Abstract
Bakgrunn
dipeptidyl-peptidase IV (EC 3.4.14.5) (DPPIV) er en serin peptidase involvert i celledifferensiering, adhesjon, immunmodulering og apoptose, funksjoner som kontrollerer neoplastisk transformasjon. Tidligere studier har vist endret uttrykk og aktivitet av vev og sirkulerer DPPIV i flere kreftformer og foreslo sitt potensial nytten for tidlig diagnose i tykk- og endetarmskreft (CRC).
Metoder og hovedfunnene
aktivitet og mRNA og protein uttrykk for DPPIV ble prospektivt analysert i adenokarsinomer, adenomer, uninvolved tykktarmsslimhinnen og plasma fra 116 CRC pasienter ved fluorimetrisk, kvantitativ RT-PCR og immunhistokjemi metoder. Resultatene ble korrelert med de viktigste klassiske patologiske data relatert til aggressivitet og med 5-års overlevelse. Resultatene viste at: 1) mRNA-nivåene og aktiviteten til DPPIV øket i kolorektale svulster (Kruskal-Wallis test, p 0,01); 2) Både adenomer og CRC vises positiv cytoplasma farging med luminal membran forsterkning; 3) plasma DPPIV aktiviteten var lavere i CRC pasienter enn hos friske forsøkspersoner (Mann-U test, p 0,01); 4) plasma DPPIV aktivitet var assosiert med dårligere generelle og sykdomsfrie overlevelse (log-rank p 0,01, Cox analyse p. 0,01)
Konklusjon /betydning
1) Up-regulering av DPPIV i tykktarmssvulster antyder en rolle for dette enzymet i neoplastisk transformasjon av kolorektal vev. Dette funnet åpner muligheten for nye terapeutiske mål i disse pasientene. 2) plasmatisk DPPIV er en uavhengig prognostisk faktor på overlevelse av CRC pasienter. Fastsetting av DPPIV aktivitet i plasma kan være en trygg, minimal invasiv og rimelig måte å definere aggressivitet av CRC i daglig praksis
Citation. Larrinaga G, Perez jeg, Sanz B, Beitia M, Errarte P, Fernández A, et al. (2015) dipeptidyl-Peptidase IV aktivitet er korrelert med tykktarmskreft prognose. PLoS ONE 10 (3): e0119436. doi: 10,1371 /journal.pone.0119436
Academic Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN
mottatt: 07.09.2014; Godkjent: 14 januar 2015; Publisert: 19 mars 2015
Copyright: © 2015 Larrinaga et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra den baskiske regjeringen (IT8-11 /13), Universitetet i Baskerland UPV /EHU (UFI 11/44), og Gangoiti Barrera Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
CRC er den tredje vanligste kreftformen hos menn og kvinner i USA, med mer enn 136,500 estimerte nye tilfeller og mer enn 50.000 anslått dødsfall i 2014 [1]. Europa og andre utviklede regioner viser lignende priser av forekomst og dødelighet [2]. Tradisjonelt relatert til kostvaner [3], har sin frekvens stadig økt i de siste tiårene i vestlige land som følge av moderne livsstil å bli et helseproblem av stor bekymring. Enorme ressurser blir investert i forebygging og tidlig diagnostisering av denne sykdommen. Populasjonsbaserte screening kampanjer prøve å oppdage så mye tidlig svulster og forstadier som mulig, med formål å redusere forekomsten av sykdommen, for å forenkle den kliniske behandlingen av pasienter når lesjonen utvikler, og for å bedre overlevelse.
fra en patologisk perspektiv, er adenomatøse lesjoner i tykktarmen fullt ut akseptert forløpere for CRC [4,5] og den adenom-karsinom sekvens fortsatt gir et solid modell for forskning på karsinogenese [6]. Men et stort antall mobilnettet metabolske prosesser fortsatt i stor grad ukjente involvert i opprinnelsen og utviklingen av neoplastiske prosesser [7].
