Abstract
Kreft vekst og spredning har blitt grundig studert i lang tid. Likevel er mange nye observasjoner på anatomi og histopatologi av kreft hendelser rapporteres fortsatt som dannelsen av en vaskulær-lignende nettverk inne aggressive svulster. I denne forskningen, nye typer mikro-kanaler, oppkalt primo-fartøy, ble funnet inne i bukhulen av NCI-H460 lungekreft murine xenograft modeller. Disse vaskulære trådene var stort sett fordelt på overflatene av forskjellige organer og ble ofte forbundet med peritoneal tumorknuter. Histologiske og Immunofluorescent undersøkelser viste at Primo-skipene hadde karakteristiske trekk som var utpreget forskjellig fra de av lignende utseende lymfekar. De hadde flere kanaler omgitt med løse collageneous matriser, noe som er i motsetning til enkelt-kanalstrukturen av andre vaskulære systemer. De stavformede kjerner er innrettet i langsgående retning langs kanalene var antatt å være de endoteliale cellene i Primo-fartøy, men LYVE-1, er en spesifikk markør for lymfekar, ble ikke uttrykt, noe som indikerer en klar forskjell fra lymfatisk endotel-celler. Tatt sammen disse funnene på og karakterisering av de nye tråd vaskulære strukturer i kreft modeller kan ha viktige implikasjoner for kreft prognose og for terapi
Citation. Yoo JS, Ayati MH, Kim HB, Zhang Wb, Soh KS ( 2010) Karakterisering av Primo-karsystemet i bukhulen av Lung Cancer Mouse modellen og dens Forskjeller fra lymfesystemet. PLoS ONE 5 (4): e9940. doi: 10,1371 /journal.pone.0009940
Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada
mottatt: 27 januar 2010; Godkjent: 09.03.2010; Publisert: 01.04.2010
Copyright: © 2010 Yoo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av en Systems Biology Infrastructure etableringstilskudd fra Gwangju Institute of Science and Technology. Jung Sun Yoo ble støttet av Seoul Science Fellowship. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Primo-fartøy (Bonghan kanaler) er nye typer mikro-kanaler og antas å være den mekanistiske understøttelsen av akupunktur meridianene i tradisjonell orientalsk medisin. På begynnelsen av 1960-tallet, Bong-Han Kim Nord-Korea hevdet å ha oppdaget disse kanaler, oppkalt etter ham, som dannet en ny sirkulasjonssystemet i hele dyrets kropp [1]. Han gjorde imidlertid ikke avsløre sin metode for å observere systemet i detalj, så inntil nylig, ble ingen eksakt bekreftelse av hans arbeid noensinne oppnådd til tross for mange forsøk i Kina, Japan og Russland, med unntak for en delvis gjengivelse av en japansk anatomist , Fujiwara [2].
Observasjoner av primo-skip i kaniner, rotter og mus ble nylig gjort ved å bruke moderne bio-avbildningsteknikker [3], som har ikke bare bekreftet Kims krav, men også gitt nye funn og opplysninger som
in vivo
farging av primo-fartøy med trypanblått [4] og eksistensen av Primo-fartøy inne fettvev [5] og på overflater av subkutane tumorvev [6]. Videre har noen bevis for en fluidledende funksjon av Primo-vaskulære system er gitt ved måling av strømningshastigheten [7] og fluidviskositeten [8].
I det foreliggende arbeid, observerte vi Primo -vessels på overflater av abdominal organer og rundt peritoneal tumor knuter i lunge kreft musemodeller. For å belyse fordelings mønstre av Primo-fartøy i forbindelse med kreft biologi, brukte vi to sett med cancermodeller, dvs. subkutant (sc) xenograft modell og den intraperitoneale (IP) eksperimentell metastase modell ved hjelp av administrering av NCI-H460 human lunge kreftceller [9], [10]. Trypanblått flekker under
in vivo Hotell og
in situ
veibane [4], [11] ble brukt for å avdekke omfanget av Primo-skip i tumorbærende mus, som var mulig på grunn til fargestoffet blir fortrinnsvis absorbert i den løse strukturen i Primo-fartøy i forhold til andre mage vev.
