Abstract
Poly (ADP-ribose) polymerase-en (PARP-1) og autofagi spille stadig viktigere rolle i DNA-skade reparasjon og celledød. Gemcitabin (GEM) forblir førstelinje kjemoterapeutiske stoffet for kreft i bukspyttkjertelen (PC). Men lite er kjent om forholdet mellom PARP-1 uttrykk og autofagi som svar på GEM. Her viser vi at GEM induserer DNA-skader respons og nedbrytning av mono-ADP ribosylert PARP-en via autofagi sti i PC-celler, som blir reddet ved å hemme autofagi. Hypoksi og serum sult hemme autophagic aktivitet på grunn avskaffet GEM-indusert mono-ADP-ribosylert PARP-en degradering. Aktivering av ekstracellulære regulerte proteinkinaser (ERK) indusert av serum sult viser forskjeller i intracellulær lokalisering samt modulering av autofagi og PARP-en degradering i GEM-sensitive KLM1 og -resistente KLM1-R celler. Vår undersøkelse har avdekket en ny rolle autofagi i PARP-en degradering som svar på GEM, og de ulike konsekvensene av MEK /ERK signalveien på autofagi mellom GEM-sensitive og motstandsdyktig PC celler
Citation. Wang Y, Kuramitsu Y, Tokuda K, Baron B, Kitagawa T, Akada J et al. (2014) Gemcitabine induserer Poly (ADP-Ribose) Polymerase-en (PARP-1) Nedbrytning gjennom Autophagy i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 9 (10): e109076. doi: 10,1371 /journal.pone.0109076
Redaktør: Shaida A. Andrabi, Johns Hopkins University, USA
mottatt: 11 oktober 2013; Godkjent: 08.09.2014; Publisert: 01.10.2014
Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet av tilskudds no. 24501352, www.jsps.go.jp/g-grantsinaid. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
gemcitabin (GEM) er i dag standard behandling for avansert og metastatisk kreft i bukspyttkjertelen (PC) i både adjuvant og palliativ innstillinger, men motstanden mot GEM har vært et stort problem som sitt svarprosenten er redusert til 20% [1] – [4]. GEM kan inhibere DNA-syntese ved å målrette ribonukleotid reduktase, som fører til dens inkludering inn i cellulært DNA og forårsaker DNA-replikasjonsfeil [5], [6]. En tidligere studie har rapportert at GEM-indusert DNA replikasjon stresset, stoppet opp replikering gafler og utløste sjekkpunktsignalveier [7]. Inhibering av kontrollpunktet kinase 1 (Chk1) med kjemiske inhibitorer induserte sensibilisering av PC-cellene i respons til GEM [8], [9]. Videre mismatch repair-mangel HCT116-celler er mer følsomme
in vitro
til GEM-mediert bestrålingssensibilisering [8]. Selv om bevis har vist sammenhengen mellom DNA-reparasjon og sensibilisering av celler til GEM er de mekanismene som er ansvarlig for reparasjon av GEM-indusert DNA-skader ikke klart forstått.
Autophagy er en mobil sti involvert i rutinen omsetningen av proteiner eller intracellulære organeller med nære forbindelser til sykdom hos mennesker og fysiologi [10]. Autophagic dysfunksjon er forbundet med kreft, nevrodegenerasjon, mikrobiell infeksjon og i tillegg til motstand av kreftceller til anticancerterapi [11], [12]. GEM indusert autophagy i Panc-1 og MiaPaCa-2-celler, og hemming av autophagy av 3-metyladenin (3-ME) eller vakuolen membranprotein en knockdown redusert apoptose i gemcitabin-behandlede celler [13]. Derfor er dette bevis indikerer at autofagi kan spille en viktig rolle i apoptose av PC celler i respons til GEM.