peptidases spille en sentral rolle i kreftutvikling på flere måter, for eksempel regulering av bioaktive peptider som er avgjørende i neoplastisk vekst og immunrespons, nedverdigende ekstracellulære matrise, fungerer som adhesjonsmolekyler eller deltar i intracellulær signale [8]. Dessuten har noen studier vist at aktivitet og uttrykk av disse enzymene varierer i ulike svulster avhengig av flere patologiske parametere som histologisk Grade, Stage, og pasienten skal overleve [8-12]. Av denne grunn, peptidaser er nyttige verktøy i utviklingen av kliniske strategier for behandling og oppfølging av kreftpasienter.
dipeptidyl-peptidase IV (EC 3.4.14.5) (DPPIV), også kjent som cluster differensieringsantigenet CD26 , er en serin peptidase uttrykt på en rekke forskjellige celler, inkludert epitelial, endotel- og lymfocytter [13]. Som andre membranbundne glykoproteiner, det kan også bli gitt ut i aktiv form for kroppsvæsker som plasma, serum og urin [14]. DPPIV spalter N-terminale dipeptider fra utvalgte bioaktive peptider inkludert noen cytokiner, kjemokiner og nevropeptider, som fører til deres inaktivering og /eller degradering. Uavhengig av dets enzymatiske aktivitet, samvirker med DPPIV ekstracellulære matriks (ECM) komponenter, inkludert kollagen og fibronectin, således regulere celle-celle og celle-ECM-interaksjoner, og med flere reseptorer og proteaser som fører til sekresjon av matriks-metallproteaser (MMP’er). Gjennom disse flere funksjoner, regulerer DPPIV ulike biologiske prosesser inkludert celledifferensiering, adhesjon, immunmodulering og apoptose, funksjoner som kontrollerer neoplastisk transformasjon [13].
Mange studier har beskrevet at DPPIV uttrykk og aktivitet er vesentlig endret i flere solide tumor vev, og at disse endringene er assosiert med svulst klasse, scene og pasienter fem års overlevelse, som peker på dette enzymet som et diagnostisk verktøy og terapeutisk mål [12,13,15]. Videre har det blitt påvist at blod DPPIV nivåene er signifikant lavere hos kreftpasienter enn hos friske individer, et funn som har blitt av stor interesse for utvikling av tilleggs tumor markører [14,16-19].
Når det gjelder CRC, to nyere studier beskrevet som høyere immunhistokjemisk uttrykk for DPPIV i CRC vev er korrelert med metastaser og verre total overlevelse av CRC pasienter [20] og at sirkulerende DPPIV nivåer er korrelert med fjernmetastaser fra CRC [21]. Vi og andre grupper beskrev også at uttrykket og aktiviteten profilen til andre serin peptidaser relatert med DPPIV varierer gjennom adenom-adenokarsinom sekvens og som er uavhengig korrelert med overlevelsen av CRC pasienter [22-26]. Alle disse akkumulerte bevisene peker analysene av serin peptidases som DPPIV som lovende verktøy i utformingen av nye diagnostiske /prognostiske biomarkører og terapeutiske mål i CRC [14,20-26].
I denne sammenheng Formålet med den foreliggende arbeidet var å studere på en potensiell måte metabolske og ekspresjons-profiler av DPPIV hos pasienter med CRC analysere vev fra adenom-adenokarsinom sekvens og plasmaprøver, og for å korrelere de oppnådde resultatene med klassiske histopatologiske parametre for tumor prognose og overlevelse .
Materialer og amp; Metoder
Forfatterne erklærer at alle eksperimenter utført i denne studien i samsvar med gjeldende spanske og EU lovbestemmelser. Prøver og data fra pasienter som er inkludert i denne studien ble gitt av den baskiske Biobank for Forsknings OEHUN (www.biobancovasco.org). Alle pasientene ble informert om den potensielle bruk for forskning av sine kirurgisk resected vev, og akseptert denne eventualitet ved å signere et bestemt dokument godkjent av etiske og vitenskapelige komiteer i Baskerland Public Health System (Osakidetza) (CEIC 11/51).
pasienter
totalt 116 pasienter med CRC ble prospektivt inkludert i studien. Alle pasienter fikk delvis colectomies. Den topografiske fordelingen var 41 høyresidig CRC, 51 venstresidig og 24 fra endetarmen. 7 pasienter fikk preoperativ behandling, 49 pasienter fikk kjemoterapi eller cellegift eller strålebehandling etter reseksjon, og 60 pasienter fikk ingen behandling.