Vi utførte også histologiske og immunofluorescent undersøkelser for å skille primo-fartøy fra lignende utseende lymfekar. Skillet mellom primo-fartøy og lymfekar har vært en forestående spørsmålet på grunn av likheter i disse morfologiske egenskaper. Selv om dette problemet er delvis løst ved hjelp av konvensjonelle histologi og elektronmikroskopi [12], [13], et mer overbevisende undersøkelse, så som immunhistokjemi med en pålitelig molekylær markør for lymfatisk endotelceller, LYVE-1 [14], [15], [16], ikke hadde vært forsøkt før denne forskningen. I hvilke utførte vi farging med LYVE-1, i tillegg til å bruke forskjellige vanlige histologiske undersøkelser, for å vise skillet mellom Primo-fartøy og lymfekar.
Resultater
Intraoperativ Visualisering av Primo-fartøy i fm Xenografter
For å visualisere primo-skip i subkutant muse xenografter, utførte vi forsiktig abdominal kirurgi to til åtte uker etter inokulering av 1 x 10
7 NCI-H460-humane lungekreftceller. Figur 1 viser anatomiske bilder av primo-karsystemet, farget med trypan blå (blå farge), inne i underlivet av subkutant tumor-bærende mus.
In situ
trypanblått sprer henhold levende forhold avdekket semi primo-fartøy (piler) i fettvevet (figur 1A . 1B) eller rundt gonadale organer (Fig. 1C 1D) eller på overflater av forskjellige organer, inkludert tynntarmen, nyrene og leveren (figurene 1E, 1F tykktarm, SI; tynntarm, O; oviduct, L; leveren, K; nyre, AW; bukveggen.
Intraoperativ Visualisering av Primo-skip i i.p. Xenografter
En lignende intraoperativ avbildning ble utført med i.p. muse xenografter. Figur 2 viser Primo-vaskulære system festet til intraperitoneale tumorknuter. Primo-fartøy (piler), farget med trypanblått, ble hovedsakelig plassert rundt tumornoduler (pilspisser) som hadde dannet på 4 uker etter i.p. injeksjon med 1 × 10
7 NCI-H460-celler. Spesielt noen primo-skipene viste fordelingsmønstre enten kommer inni eller rundt tumornoduler og vil trolig være nye vekster av primo-fartøy drevet av behovene til svulsten.
Primo-fartøy (piler) farget med trypan blå hovedsakelig plassert rundt tumornoduler (pilspisser) som var synlig etter 4 uker med ip injeksjon med NCI-H460-celler. Spesielt noen primo-skipene viste fordelingsmønstre enten kommer innenfor eller rundt tumornoduler. SI; tynntarm, AW; bukveggen
Histologisk Karakterisering av Primo-fartøy med H . E og MT Farging
En ytterligere karakterisering for å finne en særegen morfologi for primo-skipene ble utført ved hjelp av en histopatholgic undersøkelse. Figur 3 viser typiske primo-noder og primo-fartøy hentet fra lungekreft xenografter. Hematoxylin og eosin (H E) og Masson s Trichrome (MT) farging viste multiple lumen (piler) med flytelegemer (pilspisser) i alle prøver, og denne multilumen struktur er forskjellig fra ett lumen struktur av lymfe eller blodkar . Videre MT flekker avdekket en primo-karsystemet bestående av løse kollagenfibre (blå farge) som omgir lumen. Dette resultatet viser at primo-fartøy ikke kan forveksles med koagulert fibrins eller andre gjenstander
(A) Vist er en representant hematoxylin og eosin (H E). -stained Primo-node tverrsnitt (øverst) og en Masson er Trichrome (MT) -stained tilstøtende-seksjonen (nederst). Høyre tallene er forstørrede bilder av venstre tall. (B) Avbildet er primo-fartøyet tverrsnitt som ble farget med H E (til venstre) og MT (til høyre). (C) H E farging av en skrå del som inneholder både en primo-node (en dobbel pil) og en primo-fartøy (stiplet pil). Et bilde av primo-noden ble forstørret i figuren til høyre. Det finnes flere lumen (piler) med flytelegemer (pilspisser) i alle prøvene som er forskjellig fra et enkelt lumen struktur av lymfe eller blodkar. Videre MT flekker avslørte primo-kar-systemet består av løse kollagenfibre (blå farge) rundt lumen.