Poly (ADP-ribose) polymerase-en (PARP-1) spiller viktige roller i mange molekylære og cellulære prosesser , inkludert DNA-skade reparasjon, genomstabilitet, transkripsjon og apoptose [14]. PARP1 er involvert i reparasjon av både enkelttrådet DNA (ssDNA) og dobbel tråd DNA (dsDNA) pauser ved å binde med DNA-ender, og /eller i samspill med DNA reparasjon proteiner, eksempelvis (Ataxia telangiectasia mutert) minibank og Ku subenheter [15 ] – [18]. Hemming av PARP-1 øker cytotoksisitet av DNA-skadende midler og stråling
in vitro product: [19]. PARP-1-inhibitorer er blitt rapportert som potensielle kjemoterapeutiske legemidler for BRCA1 /BRCA2-mangelfull brystcancer og lungecancer [20] – [21]. Således er det nødvendig å vurdere endringer av PARP-1 er ansvarlig for GEM-indusert DNA-skade i PC.
I den foreliggende undersøkelse har vi vise at mikrotubulus-assosiert protein 1A /1B-lettkjede 3 (LC3) en nøkkelfaktor for autophagosome formasjon, er nedregulert i KLM1-R i forhold til KLM1 celler. GEM induserte en DNA-skader respons og autofagi i KLM1 og KLM1-R celler og nedregulert PARP-1 uttrykk. Hemming av autofagi blokkert GEM-indusert nedbrytning av mono-ADP ribosylert PARP-1. MEK /ERK signalveien viste en annen virkning på autofagi og GEM-indusert PARP-en degradering mellom KLM1 og KLM1-R celler. Dermed har vi markere ny innsikt om autofagi vei i å regulere PARP-en degradering i PC-celler.
Materiale og metode
Material
U0126 (9903S) og Wortmannin (9951S) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology. Antistoffene er spesifikke for p-ERK (sc-7383), ERK (sc-94200), p21 (sc-65595), Hsp27 (sc-13132), PARP-1 (sc-8007 for western blot og sc-1562 for bekreftelse og immunfluorescens), CtIP (sc-3970) og aktin (sc-1616) ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology. Antistoffene er spesifikke for LC3A /B (4108S), SIRT6 (12486), caspase-3 (9665) og PI3KCIII (4263S) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology. Antistoffene er spesifikke for BCL2 (B3170), Ulk1 (SAB4200106) og Beclin1 (B6061) ble kjøpt fra Sigma. Antistoffene er spesifikke for AMPKα1 (07-350) ble kjøpt fra Millipore.
Cell kultur
Alle cellelinjer brukt i denne studien ble tidligere utgitt cellelinjer som ble gitt til oss som en gave . Menneskelig bukspyttkjertelen cellelinje KLM1 (ID: TKG0490) ble klonet og etablert av Dr. Kobari M fra Institute of Department, aldring og kreft, Tohoku University (Sendai, Japan) i 1996 [39]. GEM-sensitive KLM1 og -resistente KLM1-R menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer ble sjenerøst gitt som en gave ved Kirurgisk avdeling og Science ved Kyushu-universitetet Graduate School of Medical Science. KLM1-R er etablert utsette KLM1 celler til GEM i tidligere studier [40] – [41]. Disse cellene ble dyrket i Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI 1640; GIBCO, 05918), supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS, GIBCO, 26140-079), og 2 mM L-glutamin, og inkubert ved 37 ° C i en fuktet inkubator inneholdende 5% CO
2.
Transient transfeksjon
KLM1 celler ble sådd og inkuber ved 37 ° C i en CO
2 inkubator inntil cellene er 70% konfluent. Cellene ble transfektert med validerte human LC3B siRNA (sc-43390, Santa Cruz Biotechnology) eller kontroll siRNA (sc-37007, Santa Cruz Biotechnology) ved å følge en siRNA Transfeksjon Protocol (Santa Cruz Biotechnology).
Western blotting
cellene ble lysert med lyseringsbuffer ((1% NP-40, 1 mM natrium-vanadat, 1 mM PMSF, 50 mM Tris, 10 mM NaF, 10 mM EDTA, 165 mM NaCl, 10 mikrogram /ml leupeptin, og 10 ug /ml aprotinin) på is i 1 time. Cellelysatene ble deretter sentrifugert ved 15 000 x g i 20 minutter ved 4 ° C. supernatanten ble oppsamlet, og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved Lowry-analysen. Like mengder protein (20 ug) ble oppløst ved 5-20% SDS-polyakrylamidgel og deretter overført til PVDF-membran (Immobilon-P, Millipore, Bedford, MA).. membranen ble inkubert med det passende primære antistoff ved 4 ° C over natten deretter ble membranen vasket og inkubert med en pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. de immunoblot ble gjort synlige med en kjemiluminescens-reagens (Immunostar, Wako). Alle eksperimenter ble gjentatt tre ganger.