I 20 pasienter, både adenomatøse og adenocarcinomatous polypper ble diagnostisert. 13 adenomer var rørformet, 6 var tubulovillous adenomer, og en villøse adenom. I tillegg 16 viste mild til moderat dysplasi og 4 viste høy klasse dysplasi. Den gjennomsnittlige størrelse var 2.1cm (med en rekke 0.6-4cm). Disse 20 sakene ble brukt til å analysere DPPIV aktivitet og mRNA /protein uttrykk gjennom normal slimhinne-adenom-adenokarsinom sekvens.
Den amerikanske Joint Committee on Cancer system (AJCC, 7
th edition) [27 ] har blitt brukt for å tildele Stage og Grade. Oppfølging ble stengt av 30. juni 2014. På den tiden var 43 pasienter (37%) hadde dødd av sykdommen. Gjennomsnittlig oppfølgings ble 53 måneder (spredning 4-88).
Plasma ble også samlet preoperativt og analysert i 98 av disse pasientene. Plasma fra 72 friske frivillige uten klinisk historie av neoplastiske sykdommer ble brukt som kontrollprøve.
Kliniske data inkludert i studien ble hentet fra pasient kliniske poster og er oppsummert i tabell 1.
vevsprøver
Operasjon resections ble sendt
i frisk
til patologi Lab innenfor en periode på 30 minutter etter fjerning. Materialet for denne studien kommer fra overflødig vev av patologisk diagnose. Håndtering av prøver ble utført etter vanlige protokoller for håndtering av kirurgiske reseksjoner av tykktarm og endetarm [28]. Tumor egenskaper ble gjenkjent på brutto undersøkelse og utvalgte fragmenter av svulsten og ikke tumorvev ble frosset i isopentan og lagret ved -80 ° C. Rutinemessige prosedyrer i patologi Lab inkludert formalin fiksering av kirurgisk prøven og parafin innebygging av vev fragmenter som er valgt for histopatologisk undersøkelse. Histologiske snittene ble farget med hematoksylin-eosin. Dessuten ble perifere venøse blodprøver fra 98 av disse pasientene innhentet før operasjonen og sentrifugert ved 1500 rpm i løpet av 15 minutter. Den oppnådde plasma ble også lagret ved -80 ° C. Enzymanalysen ble utført i plasma fås fra 72 friske frivillige (sammenlignbare med kjønn og alder).
Prøvepreparering
Eksplanterte tumorprøver ble homogenisert i 10 mM Tris-HCl buffer ved pH 7,4, i 30 sekunder ved 800 rpm ved hjelp av en Heidolph PZR 50 Selecta homogenisator, og ultrasentrifugert i en Centrikon T-2070 Kontron Instruments apparat på 100 000
g
i 35 minutter. For å unngå forurensning med vannløselige enzymer, ble de resulterende pellets ble vasket tre ganger ved suspensjon i 10 mM Tris-HCl-buffer ved pH 7,4. Pelletene ble deretter homogenisert i 10 mM Tris-HCl-buffer ved pH 7,4, og sentrifugert ved lav hastighet (1500
g
) i 3 minutter for å rense prøvene. De således oppnådde supernatantene ble anvendt for å bestemme DPPIV aktivitet og proteinkonsentrasjoner. Alle de ovennevnte trinn ble utført ved 4 ° C.
DPPIV aktivitetsmålinger
DPP IV-aktivitet ble målt in triplo ved bruk av H-Gly-Pro-β-naftylamid som substrat, etter en modifisert versjon av fremgangsmåten ifølge Alponti et al. [29]. Analysen er basert på fluorescens av produkter generert fra hydrolysen av substratet med enzymet. Reaksjoner ble initiert ved tilsetning av 30-50 pl av prøven til 1 ml av den passende inkubasjonsblandingen (50 mM Tris-HCl-buffer, pH 7,4, og 0,2 mM aminoacyl-β-naftylamid). Etter 30 min inkubasjon ved 37 ° C, ble 1 ml av 0,1 M natriumacetat buffer (pH 4,2) tilsatt til blandingen for å avslutte reaksjonen. Den frigjorte produkt ble bestemt ved å måle den fluorescerende intensitet med en Shimadzu RF-540 Spectrofluorophotometer (eksitasjon og emisjonsbølgelengder var 345 og 412 nm, henholdsvis). Blanks ble anvendt for å bestemme bakgrunnsfluorescens. Den relative fluorescens ble omdannet til picomol av produktet ved hjelp av en standardkurve konstruert med økende konsentrasjoner av β-naphthylamine.