farging med en Lymphatic Marker av lymfekjertlene, LYVE-1
Å overbevis diskriminere Primo-fartøy fra lymfekar, neste gjennomførte vi immunhistokjemisk undersøkelse med LYVE-1. Figur 4 viser resultatene av immunfluorescens farging av Primo-fartøyet i en lungekreft xenograft. Primo-fartøy og lymfatiske fartøyet tverrsnitt ble behandlet med anti-LYVE1 polyklonale antistoff (grønn) eller isotypekontrollantistoff polyklonale antistoff og ble observert med fluorescens konfokalmikroskopi. Fluorescens bilder av DAPI (blå) -exhibiting kjerner og DIC bilder ble også tatt. De lymfatiske endotelceller med sterk positiv farging er klart lokalisert ved den indre grensen av det lymfatiske kar (fig. 4A), mens ingen LYVE-1-positive celler som er sett i Primo-fartøyet (fig. 4C). Isotypekontrollantistoff behandling viste ingen fluorescerende signal, som beviser at fargingsresultater å være pålitelig. En del av den samme prøven som var behandlet med bare DAPI uten seksjonering, og hadde vært montert i lengderetningen avdekket innrettede stavformede kjerner som omgir hulrommene, hvilke kjerner ble antatt å være endotelceller i Primo-fartøyet (fig. 4E).
Primo-fartøyet tverrsnitt ble behandlet med anti-LYVE1 polyklonale antistoff (grønn) eller iso-type kontroll polyklonale antistoff (C, D) og observert med konfokalmikroskopi. Lymfatiske fartøyet tverrsnitt ble farget med de samme antistoffer og observert som positive kontroller (A, B). Fluorescens bilder av DAPI (blå) stiller ut kjerner og DIC bilder ble også tatt. Lymfatiske endotelceller med sterk positiv farging klart lokalisert ved den indre grensen av lymfatiske kar, mens ingen LYVE-1-positive celler ble observert i Primo-fartøyet. En del av den samme prøven som ble behandlet med kun DAPI uten seksjonering og montert avslørt langsstilte stang-form kjerner rundt lumen antas å være endotelceller primo-fartøy (E).
Diskusjoner
Denne studien er den første anatomisk demonstrasjon og immunfluorescens undersøkelse av primo-karsystemet, en ny væske-ledende vaskulære nettverket, i lunge kreft musemodeller. Stort sett fordelte Primo-fartøy ble observert på overflaten av abdominale organer i forbindelse med tumorvekst. Primo-fartøy kan bli diskriminert fra lignende utseende lymfekar 1) ved sin høye
in vivo
slektskap med farging med trypanblått, 2) av sine histologiske funksjoner, det vil si, multi-lumen struktur med løse collageneous matriser, og 3) ved sin immunokjemiske karakteristikk, dvs. negativ ekspresjon av LYVE-1.
Foretrukket farging av Primo-fartøy ved trypan blå under
in vivo
betingelser som tidligere er rapportert [4]. I denne artikkelen har vi brukt og fjernet 0,1% trypanblått under luft, hindrer generalisert spredt over hele bukhulen, for å avsløre hele fordelingen av Primo-fartøy med høy kontrast til bakgrunnen vev. Denne høye infiltrasjon og farging av trypanblått om Primo-fartøy kan forklares ved de Primo-fartøy som har mer løs vev matrise med noen åpninger og porer ved den ytre grense enn annet vev. Trypanblått er et velkjent vital flekk og har blitt brukt til å visualisere hornhinneendotelet i fremre segment kirurgi [17] eller den fremre kapsel i kataraktkirurgi [18] eller epiretinal membraner i proliferativ vitreoretinopati kirurgi [11]. Dette arbeidet bekreftet effekten av å bruke vital farging med trypanblått for å visualisere fordelingen av abdominal Primo-fartøy.