Immunofluorescence
Cellene ble dyrket på 15 mm runde dekkglass i 12 brønners plater i en tetthet på 1 x 10
5 celler per brønn. Cellene på objektglassene ble fiksert med ferske 3,7% paraformaldehyd i fosfatbufret saltvann (PBS) i 30 minutter når de nådde 70-80% konfluens. Prøvene ble så vasket med PBS, etterfulgt av permeabiliseringen med 0,1% Triton X-100 i 15 min. Etter vasking med PBS ble de inkubert i blokkeringsløsning (1% geiteserum eller 1% esel serum i PBS med 0,1% Tween 20) i 1 time ved romtemperatur. Celler ble behandlet med et primært antistoff i blokkerende oppløsning over natten ved 4 ° C. Etter inkubasjon med primært antistoff, ble cellene renset med PBS med 0,1% Tween 20 (PBS-T) og inkubert med et sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. Etter vasking med PBS-T, deres kjerner var kontra farget med 1,43 uM DAPI (4,6′-diamidino-2-fenylindol) i 5 minutter. Dekk ble vasket med PBS-T, deretter montert med forsiden ned på objektglass med Fluoromount (Diagnostiske Biosystems, Pleasanton, CA, USA). Confocal bilder ble oppnådd ved hjelp av Nikon Plan Apo 60x /1,40 objektiv, BZ-9000-serien (BIOREVO) og BZ-II Viewer programvare (Keyence, Osaka, Japan) av en operatør som var uvitende om den eksperimentelle tilstand. Alle parametere ble holdt konstant innenfor hvert forsøk. Digitale bilder ble analysert, og den gjennomsnittlige intensitet ble målt ved hjelp av Image J. programvare.
Apoptose assay
Et passende antall celler som ble belagt og behandlet i 24 timer. Cellene ble farget ved hjelp av Apo-BrdU
In Situ
DNA-fragmentering Assay kit (80101, Biovision, Inc.) (data ikke vist) eller Kaspaser 3/7 analysesett (12D51, immunokjemisystemer Technologies, LLC.). Disse eksperimentene ble utført strengt å følge instruksjonene i de relative protokoller.
Resultater
gemcitabin (GEM) induserer autofagi i PC-celler
To PC kreft cellelinjer GEM-sensitiive KLM1 og motstandsdyktig KLM1-R, ble brukt i denne studien. Disse cellelinjene er definert av deres ekspresjon av varmesjokkprotein 27 (Hsp27) (Fig 1 A og B.), Som har blitt rapportert som en mulig markør for PC-resistente mot GEM [22] – [24]. Videre er ekspresjon av p21 ble vist å bli redusert i KLM1-R sammenlignet med KLM1 celler (Fig. 1 B), som indikerer de forskjellige fenotyper av cellesyklus mellom dem. Vi undersøkte deretter autophagic aktivitet i KLM1 og KLM1-R celler, som ble fastsatt av uttrykk for LC3 [25]. Vi har vist at både LC3-I og II ble nedregulert i KLM1-R sammenlignet med KLM1 celler (Fig. 1 B). Dessuten, nedregulering av AMP-aktivert proteinkinase A1 (AMPKα1) og unc-51-lignende kinase 1 (Ulk1) ble vist, i motsetning til fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K CIII) eller kveil-kveil myosin-lignende BCL2-veksel protein ( Beclin-1), i KLM1-R sammenlignet med KLM1 celler (fig. S1 A og B), som indikerer at reduksjon av autophagic aktivitet i GEM-resistente KLM1-R-celler, kan være knyttet til nedregulering av AMPKα1 og /eller Ulk1 uttrykk. For å bestemme effekten av autophagy indusert av GEM, ble cellene behandlet med GEM i 5 timer (h) og deretter ble observert ved immunfluorescens-mikroskopi ved bruk av anti-LC3 antistoff farging. I denne eksperimentelle omgivelser, demonstrerte vi at LC3 II flekker ble øket etter at cellene ble utsatt for GEM (fig. 1 C). Disse data antydet at GEM induserer autophagy i PC-celler.