Hvis du vil kontrollere at dannelsen av β-naftylamin (β-NA) var på grunn av handlingen av DPPIV og ikke på grunn av andre enzymer, utførte vi hemmingsforsøk i CRC vev og plasma med en spesifikk hemmer av enzymet (diprotin A, 0,2 mM). Den frigjøring av β-NA ble hovedsakelig inhibert i kolorektale vev (82%) og i plasmaprøver (86%).
Proteinkonsentrasjonen ble målt in triplo ved Bradford-metoden [30] under anvendelse av BSA (1 mg /ml) som kalibrator. Resultatene fra de CRC-vev og fra plasmaprøver ble tatt opp som enheter av peptidase pr milligram protein (OPP /mg prot) og per liter plasma (OPP /L), respektivt. En enhet av peptidase-aktivitet (UP) er den mengde enzym som kreves for å frigjøre ett pmol av β-naftylamin per minutt. Fluorogene analyser var lineær med hensyn til hydrolyse tid og proteininnhold.
Immunohistochemistry
Formalin-fiksert og parafin-embedded vev fra 20 CRC, adenomatøse polypper og uninvolved omliggende slimhinnen ble immunostained med et monoklonalt antistoff spesifikt for DPPIV /CD26 (Novus Biologicals NB 100-59021, kanin anti-human, arbeider fortynning 1: 250). Den farging prosessen ble utført følgende rutinemessige metoder i en automatisk immunostainer (Dako Autostainer Plus). Kort sagt, ble endogen peroksidaseaktivitet blokkert ved inkubering av lysbildene i 3% hydrogenperoksid i absolutt metanol i 10 minutter. Antigen gjenfinning ble utført i citrat-buffer (10 mM, pH = 6) i 15 minutter ved 100 ° C i en mikrobølgeovn. Det primære antistoff ble applisert i 1 time ved romtemperatur. En etterfølgende reaksjon ble utført med sekundære antistoffer og biotin-fri HRP enzym-merkede polymer av den EnVision-Flex deteksjonssystem (Dako, Carpinteria, CA). Ikke-spesifikk IgG ble anvendt som en negativ kontroll. En positiv reaksjon ble visualisert med diaminobenzydine løsning etterfulgt av kontra med haematoxylin.
Real-time kvantitativ RT-PCR analyse
uttrykk for
DPP4
, genet som koder DPPIV ble analysert i vev fra 20 CRC, adenomatøse polypper og uninvolved rundt slimhinnen. For å unngå degradering, ble vevssnitt neddykket i RNAlater umiddelbart etter kirurgi og lagret ved -80 ° C inntil behandling. Total RNA ble ekstrahert fra 20 mg vev ved hjelp av TriReagent (Sigma, St. Louis, MO). RNA-prøvene ble deretter inkubert med RNase-fri DNase I og RNasin (Promega, Madison, WI) for å fjerne gjenværende genomiske DNA. Første-tråd cDNA ble syntetisert fra 5 ug av total-RNA fra hvert human prøve ved anvendelse av første-tråd cDNA syntese-sett (Roche, Mannheim, Tyskland). De resulterende cDNA-prøvene ble amplifisert ved hjelp av PCR med spesifikke oligonukleotid-primerpar konstruert med analyseprogramvare Primer 3 og syntetisert av Sigma-Genosys (Cambridge, UK). Basert på tidligere forsøk på human nyrecellekreft [15], [12] CRC og andre humane vev [31] valgte glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (
GAPDH
), polymerase (RNA) II (DNA- regisserte) polypeptid A (
POLR2A
), hypoxantin phosphoribosyltransferase 1 (
HPRT1
), β-aktin (
ACTB
), succinatdehydrogenase komplekse, underenhet A (
SDHA
), TATA boks bindende protein (
TBP
) og peptidylprolyl isomerase A (
PPIA
) som endogene referanse gener. Sekvensen av primere som brukes til å forsterke
DPP4
og de syv husholdningsgener er vist i tabell 2.
