist). Følgelig poten overflate i kontakt med gulvet var også signifikant påvirket fra dag 15, sammenlignet med den kontralaterale pote (Fig. 1D). Disse smerte atferd speile klinisk observasjon av gjennombruddssmerter, som oppleves etter bevegelsen av tumorbærende lemmer i bein kreftpasienter.
neuronal og glial plastisitet i kreftbærende dyr
Metastase spredning i rotte femur induserer neuronal aktivering og gliaceller endringer gjennom afferente fibre som stikker til L1-L3 spinal lumbale segmenter.