(A) Ekspresjon av Hsp27 ble undersøkt ved western blot og den relative intensiteten ble målt ved hjelp av student-
t
test (n = 3 ) (B) KLM1 og KLM1-R cellene ble lysert og løses ved hjelp av SDS-PAGE og analysert med spesifikke antistoffer. Aktin ble anvendt for å normalisere laste nivåer av protein. (C) De indikerte Cellene ble behandlet med 100 ug /ml av GEM i 5 timer og ekspresjon av LC3A /B og dannelse av LC3 positiv autophagosomes ble undersøkt ved hjelp av konfokal mikroskopi. LC3A /B: grønn og DAPI: blå. Pilene viser autophagosome. Scale bar, 20 mikrometer.
GEM spesielt nedregulerer mono-ADP ribosylert PARP-1 i et caspase-uavhengig måte
Vi testet effekten av GEM på PARP-en videre ekspresjon i PC-celler ved anvendelse av en western blot-analyse. KLM1 og KLM1-R viste en bemerkelsesverdig reduksjon av PARP-1 når cellene ble utsatt for 10 eller 100 ug /ml av GEM i 24 timer (fig. 2 A). Interessant nok ble det observert at de reduserte band av PARP-1 i de GEM-induserte paneler viste en liten økning i molekylvekt enn i de ubehandlede paneler. Derfor er denne foreslått at GEM spesifikt indusert i nedregulering av PARP-1 som var mono-ADP-ribosylert (fig. 2 A). Zhiyong Mao
et al.
Hadde definert den øvre band av PARP-1 som mono-ADP ribosylert skjemaet på lysinresidiet 521 som ble indusert av Sirtuin 6 (SIRT6) [26]. SIRT6 er et pattedyr-homolog av gjær SiR2 deacetylase og er involvert i cytokin-produksjon og migrering av PC [27]. Videre KLM1-R viste en høyere følsomhet for GEM-indusert nedregulering av PARP-1 enn KLM1 celler. Ti ug /ml av GEM var nok til å redusere mye av PARP-1-ekspresjon i KLM1-R sammenlignet med KLM1-celler (fig. 2 A). For å finne forklaringen, vi deretter sammenlignet uttrykk for SIRT6 mellom KLM1 og KLM1-R celler. Expectedly SIRT6 viste sterkere uttrykk (ca. 1,5 ganger) i KLM1-R enn KLM1 celler (Fig. 2 A). Dette indikerte at effektiviteten av GEM på nedregulering av mono-ADP ribosylert PARP-1 kan avhenge av uttrykk for SIRT6. Vi observerte også at GEM indusert overekspresjon av CtBP-samspill protein (CtIP) i både KLM1 og KLM1-R-celler (fig 2 A). Fordi caspase familien protease spalter død substratet PARP-1 til en spesifikk 85 kDa formen observert i løpet av apoptose [28], vi neste undersøkt hvorvidt caspase-3/7 ble relatert til PARP-1 nedregule heri. Vi viste at nivået av caspase-3/7-aktivitet, så vel som apoptose viste ingen forskjeller mellom KLM1 og KLM1-R-celler, selv når celler gjennomgikk GEM behandling i 24 timer, som vist ved western blotting (fig. 2 A) og caspase-3- /7 aktivitetsanalyse (fig. 2 B). Disse data antydet at GEM spesifikt nedregulert mono-ADP-ribosylert PARP-1 i et caspase-uavhengig måte.