uttrykk for
DPP4 Hotell og housekeeping gener var kvantifisert i alle cDNA ved real-time PCR bruker iCycler iQ sporing i sanntid apparat (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA). Forsøk ble utført i det vesentlige som beskrevet tidligere [12,15,32]. Fortynninger av cDNA malen ble fremstilt fra hvert vev og forsterkes i tre eksemplarer ved hjelp SensiFAST SYBR Mix (Bioline Ltd., London, UK). Tre negative kontroller (med ingen mal, ingen revers transkriptase og ingen RNA i revers transkriptase reaksjons) ble også inkludert i hver plate for å detektere eventuell forurensning. Etter en varmstart (10 min ved 94 ° C), parametrene som benyttes for PCR-amplifikasjon ble: 10 s ved 94 ° C, 20 s ved 60 ° C og 30 s ved 72 ° C, for 50 sykluser
Sanntids tids~~POS=HEADCOMP PCR-data ble uttrykt som ganger endring av mål-genekspresjon i forhold til den geometriske middelverdi (g) mRNA ekspresjon av husholdningsgener i hver prøve, som beskrevet av Vandesompele et al. [33]. Den ganger endring i gen-ekspresjon ble beregnet ved følgende formel: 2
-ΔΔ C
T, hvor C
T er den terskelsyklusen, beregnet av iCycler programvare, A C
T = (C
Ttarget gen-C
Tg.m.reference gener) og ΔΔC
T = (A C
tTest sample-A C
TCONTROL prøve).
Prøver fra samme pasient alltid ble målt på samme analytiske kjøring for å utelukke mellom premiere variasjoner. PCR-data oppnådd i et av de normale CRC prøver ble vilkårlig valgt som kontroll, og denne prøve ble inkludert i alle PCR-eksperimenter for å korrigere for mulige variasjoner inter.
Statistisk analyse
Kolmogorov-Smirnov og Shapiro-Wilk tester ble anvendt på data oppnådd fra vev og plasmaprøver henholdsvis for å vite om det numrene fulgt eller ikke en normalfordeling. Basert på denne informasjonen (p 0,05), DPPIV aktivitet i vev og plasma ble analysert med ikke-para prober: Mann-Whitney test og Kruskal-Wallis tester ble brukt for å påvise forskjeller mellom to eller tre grupper, henholdsvis
til slutt, Kaplan-Meier-kurver og log-rank test ble utført for å vurdere sammenhengen mellom DPPIV aktivitet og 5-års overlevelse, sammenligner grupper som er opprettet av cut-off poeng basert på mottakerende karakteristiske (ROC) kurver. En Cox regresjonsmodell ble anvendt for å teste de uavhengige effektene av kliniske og patologiske variabler og DPPIV aktivitet på overlevelse. SPSS® 21,0 programmet ble brukt for statistisk analyse.
Resultater
DPPIV aktivitet og uttrykk i kolorektal vev fra CRC pasienter
Når DPPIV aktivitet ble analysert i løpet av kolorektal adenoma- adenokarsinom sekvens, høyere aktivitet ble funnet i CRC og adenomer enn i det tilstøtende affisert slimhinne (Kruskal-Wallis-test, p = 0,015).
DPP4
mRNA uttrykk viste et lignende mønster, med høyere nivåer i begge svulster enn i den ikke svulstvev (Kruskal-Wallis test, p = 0,001). Disse resultatene er beskrevet i Tabell 3.
Når data ble fordelt etter topografisk fordeling av CRC, har vi ikke funnet noen signifikant forskjell (Kruskal-Wallis test, p = 0,965). Tissue DPPIV aktivitet var også lik mellom pasienter som fikk preoperativ behandling, postoperativ behandling og pasienter som ikke fikk noen behandling etter reseksjon (Kruskal-Wallis test, p = 0,842).
Fig. 1 viser immunhistokjemiske ekspresjon av DPPIV i kolon adenokarsinom, adenom og normal tilstøtende mucosa. Normal slimhinnen uttrykte ikke DPPIV farging. Men begge adenomer (rørformet, tubulovillous og villous) og CRC vises positiv cytoplasma farging med luminal membran forsterkning. Den inflammatorisk komponent i alle tilfeller var også positiv.