Vi fant velutviklede mage nettverk av Primo-fartøy i tumorbærende mus for første gang. Spesielt har vi ofte observert Primo-fartøy som er koblet til tumorknuter, med veksten av denne nye arkitekturen sannsynligvis drevet av behovene til tumor, dvs. å sørge for næringstilførsel til tumoren og for effektiv transport av frittliggende tumorceller for metastasering. Selv om ytterligere kvantitative studier på tumorbelastning og morfometri av Primo-fartøy skal adresseres, kan disse foreløpige anatomiske funnene gir viktige implikasjoner for kreft prognose og for terapi
På grunn av den tilsynelatende morfologisk likhet -. Gjennomsiktig tynn struktur – mellom lymfeårer og primo-fartøy, skille mellom dem er kritisk. Et skille basert på brutto anatomiske trekk [19] og histologiske detaljer [12] i kaniner ble rapportert før. Primo-fartøy som flyter inne i strømmen av lymfekar fra rotter og kaniner åpenbart vist at de er to forskjellige systemer [20], [21], [22]. I denne forskningen, dyktig vi ikke bare en vanlig histologisk men også immunfluorescens undersøkelse av Primo-fartøy hentet fra tumor-bærende mus for å bekrefte funnene på tidligere rapporter. H E og MT farging avdekket flere lumen omgitt med løse kollagenfibre i Primo-fartøy, og disse multi-lumen strukturer var forskjellig fra den single-lumen struktur av lymfe eller blodkar. Dette resultatet viser at primo-fartøy ikke kan forveksles med lymfekar, koagulerte fibrins eller andre gjenstander. Videre er en spesifikk markør for lymfekar, LYVE-1, ble ikke uttrykt i det hele tatt i Primo-fartøy gir en klar forskjell mellom Primo-fartøy og lymfekar. Stavformede kjerner er innrettet i lengderetningen rundt hulrommene over Primo-fartøy, og selv om disse kjerner ble antatt å tilhøre til endotelceller, var de ikke lymfatiske endotelceller.
I det foreliggende arbeidet vi fokusert på forskjellen mellom Primo-fartøy og lymfekar på grunn av sin likhet i tilsynelatende ser. Vi gjorde ikke understreke det særegne ved primo-fartøy fra blodkar fordi disse to er åpenbart merkbar i den anatomiske eksamen. Primo-fartøy i bukhulen er multi-lumen struktur og ikke holder seg til den peritonea av indre organer (fig. 1 og 2). I kontrast, blodårer er ett lumen struktur og ligge i peritonea. Primo-fartøy er semi-transparent, melkehvit farget og farget godt med trypanblått under
in vivo
forhold mens blodårene er rødfarget og knapt farget med trypanblått. Siden primo-karsystemet er et helt annet system fra hjerte-karsystemet sin formasjon bør være en særegen prosess fra angiogenese. Det vil være verdt å teste dette ved hjelp av immunofluorescens med anti-CD31-antistoff som er mye brukt for å avsløre endotelceller i blodkar opprinnelse.
Primo-fartøyer er ofte plassert langs det ytre av blodkar, slik at det kan bli en sterk korrelasjon mellom tettheten av mikrobeholdere og Primo-fartøy. På det nåværende tidspunkt kan vi bare nevne at det er en indikasjon på at mikro fartøy tetthet og primo-fartøy tetthet har en positiv sammenheng i forbindelse med tumorvekst og metastasering. Vår forskning er ikke den første til å rapportere nye rør som er utpreget forskjellig fra blod eller lymfeårer relatert til kreft hendelser. Hendrix et al. funnet ekstracellulære matrix-rike nettverk inne aggressiv svulstvev i 1999 [23]. De dannet ved en reversering av tumorceller til en udifferensiert fenotype og rekapitulert embryonale vaskulogenese, den såkalte vaskulogen Ligningen [15]. På lignende måte Primo-fartøy kan være dannet av embryoniske vaskulogenese-lignende prosesser. Siden primo-skipene ble utviklet på konseptet av subcutaneous vev i tumorbærende mus [6], er det en viktig sak for å avklare mulig sammenheng eller relasjon av vaskulær-lignende nettverk og primo-fartøy mellom innsiden og utsiden svulst vev.
i konklusjonen, har vi demonstrert den omfattende nærvær av Primo-fartøy i tumorbærende mus og fremtredende forskjellen mellom histologiske og immunkjemiske funksjonene i Primo-fartøy og de av lymfeårer. Disse funn og analyser, som indikerer en ny funksjon av primo-karsystemet, forskjellig fra lymfekjertlene, i forbindelse med kreft hendelser, kan gi grunnlag for en ny terapi for å kontrollere kreft vekst og spredning.
materialer og metoder
Cell Culture
NCI-H460-menneskelige lungekreft celler ble hentet fra den koreanske cellelinje Bank (Seoul, Korea). Cellene ble dyrket i et RPMI-1640 medium (Gibco-Invitrogen, USA) supplementert med 1% penicillin-streptomcyin og 10% føtalt bovint serum (FBS) i 95% luft og 5% CO
2 ved 37 ° C.