(A) KLM1 og KLM1-R-celler ble behandlet ved GEM med de angitte konsentrasjoner i 24 timer. Cellelysater ble løst i SDS-PAGE og analysert med spesifikke antistoffer. Uttrykket av PARP-1 ble bekreftet flere ganger av en distinkt PARP-1 antistoff beskrevet i Materialer. En pil hode angitt mono-ADP-ribosylert form av PARP-1. Piler indikerte stillingen området kløyvet caspase-3. (B) De angitte celler ble behandlet som i (A) og deretter farget ved anvendelse av en 3/7 caspaser analysesett (A). Caspase 3/7 aktivitet ble testet og målt ved konfokalmikroskopi og bilde J. N.S., ikke-signifikant. Feil barer, SD.
GEM undertrykker uttrykk for mono-ADP ribosylert PARP-en via autofagi degradering pathway
Som GEM indusert autofagi og mono-ADP ribosylert PARP-1 nedregulering i et caspase-uavhengig måte, undersøkte vi om mono-ADP ribosylert PARP-1 kan være direkte degradert av autofagi. KLM1 og KLM1-R-celler ble farget med både anti-LC og anti-PARP-1-antistoff etter at cellene ble utsatt for GEM i 5 timer og deretter undersøkt ved immunofluorescent mikroskopi. GEM-indusert autophagosome formasjonen ble funnet å co-localizate med PARP-1 i begge KLM1 og KLM1-R-celler (Fig. 3 A), som angir forholdet mellom autofagi og PARP-1. For å teste GEM-indusert nedregulering av mono-ADP ribosylert PARP-1 gjennom autophagy, ble LC3B siRNA, Wortmannin (en inhibitor PI3K) og PMSF (en vacuolar proteaseinhibitor) anvendes til å inhibere autophagy av cellene i respons til GEM. GEM indusert PARP-1-mono-ADP-ribosylering og ned-regulering i KLM1, og nedregulering av PARP-1 ble reversert ved LC3B knockdown (figur 3 B). Denne reduksjonen av PARP-1 uttrykk av GEM i både KLM1 og KLM1-R celler ble også reddet av behandling med enten Wortmannin eller PMSF (Fig. 3 C). Sammen utgjør disse data viste at GEM-indusert nedregulering av mono-ADP ribosylert PARP-1 er mediert av autophagy degradering veien.
(A) KLM1 og KLM1-R-celler ble behandlet med 100 ug /mL av GEM i 5 timer. Behandlede celler ble farget med spesifikke antistoffer mot LC3A /B og PARP-1 og deretter påvist ved konfokal mikroskopi. LC3A /B: grønn, PARP-1: rød og DAPI: blå. Scale bar, 20 mikrometer. Pilene viser den gule flekker av co-lokaliseringer mellom autophagosome og PARP-1. (B) KLM1 celler ble eksponert for GEM i 24 timer etter LC3B knockdown. (C) KLM1 og KLM1-R-celler ble eksponert for GEM i 24 timer i stede eller fraværende av enten PMSF eller Wortmannin ved de angitte konsentrasjoner. Cellelysater ble oppløst ved SDS-PAGE og probet med spesifikke antistoffer mot til PARP-1. Pilen hode indikerer mono-ADP-ribosylert form av PARP-1. Uttrykket av PARP-1 ble bekreftet flere ganger av en distinkt PARP-1 antistoff beskrevet i Materialer.
Serum sult induserer aktivering og annen lokalisering av ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK) i KLM1 og KLM1- R-celler
for å bestemme effekten av serum sult på ERK-aktivitet og autophagy, ble cellene dyrket i friskt medium med eller uten FBS i 24 timer og undersøkt ved western blot og immunofluorescent mikroskopi. Vi demonstrerte at ERK ble aktivert ved serum sult i KLM1 og KLM1-R-celler, og at GEM har ingen effekt på ERK-aktiviteten (fig. 4 A). Neste vi undersøkte intracellulær lokalisering av fosfor-ERK ved immunfluorescens i KLM1 og KLM1-R celler. Interessant nok var en bemerkelsesverdig forskjell i intracellulær lokalisering av p-ERK vist mellom dem. Under serum sult, ble p-ERK delvis translokert til kjernen i KLM1 celler; Tvert imot, aktiverte ERK var til stede bare i cytoplasma i KLM1-R-celler (Fig. 4 B). Disse resultatene antydet at serum sult indusert aktivering av ERK i begge KLM1 og KLM1-R, men resulterte i en forskjell i intracellulær lokalisering mellom dem.