DPPIV farging ligger i cytoplasma av adenomer og CRC celler viser luminal membran forsterkning.
Tissue DPPIV aktivitet i henhold til fem år overlevelse og til patologisk egenskaper
for å finne de beste cut-off verdier for total overlevelse (OS) (fig. 2A) og sykdomsfri overlevelse analyser (DFS) (fig. 2B), ROC-kurver ble utført. For vev DPPIV aktivitet, viste 2600 UP /mg protein cut-off point de mest optimale sensitivitet og spesifisitet forhold (SE = 47% og Sp = 55% for OS, og SE = 48% og Sp = 55% for DFS) (fig . 2A og 2B)
Optimal sensitivitet og spesifisitet forhold ble observert ved hjelp av følgende cut-off verdi:.. 2600 UP /mg prot vev DPPIV aktivitet for OS (A) og DFS (B)
Kaplan-Meier-kurver og log-rank test viste at fem års OS og DFS av pasienter med CRC ikke var korrelert med vev DPPIV aktivitet (log-rank test, p = 0.8 for OS, og p = 0,67 for DFS) (fig. 3A og 3B, henholdsvis).
total overlevelse (A) og sykdoms-frie overlevelseskurver (B) av CRC-pasienter ifølge deres tumor DPPIV aktivitetsmønster. Antallet pasienter med risiko i hver gruppe på individuelle tidspunkter er også inkludert.
På samme måte, lagdeling av DPPIV aktivitet ved flere patologiske variabler ikke kaste noen statistisk signifikant resultat (tabell 4).
DPPIV aktivitet i plasmaprøver fra CRC pasienter
i plasma fra CRC pasienter DPPIV aktivitet var betydelig lavere enn hos friske individer (175 ± 7,2 UP /L vs. 218 ± 10,1 UP /L, Mann-Whitney test p 0,01) (figur 4).. Men lagdeling av data i henhold til patologiske variabler ikke ga noen signifikant resultat (tabell 5).
Verdiene er gjennomsnitt ± SE av enheter av peptidase per liter plasma (OPP /L). (*) Student T test, p. 0,01
I plasmaprøver ROC-kurver ble utført både for DPPIV aktivitet og carcinoembryonic antigen (CEA) nivåer. For plasma DPPIV aktivitet, viste 165 UP /L cut-off verdi de mest optimale sensitivitet og spesifisitet forholdstall (SE = 64% og Sp = 63% for OS, og SE = 65% og Sp = 58% for DFS) (Fig. 5A og 5B). En cut-off-verdi på 5 ng /ml for CEA, som er kjent for å ha en prognostisk innvirkning på CRC [34], viste lavere følsomhet (44% for OS, og 39% for DFS), men høyere spesifisitet (68% for OS og 64% for DFS) enn DPPIV (figur 5A og 5B)
optimal følsomhet og spesifisitet forhold ble observert ved anvendelse av følgende cut-off-verdi.:. 165 UP /L for plasma DPPIV aktivitet både for OS ( A) og DFS (B). En cut-off verdi på 5 ng /ml for CEA, viste lavere følsomhet, men høyere spesifisitet enn DPPIV.
Kaplan-Meier-kurver og log-rank test viste at både OS (Fig. 6) og DFS (fig. 7) ble inverst korrelert med plasmatisk DPPIV aktivitet. Så når plasma DPPIV aktiviteten var høyere enn 165 UP /L OS og DFS var betydelig verre (log-rank p = 0,009 og = 0,018, henholdsvis) (fig. 6A og 7A).
(A) Kaplan-Meier kurve og log-rank test. (B) multivariat analyse av clinicopathologic variabler og plasma DPPIV aktivitet i å forutsi OS. Antallet pasienter med risiko i hver gruppe på individuelle tidspunkter er også inkludert.
(A) Kaplan-Meier kurve og log-rank test. (B) multivariat analyse av clinicopathologic variabler og plasma DPPIV aktivitet i å forutsi DFS. Antallet pasienter med risiko i hver gruppe på individuelle tidspunkter er også inkludert.