Animal Cancer Modell
Kvinne hårløse mus (BALB-c-nu /nu, i alderen 5-7 uker gammel, veier 15-20 g, n = 20; Japan SLC, Inc., Hamamatsu, Japan) ble anvendt i henhold til institusjonens retningslinjer i henhold til godkjente protokoller. To sett med cancermodeller ble anvendt. Den første modellen er den standard subkutan (s.c.) xenograft musemodell [9]. Ti mus ble inokulert s.c. i fotens rygg med 1 x 10
7 NCI-H460 humane lungekreftceller (i et 1-ml RPMI-1640 medium) for tumordannelse under huden. Den andre tumormodell er den i.p. eksperimentell metastase modell. NCI-H460-humane lungekreftceller ble injisert i.p. som en cellesuspensjon inn i nakne mus (1 x 10
7-celler per dyr, n = 10) som tidligere beskrevet [9], [10]. All forskning som involverer dyr har blitt godkjent av Instisute av Forsøksdyr Resources av Seoul National University.
Intraoperative Imaging
For å identifisere primo-karsystemet inne bukhulen av subkutant og i.p. lungekreft modeller, utførte vi mus kirurgi to til åtte uker etter inokulering av NCI-H460-celler under generell anethesis med i.p. injeksjon av zoletil /Rompun. Først ble midtlinjen av mus magen radert og intra-abdominale organer ble utsatt nøye. Deretter ble en 0,1% trypanblått-oppløsning, som på forhånd filtrert gjennom 0,22 um pore størrelse filterpapir, ble påført dråpevis på de eksponerte organer [4]. Etter skylling bort fargestoff med varm saltløsning, ble Primo-noder og Primo-fartøy identifisert ved direkte visualisering av det kirurgiske anatomi med et kirurgisk mikroskop (SZX12, Olympus, Japan). Til slutt ble bildene tatt med et CCD-kamera (DP 70, Olympus, Japan).
Histologiske Analyser
Etter intraoperativ avbildning av primo-karsystemet,
ex vivo
undersøkelse ble utført med histologisk farging av prøvene. For dette formål ble Primo-noder og fartøy fiksert i 10% nøytral bufret formalin (NBF) i 12 timer ved 4 ° C, vasket i fosfatbufret saltvann (PBS), dehydratisert i en gradert etanolserie, klaret i xylen og innleiret i Paraplast (Sigma, USA). Paraplast tverrgående seksjoner, 6 pm i tykkelse, blir kuttet med en mikrotom ble neste farget med hematoxylin og eosin (H E) for generell morfologisk observasjon, og med Masson er Trichrome (MT) for å visualisere kollagenfibre. Deretter ble seksjonene montert med Neomount, og undersøkt med et lysmikroskop (BX51, Olympus, Japan). Bilder ble kjøpt med en CCD-kamera (Axiophot, Zeiss, Tyskland).
Immunohistochemistry
For å karakter primo-fartøy mot lymfekar, utførte vi immunhistokjemisk undersøkelse med IgG anti-LYVE-1 polyklonale antistoff (pAb), en spesifikk markør for lymfekar. Primo-fartøyer og lymfekar på overflaten av abdominal organ i tumorbærende mus ble høstet, forankret i oktober, og snap-frosset i flytende nitrogen. Tverrsnitt (10 um) ble løst i iskald aceton i 5 minutter, vasket i PBS og blokkert med CAS-blokk-oppløsning (Invitrogen, USA) i 2 timer ved 37 ° C. Glassene ble inkubert med kanin-anti-mus LYVE-1 (2,5 ug /ml, Abcam, UK) over natten ved 4 ° C, fulgt av vaskinger og påvisning med geit-antikanin IgG konjugert med Alexa Fluor 488 (1:500, Molecular Probes , USA). Lysbilder ble behandlet med DAPI for atom counterstain, coverslipped i antifade reagent (Molecular Probes, USA). En del av den samme prøve ble behandlet med bare DAPI og langs helhet montert i antifade reagens. Prøvene ble visualisert ved konfokalmikroskopi (LSM500, Zeiss, Tyskland).
Takk
Vi takker Byung-Cheon Lee og Saeyoung Ahn for nyttige diskusjoner.