(A) KLM1 og KLM1-R-celler ble dyrket i medium med eller uten FBS eller eksponert for 10 ug /ml av GEM i 24 timer. Cellelysater ble oppløst ved SDS-PAGE og probet med spesifikke antistoffer mot p-ERK og ERK. (B) og (C) De indikerte Cellene ble farget med spesifikke antistoffer mot p-ERK, Hsp27 og LC3A /B etter at cellene ble dyrket i medium med eller uten FBS i 24 timer. DAPI: blå og p-ERK: rød i (B) og LC3A /B: grønn og Hsp27: rødt i (C). Scale bar, 20 mikrometer.
Serum sult undertrykker GEM-indusert PARP-en degradering ved å hemme autofagi via ERK signalveien
Vi neste undersøkte autophagic aktivitet etter serum deprivasjon i KLM1 og KLM1-R celler i kombinasjon med en ekstracellulær signalregulert (ERK) kinase (MEK) inhibitor, U0126, for å vurdere effekten av MEK /ERK sti på autofagi. Vi har vist at ekspresjonen av LC3 ble redusert med serum sult i løpet av et tidsforløp på 24 timer i KLM1 og KLM1-R-celler (Fig, og b. 5 A) og reddet av U0126 i KLM1 (Fig. 5 A), men mye mindre i KLM1-R (fig. 5 B). Aktiviteten av ERK fortsatt viste en økende trend i KLM1-R ved behandling med U0126 (Fig. 5 B), noe som indikerer en toleranse for U0126 i KLM1-R i forhold til KLM1 celler. Disse dataene indikerte at serum sult-indusert autofagi hemming ble formidlet av MEK /ERK signalveien. Under serum sult, U0126 hadde ingen virkning på ekspresjon av B-celle leukemi /lymfom 2 (BCL2) i KLM1 og KLM1-R-celler, og reduksjonen av p21 ble forsinket ved behandling med U0126 i KLM1 men ikke i KLM1-R-celler ( fig. S2 A og B), noe som tyder på at MEK-inhibitor hadde forskjellig effekt på cellesyklusprogresjon mellom KLM1 og KLM1-R-celler. Fordi MEK hemmer viste forskjellig effekt på modulering av autofagi mellom KLM1 og KLM1-R celler i henhold serum sult, undersøkte vi dens effekt på PARP-en degradering i respons til GEM. Faktisk ble det GEM-indusert PARP-1 degradering inhibert av serum sult i begge KLM1 og KLM1-R-celler i et caspase-uavhengig måte, og ble reversert bare i KLM1 celler ved U0126 (fig. 5 C og D). Videre er behandling ved U0126 alene hadde ingen innflytelse på PARP-1-ekspresjon. Denne informasjonen antydet at serum sult undertrykker autofagi og GEM-indusert PARP-en degradering gjennom aktivering av ERK signalveien, med KLM1 og KLM1-R celler som viser ulike følelser for MEK hemmer U0126.
(A) KLM1 og KLM1-R-celler ble eksponert for 10 ug /ml av GEM i nærvær eller fravær av 20 pM av U0126 for de angitte tidsforløp. Cellelysater ble oppløst ved SDS-PAGE og probet med spesifikke antistoffer mot p-ERK og LC3A /B. (B) og (C) KLM1 og KLM1-R-celler ble dyrket i medium med eller uten FBS og i mellomtiden utsettes for det ene eller begge GEM og U0126 ved den angitte konsentrasjon. Cellelysater ble oppløst ved SDS-PAGE og probet med spesifikke antistoffer. Pilen hode indikerer mono-ADP-ribosylert form av PARP-1. Piler indikerer posisjonen området spaltet caspase-3. Uttrykket av PARP-1 ble bekreftet flere ganger av en distinkt PARP-1 antistoff beskrevet i Materialer.