På den annen side viste multivariat analyse at plasma DPPIV aktivitet (p = 0,001), histologisk grad (p = 0,02 ) og lokal invasjon (p = 0,01) var uavhengige faktorer som påvirker pasient OS (fig. 6B), og at plasma DPPIV aktivitet (p = 0,005), vaskulær invasjon (p = 0,02) og gruppert trinn (p = 0,02) var uavhengig prognostisk faktorer av DFS (fig. 7B).
Diskusjoner
Ondartet transformasjon fra normal til kreftvev er assosiert med celleoverflate glykoprotein modifikasjoner. Disse fenotypiske endringer kan spille en avgjørende rolle i onkogenese og kan være nyttige tumormarkører i skille ondartede fra godartede vev [8]. Når det gjelder CRC, adenom-karsinom-sekvensen i tykktarmen beskriver at den gradvis progresjon fra normalt til dysplastisk epitel, og dermed til karsinom, er et resultat av den suksessive akkumulering av genetiske mutasjoner som fører til endrede nivåer av flere glykoproteiner, som noen peptidaser [6,8].
den første relevante resultatet i vår studie var at DPPIV viste høyere aktivitet og mRNA nivåer i preneoplastiske adenomatøse lesjoner og i CRC sammenlignet med uninvolved omkringliggende slimhinner, selv om det ikke korrelerer med patologisk variabler og med fem-års overlevelse av CRC pasienter. Tidligere ble det rapportert at aktiviteten og ekspresjon av to andre serin-peptidaser, fibroblast aktiveringsprotein alfa (FAP) og prolyl-endopeptidase (PEP), var høyere i adenomer og i tidlige stadier av CRC henholdsvis [22,24]. I tillegg FAP uttrykk korrelert med dårligere overlevelse [22,23] og PEP aktivitet gjorde det med et bedre samlet og sykdomsfri overlevelse [25]. Selv om disse avvikende påvirkninger på CRC prognose tyder ulike skuespillerroller for disse serin peptidases i denne sykdommen, bør uttrykket og aktiviteten øker for disse peptidases i neoplastiske og preneoplastiske vev tas hensyn til ved utformingen av nye terapeutiske tilnærminger for tykktarmskreft.
på grunn av sin variable uttrykk på solide svulster og dens mangfoldige biologiske funksjoner, den eksakte rolle som DPPIV spiller i kreft er ikke avklart. Det har blitt beskrevet som DPPIV enten kan fremme eller hemme tumorutvikling avhengig av den spesifikke typen av tumor eller på den fase av utviklingen tumoren er [13]. Dette fenomenet svulst spesifisitet fastsetter praktiske problemer når du søker peptidaseinhibitorer i kreftbehandlingen, og dette punktet blir aktivt etterforsket i dag [35,36]. En ny utvikling på dette emne består i bruken av cytotoksiske prodrugs aktivert for å bli aktivert av spesifikke peptidaser bare hvor disse peptidaser er mer aktive eller høyt uttrykt, med formål å skade den neoplastiske cellen uten å modifisere enzymet funksjonaliteten [35,36]. Noen etterforskere arbeider i prodrugs med FAP som et mål [35]. Siden homolog DPPIV er også svært aktiv i adenomer og CRC, foreslår vi at dette serin peptidase kan være målet for tilsvarende forløpere.
Cell-overflate glykoproteiner kan frigis til det ekstracellulære rom, vises i ulike kroppsvæsker og har blitt nyttig serum eller plasma biomarkører for å hjelpe i screening, diagnostisering, staging, prognose og overvåking kreftbehandling. Den mest aktuelt eksempel i den kliniske følgende av CRC pasienter er det carcinoembryonic antigen (CEA) [34]. Imidlertid har analysen av DPPIV i plasma eller serum av disse pasientene viste seg å være en pålitelig metode i tidlig deteksjon av CRC, å være komplementær til den klassiske blod i avføringen eksamen og andre serum biomarkører som er under klinisk undersøkelse i dag [14, 17-20].