Hypoksi undertrykker autofagi og GEM-indusert PARP-en degradering
Hypoksi fører til celle syklus arrest via redusert p21 syntese [29]. Vi har bekreftet at ekspresjon av p21 ble nedregulert og Hsp27 ble oppregulert ved 1% O
2 hypoksi i 24 timer i KLM1 og KLM1-R-celler; imidlertid, hypoksi ikke hadde noen innflytelse på ekspresjon av fosfo-ERK og BCL2 (Fig. 6 A). Under hypoksiske tilstand, ble både AMPKα1 og Ulk1 ekspresjon nedregulert i KLM1 og KLM1-R-celler og ekspresjon av LC3 i KLM1 var ned til samme nivå som i ubehandlede KLM1-R-celler (Fig. 6 A), noe som indikerer at hypoksi indusert fenotypisk endring i KLM1 fører til en KLM1-R-lignende tilstand og hemming av autofagi. Dermed har vi testet om hypoksi hemmet GEM-indusert PARP-en degradering. Western blot-analyse viste at GEM-indusert PARP-1 degradering ble bemerkelsesverdig opphevet ved hypoksi i et caspase-uavhengig måte i både KLM1 og KLM1-R-celler (fig. 6 B). Disse resultatene indikerte at hypoksi undertrykker GEM-indusert PARP-1 degradering ved å redusere autophagic aktivitet.
(A) KLM1 og KLM1-R-celler ble dyrket under normale betingelser eller 1% O
2 hypoksi i 24 timer , og deretter cellelysater ble oppløst ved SDS-PAGE og probet med spesifikke antistoffer. (B) De indikerte-celler ble dyrket under normale betingelser eller 1% O
2 hypoksi sammen med 10 ug /ml av GEM i 24 timer. Cellelysater ble oppløst ved SDS-PAGE og probet med spesifikke antistoffer. En pil indikerer hode mono-ADP-ribosylert form av PARP-1. Piler indikerer posisjonen området spaltet caspase-3. Uttrykket av PARP-1 ble bekreftet flere ganger av en distinkt PARP-1 antistoff beskrevet i Materialer.
Diskusjoner
Autophagy kan være forhøyet ved GEM i behandlingen av PC celler [13 ]. PC-celler som viste å være mer følsomme overfor den cytotoksiske effekt av GEM når dette ble kombinert med cannabinoider via reaktive oksygenarter (ROS) -mediert autophagic celledød [30]. I denne studien demonstrerte vi at autophagic aktivitet ble redusert i GEM-resistente KLM1-R sammenlignet med -sensitive KLM1 celler. Derfor kan reaktivering av autofagi være en nyttig strategi for resensitising PC til GEM. Men lite er kjent om rollen til autofagi i DNA skade respons indusert av GEM. Det er viktig bevis for at autofagi er forbundet med behandlingen av dobbelttrådsbrudd (DSB) og celledød i respons til DNA-skade i gjær ved nedbrytning av acetylert rekombinasjon protein Sae2 (human CtIP) [31]. Inhibering /ablasjon av histon deacetylases (HDACs) induserer autofagi og acetylering av en rekke DNA-skade respons (DDR) proteiner, inkludert Sea2 og Exo1 [31], [32]. Her viser vi at GEM induserer en DNA-skader respons (observeres gjennom CtIP overekspresjon av western blot) og mono-ADP ribosylert PARP-en degradering fører til økt autofagi. Således autophagy involvert i DNA-skade reparasjon kan være gjennom kontroll av PARP-1 degradering i stedet for CtIP (gjær Sae2) i humant PC. Men om det mono-ADP-ribosylering av PARP-1 er nødvendig for autofagi nedbrytning og hvordan denne spesifikke nedbrytning er implementert som reaksjon på GEM bør klargjøres i videre studier.
ablasjon av PARP-1 ikke forstyrrer DSB sin reparasjon, men forsinkelser reaktivering av fastlåste replikering gafler [33]. Derfor kan GEM-indusert nedbrytning av PARP-1 bidrar til GEM-fastlåste replikering gafler. DSB respons faktorer ATM, Mre11, og Rad50 er nødvendig for celleoverlevelse etter replikasjonsgaffelen drøye svar på GEM-indusert DNA skade [34]. Restart av fastlåste replikering gafler og reparasjon av sammenraste replikering gafler krever RAD51 aktivitet og RAD51-mediert homolog rekombinasjon (HR) vei, henholdsvis [35]. Videre viser vi at CtIP er overuttrykt i respons til GEM i KLM1 og KLM1-R-celler (fig. 2 A). Tatt sammen tyder disse resultater på at DSB reparasjon er nødvendig for overlevelse av celler, så vel som PC-celler etter GEM-indusert DNA-skade. CtIP ble vist å være oppregulert i både KLM1 og KLM1-R indusert av GEM, men dens stabilitet virker sterkere i KLM1-R, spesielt over en konsentrasjon raseri av 10-100 mikrogram /ml GEM, som uttrykker et høyere nivå av SIRT6 sammenlignet med KLM1-celler (fig. 2 A). SIRT6 fremmer DNA stabilitet og aktivering og stabilisering av CtIP ved deacetylering [31], [35], noe som indikerer en mulig mekanisme for å redusere følsomheten av KLM1-R for å GEM forhold til KLM1 celler. Videre nyere studier tyder på at PARP-hemmere er spesielt dødelig for celler som mangler homolog rekombinasjon (HR) proteiner gjennom deregulering av feilutsatte ikke-homolog ende begynte [36]. På samme måte, derfor kombinasjonen av en slags HR-hemmer med GEM (som en PARP-1 suppressor) kan være en potensiell terapeutisk strategi for PC. Det er imidlertid en vesentlig begrensning fordi serum sult og hypoksi (som etterligner tumor microenvironments
in-vivo
) inhiberer GEM-indusert PARP-1 degradering ved å redusere autophagic aktivitet (fig. 5 og 6). Således bør foretrukket kandidat for kombinasjonsterapi med GEM ikke bare inhibere komponentene i DSB sin men også fremme autophagy, for eksempel en histon deacetylases inhibitor, nemlig, valproinsyre [37]. Videre studier er nødvendig for å teste om dette hemmer kan forbedre PC celledød i respons til GEM.
Den MEK hemmer U0126 viser ulike effekter på nivået av autofagi og PARP-en degradering i respons til GEM mellom KLM1 og KLM1 R-celler, noe som indikerer at muligens begrensninger finnes på terapeutisk strategi for målretting EGFR /Ras /ERK vei i PC. Det antas at de observerte forskjellene avhenge av en av tre muligheter:. 1) forskjellene i intracellulær lokalisering av aktivert ERK mellom KLM1 og KLM1-R-celler (Fig 4 B); 2) en ukjent tilbakesignalveien for ERK-aktivering som respons på MEK-inhibitor (figur 5 B) [37], [38].; 3) serum-indusert nedregulering av ULK1 i KLM1-R celler fører til autofagi ikke kontrollert av ERK (fig. S1 B).
I denne studien avdekker vi nye høydepunkter som GEM fungerer som en suppressor av PARP-en ved å fremme autophagy degradering sti og legge frem de tilhørende forslag om de ønskede egenskapene til mulige kandidater for kombinasjonsbehandling med GEM for PC.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1. product: (A) KLM1 og KLM1-R cellene ble lysert og løst i SDS-PAGE og analysert med spesifikke antistoffer. Aktin ble anvendt for å normalisere laste nivåer av protein. (B) KLM1 og KLM1-R-celler ble dyrket i medium med eller uten FBS eller eksponert for 10 ug /ml av GEM i 24 timer. Cellelysater ble løst i SDS-PAGE og analysert med spesifikke antistoffer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0109076.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
KLM1 (A) og KLM1-R (B) celler ble eksponert for 10 mg /ml av GEM i stede eller fraværende på 20 mikrometer av U0126 for de angitte tidsforløp. Cellelysater ble løst i SDS-PAGE og probet med spesifikke antistoffer mot p21 og til BCL2. De relative intensiteter av western blot ble målt og vist i denne figuren
doi:. 10,1371 /journal.pone.0109076.s002 plakater (TIF)
Takk
Vi takker Ikeda E. og Cui D. å la oss bruke en hypoksi inkubator.