Flere forfattere [14,17,19] har beskrevet reduksjon i sirkulerende nivåer av DPPIV av CRC pasienter sammenlignet med friske personer. I tillegg er økninger av dette enzymet ble observert i serum av metastatisk
vs
. ikke-metastaserende pasienter [14,17,19,20]. Disse data ble erholdt ved immundeteksjon, hvilket antyder den potensielle nytten for tidlig diagnose og klinisk oppfølging. Vi oppdaget også at aktiviteten til DPPIV målt ved fluorimetriske metoder var betydelig redusert i plasma hos pasienter CRC. Derimot fant vi at denne aktiviteten ikke var korrelert med metastatisk status eller med annen patologisk variabel.
De høye forskjeller i antall pasienter mellom gruppene med og uten metastaser kan være på opprinnelsen til denne delvise avvik. Andre årsaker bør også tas i betraktning fordi det er blitt beskrevet at flere biologiske fenomener kan påvirke aktiviteten av sirkulerende DPPIV /CD26 uten å påvirke proteinnivået. I denne forstand er blitt rapportert tilstedeværelse av sirkulerende molekyler som endrer aktiviteten av dette enzym [37,38]. Nazarian et al. [38] har vist i en veldig fersk undersøkelse at metastatisk prostatakreft pasienter som presenteres redusert sirkulerende DPPIV aktivitet mens proteinnivået var like med hensyn til pasienter med lokalisert primærtumor. Dette funnet peker til et sirkulerende lite peptid som en mulig årsak til dette hemming [38] og åpner nye perspektiver for videre studier for å klargjøre den potensielle nytten av den kombinerte analysen av DPPIV aktivitet og proteinnivåer i serum /plasma hos kreftpasienter.
Siden plasmanivåer og aktiviteter av PEP og FAP er også korrelert med overlevelsen av CRC pasienter [19,25], et hovedmål med studien var å analysere prospektivt sammenhengen mellom plasma aktiviteten sin homolog DPPIV og 5 års overlevelse for pasientene. Dataene viste at pasienter med høyere plasma DPPIV aktiviteter hadde dårligere generell og sykdomsfri overlevelse. Disse data viste bedre sensitivitet, men dårligere spesifisitet enn de som oppnås med CEA. Den multivariat analyse viste at DPPIV er en uavhengig prognostisk faktor som påvirker CRC pasientens overlevelse. Derfor er det overbevisende bevis på at fastsettelse av sirkulerende DPPIV kan være nyttig i tidlig diagnostisering [14,17-19,21] og også i prognosen for CRC.
Opprinnelsen av sirkulerende DPPIV hos pasienter med kreft er en kontroversiell sak. Aktuelle hypoteser plassere sin opprinnelse i leveren og immunceller [14] og i svulstens mikromiljø [8,14,19,38]. Vi utførte immunhistokjemisk analyse hele adenom-karsinom sekvens for å vite plasseringen av DPPIV i kolorektal vev. Ikke neoplastiske celler av tykktarmsslimhinnen ikke flekken med DPPIV. I motsetning adenom og CRC-celler viste positiv cytoplasmatisk farging med luminale membranen forsterkning. Dette immunhistokjemisk mønster enig med høyere aktivitet og mRNA nivåer vi har også funnet i svulster. I tillegg fant vi farging med DPPIV i de inflammatoriske cellene i lamina propria i normal og neoplastisk slimhinne. Dette funnet kan tyde på at DPPIV frigjøres fra både immune og neoplastiske celler i CRC.
I konklusjonen, viser denne studien at DPPIV er oppregulert i adenomatøse og CRC vev sammenlignet med uninvolved slimhinnen. Plasma DPPIV aktiviteten er lavere enn hos friske personer og er uavhengig assosiert med dårligere 5-års overlevelse i CRC pasienter. Den DPPIV aktivitetsbestemmelse i plasma er en trygg, minimalt invasiv og billig fremgangsmåte, og kan være komplementært til bestemmelse av CD26 protein nivåer CRC-pasienter. Nye studier med høyere antall pasienter, samle preoperativ og postoperative plasmaprøver på flere tidspunkter [21], skal utføres for å bekrefte den prediktive verdien av disse resultatene på diagnostisk tid og i løpet av pasientenes oppfølging.
takk
Vi ønsker å takke Arantza Pérez (UPV /EHU) for hennes tekniske bidrag til denne studien og professor Juan Bilbao (UPV /EHU) for hans statistisk støtte.
